Methodenartikel

Untersuchung der Aktivität von Neuropeptiden und anderen Regulatoren des Ausscheidungssystems bei der erwachsenen Mücke

DOI:

10.3791/61849

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24. August 2021

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1Department of Biology, York University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt Methoden hinter dem Ramsay-Assay, ionenselektiven Mikroelektroden, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) und In-vitro-Kontraktionsassays, die zur Untersuchung des adulten Moskito-Ausscheidungssystems, bestehend aus den Malpigh-Tubuli und dem Hinterdarm, angewendet werden, um gemeinsam Ionen- und Flüssigkeitssekretionsraten, kontraktile Aktivität und transepithelialen Ionentransport zu messen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studien zur Insektenphysiologie, insbesondere bei jenen Arten, die Vektoren von Krankheitserregern beim Menschen und anderen Wirbeltieren sind, bilden die Grundlage für die Entwicklung neuartiger Strategien zur Schädlingsbekämpfung. Hier wird eine Reihe von Methoden beschrieben, die routinemäßig verwendet werden, um die funktionelle Rolle von Neuropeptiden und anderen neuronalen Faktoren (dh biogenen Aminen) auf das Ausscheidungssystem der Mücke, Aedes aegypti, zu bestimmen. Die Malpighian Tubuli (MTs), die für die primäre Urinbildung verantwortlich sind, können stundenlang weiterarbeiten, wenn sie von der Mücke entfernt werden, was Flüssigkeitssekretionsmessungen nach Hormonbehandlungen ermöglicht. Als solches ist der Ramsay-Assay eine nützliche Technik zur Messung der Sekretionsraten von isolierten MTs. Ionenselektive Mikroelektroden (ISME) können sequentiell verwendet werden, um Ionenkonzentrationen (d.h. Na+ und K+) in der sezernierten Flüssigkeit zu messen. Dieser Assay ermöglicht die Messung mehrerer MTs zu einem bestimmten Zeitpunkt und bestimmt die Wirkungen verschiedener Hormone und Medikamente. Die Scanning Ion-selective Electrode Technique verwendet ISME, um die Spannung zu messen, die für die Ionenaktivität in der ungestörten Schicht neben der Oberfläche von ionentransportierenden Organen repräsentativ ist, um den transepithelialen Transport von Ionen in nahezu Echtzeit zu bestimmen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle von Hormonen und anderen Regulatoren bei der Ionenabsorption oder -sekretion über Epithelien zu verstehen. Hindgut-Kontraktionsassays sind auch ein nützliches Werkzeug, um myoaktive Neuropeptide zu charakterisieren, die die Fähigkeit dieses Organs, überschüssige Flüssigkeit und Abfälle zu entfernen, verbessern oder reduzieren können. Insgesamt geben diese Methoden Aufschluss darüber, wie das Ausscheidungssystem bei erwachsenen Moskitos reguliert wird. Dies ist wichtig, da die funktionelle Koordination der Ausscheidungsorgane entscheidend ist, um Herausforderungen wie Austrocknungsstress nach der Eklosion und vor der Suche nach einem geeigneten Wirbeltierwirt zur Gewinnung eines Blutmehls zu bewältigen.

Einleitung

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Die Aufrechterhaltung des Salz- und Wasserspiegels bei Insekten ermöglicht es ihnen, in vielen ökologischen und ökologischen Nischen erfolgreich zu sein und dabei eine Vielzahl von Fütterungsstrategien zu nutzen1. Die meisten Insekten haben Mechanismen entwickelt, um die Zusammensetzung ihrer Hämolymphe in engen Grenzen zu regulieren, um den verschiedenen Herausforderungen standzuhalten, die mit ihrer jeweiligen Umgebung verbunden sind2. Terrestrische Insekten stehen oft vor der Herausforderung, Wasser zu sparen, und das Ausscheidungssystem wird einer Antidiurese unterzogen, um den Verlust von Wasser und einigen essentiellen Salzen zu verhindern und somit eine Austrocknung zu vermeiden. Im Gegensatz dazu tritt Diurese auf, wenn sich das Insekt ernährt und mit überschüssigem Wasser und möglicherweise Salzen herausgefordert wird3,4. Durch ihr spezialisiertes und hochaktives Ausscheidungssystem haben Insekten Regulationsmechanismen entwickelt, die ihren osmoregulatorischen Herausforderungen entgegenwirken. Bei erwachsenen Aedes aegypti-Mücken besteht das Ausscheidungssystem aus den Malpigh-Tubuli (MTs) und dem Hinterdarm, von denen letzteres aus dem vorderen Ileum und dem hinteren Rektum besteht5. MTs sind für die Erzeugung von Primärurin verantwortlich, der in der Regel reich an NaCl und / oder KCl ist. Der Primärurin wird dann durch sekretorische und reabsorbtive Prozesse modifiziert, während er stromabwärts des Tubulus wandert und in den Hinterdarm gelangt5. Die endgültigen Ausscheidungen können je nach Fütterungs-/Umweltbedingungen hyper- oder hypoosmomotisch zur Hämolymphe sein und sind mit toxischen und stickstoffhaltigen Abfällen angereichert2.

MTs sind ideal für die Untersuchung vieler Merkmale des Transports von Epithelflüssigkeit und gelösten Stoffen, da sie eine Vielzahl von Transport- und Ausscheidungsfunktionen ausführen2,6. Durch hormonelle Regulation2 funktionieren MTs, indem sie Ionen und andere gelöste Stoffe aus dem Blut in das Tubuluslumen7 absondern, wodurch ein osmotischer Gradient entsteht, der es ermöglicht, Wasser durch Aquaporine8,9 zu transportieren, die zusammen den Primärurin erzeugen, bevor sie sich in Richtung des reabsorptiven Hinterdarms bewegen2. So kann man durch das Sammeln der sezernierten Flüssigkeit aus isolierten MTs den transepithelialen Transport von Flüssigkeit und Ionen kontinuierlich überwachen. Die Messung der Sekretrate und der Urinzusammensetzung liefert Einblicke in die Mechanismen, die für den transepithelialen Ionen- und Flüssigkeitstransport verantwortlich sind. Eine beliebte Methode zur Untersuchung der Flüssigkeitssekretionsraten ist der Ramsay-Assay, der erstmals 195310 von Ramsay eingeführt wurde. Bei dieser Methode wird das distale (geschlossene) Ende des Tubulus mit einem Hormon (oder einer anderen Testverbindung / Droge) behandelt, während das proximale (offene) Ende um einen Stift in wassergesättigtem Paraffinöl gewickelt wird, das den Primärurin absondert und sich als Tröpfchen an der Spitze des Stiftes ansammelt. Isolierte MTs sind in der Lage, über lange Zeiträume (bis zu 24 h) unter optimierten In-vitro-Bedingungen zu überleben und zu funktionieren, was sie zu geeigneten und effizienten Modellen für die Flüssigkeitssekretionsmessung macht. Insekten haben offene Kreislaufsysteme, so dass die MTs leicht seziert und entfernt werden können, da sie normalerweise frei in der Hämolymphe schweben6. Mit Ausnahme von Blattläusen, denen MTs11 fehlen, kann die Anzahl der MTs in einer bestimmten Insektenart erheblich von vier bis hundert (fünf bei Aedes-Mücken) variieren, was mehrere Messungen von einem Insekt ermöglicht.

Die MTs in Aedes-Mücken bestehen wie andere endopterygote Insekten aus zwei Zelltypen, die ein einfaches Epithel bilden2,12; große Hauptzellen, die den aktiven Transport von Kationen (d.h. Na+ und K+) in das Lumen erleichtern, und dünne Sternzellen, die bei der transepithelialen Cl-Sekretion helfen13. Die MTs sind nicht innerviert2, sondern werden durch mehrere Hormone reguliert, darunter sowohl harntreibende als auch antidiuretische Faktoren, was die Kontrolle des Ionentransports (hauptsächlich Na +, K + und Cl-) und osmotisch verpflichtetem Wasser ermöglicht2. Zahlreiche Studien haben die hormonelle Regulation von Aedes MTs untersucht, um die Rolle endokriner Faktoren auf den transepithelialen Transport zu verstehen14,15,16,17,18. Wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt, zeigen die hierin enthaltenen Protokolle die Wirkungen verschiedener hormoneller Faktoren auf isolierte MTs von erwachsenen weiblichen A. aegypti-Mücken, einschließlich der diuretischen und antidiuretischen Kontrolle (Abbildung 1). Der Ramsay-Assay wird verwendet, um zu zeigen, wie ein antidiuretisches Hormon, AedaeCAPA-1, die Flüssigkeitssekretion von MTs hemmt, die durch das diuretische Hormon 31 (DH31) stimuliert werden (Abbildung 1).

Die geringere Größe von Insekten erforderte die Entwicklung von Mikromethoden zur Messung der Ionenaktivität und -konzentrationen in flüssigkeitsproben oder in der Nähe der Oberfläche isolierter Gewebe wie MTs und Darm. Es wurden unterschiedliche Methoden eingesetzt, darunter die Verwendung von Radioisotopen von Ionen19, die das Sammeln der sezernierten Flüssigkeitstropfen zur Messung der Ionenkonzentrationen erfordert20. Stimulierte Aedes-Tubuli in vitro sezernieren typischerweise ~ 0,5 nL / min21, so dass die Handhabung solch kleiner Volumina eine Herausforderung darstellen und möglicherweise Fehler bei der Übertragung verursachen kann. Infolgedessen wurden ionenselektive Mikroelektroden (ISMEs) ausgiebig verwendet, um Ionenkonzentrationen in sezernierten Tröpfchen von MTs in vitro zu messen. Bei diesem Verfahren werden eine Referenzelektrode und ISME, gefüllt mit der entsprechenden Verfülllösung und dem Ionophor, in das sezernierte Urintröpfchen positioniert, um die Ionenkonzentrationen zu bestimmen22. Adaptiert von Donini und Kollegen23, verwendet dieses aktuelle Protokoll ein Na+-selektives Ionophor, um die Ionenaktivität in sezernierten Tröpfchen aus stimulierten MTs in erwachsenen Aedes-Mücken zu messen. Da ionenselektive Mikroelektroden die Ionenaktivität messen, können diese Daten als Ionenkonzentrationen ausgedrückt werden, wobei davon ausgegangen wird, dass die Kalibrierlösungen und experimentellen Proben den gleichen Ionenaktivitätskoeffizienten aufweisen21 (Abbildung 1B,C).

Die Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) nutzt auch ISMEs, um Ionenkonzentrationsgradienten in der ungestörten Schicht zu messen, die an Organe, Gewebe oder Zellen angrenzt, die Ionen transportieren. Die ISMEs messen Spannungsgradienten, die dann verwendet werden können, um die Ionenkonzentrationsgradienten sowie die Richtung und Größe des Ionenflusses über das Organ, das Gewebe oder die Zelle zu berechnen20. Bei dieser Technik wird die ISME auf einem dreiachsigen Manipulator montiert, der von computergesteuerten Mikroschrittmotoren gesteuert wird, so dass seine 3D-Position bis auf Mikrometerebene gesteuert wird20. Spannungen werden an zwei Punkten innerhalb der ungetragenen Schicht mit einem Sampling-Protokoll gemessen, das in Computersoftware programmiert und gesteuert wird. Die beiden Punkte sind typischerweise durch einen Abstand von 20-100 μm getrennt, wobei ein Punkt innerhalb von 5-10 μm von der Oberfläche des Organs, Gewebes oder der Zelle und der zweite Punkt weitere 20-100 μm entfernt ist. Die Differenz in der Größe der Spannungen zwischen den beiden Punkten wird berechnet, um einen Spannungsgradienten24,25,26 zu erhalten, der dann verwendet wird, um den Konzentrationsgradienten und anschließend den Nettofluss unter Verwendung des Fickschen Gesetzes24,27 zu berechnen. Diese Methode ist nützlich, um den Transport spezifischer Ionen über verschiedene Regionen des Insektendarms und MTs oder zu bestimmten Zeitpunkten nach einer Blutmehl- oder Behandlungsexposition zu beurteilen. Mit dem SIET kann beispielsweise verstanden werden, wie absorptions- und sekretorische Prozesse im Ausscheidungssystem der Mücken durch Hormone reguliert werden28 sowie unterschiedliche Fressverhalten und Aufzuchtbedingungen25. Frühere Arbeiten unter Verwendung des SIET zeigten Stellen, die am Ionentransport entlang der Analpapillen und des Rektums von Larven und erwachsenen Moskitos beteiligt sind24,28. Das aktuelle Protokoll, das zuvor von Paluzzi und Kollegen26 beschrieben wurde, misst den Na+-Fluss über die rektalen Padepithelien des erwachsenen weiblichen Rektums (Abbildung 2).

Das letzte Segment des Moskito-Ausscheidungssystems erfordert eine koordinierte Muskelbewegung, um Nahrung zu mischen und Abfälle abzusondern26. Nicht resorbierbare Verdauungsprodukte aus dem Mitteldarm werden zusammen mit dem von den MTs abgesonderten Primärurin durch das Pylorusventil geleitet und an den Hinterdarm abgegeben2. Spontane Hinterdarmkontraktionen beginnen an der Pylorusklappe und treten in peristaltischen Wellen auf, die durch die koordinierte Kontraktion von kreisförmigen und longitudinalen Muskeln, die die Basaloberfläche von Epithelzellen umgeben, über das Ileum geleitet werden26. Schließlich helfen die Muskeln im Rektum, Abfall durch den Analkanal zu treiben und zu beseitigen. Obwohl die Hinterdarmmotilität von Insekten myogen ist und extrazelluläres Ca2+ benötigt, um spontane Kontraktionen zu erzeugen, können diese Prozesse auch neuronal reguliert werden26,29,30. Diese exogene Regulation durch das Nervensystem ist nach der Fütterung wichtig, da das Tier Abfälle aus dem Darm vertreiben und das Hämolymphengleichgewicht wiederherstellen muss31. Infolgedessen ist die Durchführung von In-vitro-Bioassays zur Identifizierung myostimulatorischer oder myoinhibitorischer Neuropeptide nützlich, um zu beurteilen, wie Neurochemikalien die Hinterdarmmotilität beeinflussen. Das aktuelle Protokoll, das von Lajevardi und Paluzzi28 durchgeführt wird, verwendet Videoaufnahmen, um die Ileummotilität als Reaktion auf Neuropeptide zu untersuchen (Abbildung 3). In ähnlicher Weise kann ein Kraftaufnehmer oder Impedanzwandler auch verwendet werden, um Kontraktionsspuren durch eine Datenerfassungssoftware zu beobachten32,33. Die Verwendung von Videotechnologie ermöglicht es uns jedoch, das Organ visuell zu beurteilen und anhand einer Teilmenge von Parametern weiter zu analysieren, um die Rolle von Hormonen bei der Hinterdarmmotilität zu identifizieren.

Die Verwendung dieser Techniken kann helfen, Faktoren zu charakterisieren, die den Flüssigkeits- und Ionentransport entlang des Ausscheidungssystems zusammen mit der Hinterdarmmotilität regulieren und koordinieren. Wichtig ist, dass eine funktionelle Verbindung zwischen der harntreibenden Reaktion der MTs und der Hinterdarmmotilität unterstützt wird, da diuretische Hormone wie DH31 und 5HT, die durch ihre Fähigkeit, die Flüssigkeitssekretion durch die MTs zu stimulieren, gekennzeichnet sind, auch myotrope Wirkungen entlang des Mückenrückdarms zeigen21,34,35 . Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung einer strengen Koordination zwischen den MTs und dem Hinterdarm bei Ereignissen wie der postprandialen Diurese bei Insekten, die eine schnelle Abfallbeseitigung erfordern.

Hierin werden der detaillierte Ansatz hinter der Ramsay-Assay-Technik zur Messung der Flüssigkeitssekretionsrate in der Mücke, A. aegypti, und die Verwendung von ionenselektiven Mikroelektroden zur Bestimmung der Na+ -Konzentrationen innerhalb der sezernierten Flüssigkeit der MTs beschrieben, die in Kombination die Bestimmung transepithelialer Ionentransportraten ermöglichen. Zusätzlich werden die Scanning Ion-selective Electrode Technique und die Hindgut contraction assays beschrieben, um den Ionenfluss bzw. die Motilität zu messen, was zur Aufklärung der hormonellen Regulation des Hinterdarms beiträgt (Abbildung 4).

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Protokoll

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1. Herstellung von mit Silikon ausgekleidetem Geschirr

HINWEIS: Dieser Schritt sollte vor den Experimenten durchgeführt werden. Diese Gerichte werden hergestellt, um die Assay-Schale für Dissektionen und für Kontraktionsassay-Experimente vorzubereiten.

  1. Bereiten Sie das Silikon mit einem Silikonelastomer-Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor. Mischen Sie die zweikomponentigen flüssigen Komponenten im Verhältnis 10 zu 1. Mischen Sie vorsichtig und gründlich durch Umkehren, aber achten Sie darauf, die Blasenbildung zu minimieren.
  2. Gießen Sie das Silikonelastomer in Standard-60-mm-Einweg-Polystyrol-Kulturschalen bis zu einer Tiefe von normalerweise zwischen 7 und 9 mm. Bereiten Sie so viele Gerichte wie nötig zu. Entfernen Sie Luftblasen mit einem feinen Stift unter dem Mikroskop, kurz nachdem Sie Silikon in das Geschirr gegossen haben. Stellen Sie das Geschirr für mindestens 48 h in eine staubfreie Kammer oder einen Staubschrank bei Raumtemperatur (RT) oder für ca. 4 h in einen Ofen bei 50 °C zum Aushärten (Aushärten) (Abbildung 5A).

2. Herstellung des Ramsay Assay-Gerichts

HINWEIS: Das Gericht kann von Experiment zu Experiment wiederverwendet werden, daher wiederholen Sie diesen Schritt nur, wenn das Gericht beschädigt ist oder bricht. Eine separate Schüssel wird für Die Sezierung verwendet.

  1. Erstellen Sie mit einem Skalpell (mit Standard-Vorsichtsmaßnahmen für scharfe Gegenstände) Vertiefungen in einer der silikonbeschichteten Petrischalen, um die Assay-Schale vorzubereiten, indem Sie genügend Silikon, etwa ~ 5 mm, von der Oberseite der Schüssel entfernen (dies sollte ~ 20 μL Badetröpfchen passen). Verwenden Sie zuvor einen Permanentmarker, um die Positionen unter der Schüssel zu markieren, um zu notieren, wo die Brunnen hergestellt werden sollen. Die Vertiefungen sollten ~ 1 cm voneinander entfernt sein, mit einem Durchmesser von etwa ~ 4 mm, damit das distale Ende des Tubulus passen kann. Jede Vertiefung enthält einen flüssigkeitssekretierenden Tubulus, so dass eine Schale mit 20 Vertiefungen die Analyse von bis zu 20 MT pro Experiment ermöglicht.
  2. Um die Minutien-Stifte vorzubereiten, legen Sie die 0,1 mm Edelstahlstifte in einer Reihe auf ein Stück Beschriftungsband, senkrecht zur Achse des Bandes. Schneiden Sie mit einer Schere entlang der Länge des Bandes, wodurch gleiche Hälften der Stifte entstehen. Verwenden Sie für jede Vertiefung einen halben Stift.
  3. Führen Sie mit einer stumpfen Pinzette jeden halben Stift neben jeder Vertiefung in die silikonbeschichtete Assay-Schale ein. Abhängig von der Länge des Insektentubulus führen Sie den Halbstift in einem Abstand ein, der es dem distalen Ende des Tubulus ermöglicht, in die Badesalzlösung einzutauchen und das proximale Ende um den Stift zu wickeln. Dieser Schritt kann unter einem Mikroskop durchgeführt werden, um Vertiefungen leicht sichtbar zu machen. Die Stifte können wiederverwendet werden, ersetzen Sie jedoch den Halbstift, wenn er beschädigt ist oder verloren geht. (Abbildung 5B)

3. Herstellung der Poly-L-Lysin-beschichteten SIET-Schale

HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, damit das Organ während der SIET-Messungen am Boden der Schale haftet, um sicherzustellen, dass der Messort für jede Probe gleich bleibt. Die Zubereitung dieser Gerichte sollte mindestens 2 Tage vor den Experimenten erfolgen. Jedes Gericht sollte nur einmal verwendet werden, wenn eine bestimmte Behandlung angewendet wird. Entsorgen Sie nach jeder Probe oder wenn die Poly-L-Lysin-Beschichtung abgekratzt oder beschädigt ist.

  1. Legen Sie für jede Probe eine 35-mm-Petrischale auf eine ebene Oberfläche. Entfernen Sie die Deckel und pipettieren Sie 70 μL Poly-L-Lysin (0,1 mg / ml) in der Mitte jeder Schüssel. Setzen Sie die Deckel wieder auf und lassen Sie das Poly-L-Lysin ungestört (~48 h) trocknen.
  2. Markieren Sie nach dem Trocknen den Schalenboden mit einem Kreis, der die getrocknete Poly-L-Lysinschicht umreißt, um besser zu visualisieren, wo das ausgeschnittene Organ nach den Dissektionen platziert werden sollte. Wenn nötig, um das Volumen von Kochsalzlösung und Behandlungslösungen in Experimenten zu minimieren, verwenden Sie eine Heißklebepistole, um die Poly-L-Lysin-Beschichtung einzukreisen, so dass genügend Platz für die Elektrode bleibt, um sich zu bewegen und Hintergrundmessungen durchzuführen (~ 20-25 mm Durchmesser des geklebten Kreises ist ausreichend). Diese beschichteten Schalen können unbegrenzt bei RT gelagert werden (Abbildung 5C).

4. Vorbereitung der Ramsay- und Kontraktionsassay-Schalen für Experimente

HINWEIS: Das Gericht kann wiederverwendet werden (entsprechende Wäsche zum Entfernen zuvor verwendeter Kochsalzlösungen/ Behandlungen vorausgesetzt), daher wird dieser Schritt nur wiederholt, wenn der Teller beschädigt ist oder bricht. Eine separate Schüssel wird für Die Sezierung verwendet. Dieser Schritt wird am Tag des Experiments durchgeführt.

  1. Verwenden Sie für die Kontraktionsassay-Schale ein Skalpell (mit Standard-Vorsichtsmaßnahmen für scharfe Gegenstände), erstellen Sie Vertiefungen in einer der silikonbeschichteten Petrischalen, um die Assay-Schale zuzubereiten. Winkeln Sie das Skalpell so an, dass die Vertiefungen dreieckig werden, um das Sezierte Gewebe an den Rändern festzunageln. Brunnen sollten groß genug sein, um bis zu 250 μL aufzunehmen und in den gesamten Verdauungskanal zu passen (anstatt zu tief zu graben, machen Sie den Brunnen breiter auf etwa 0,5-1 cm) (Abbildung 5D).
  2. Verwenden Sie für die Ramsay-Platte eine Pipette und füllen Sie Vertiefungen bis zu 20 μL Lösung auf (18 μL 1X Aedes Kochsalzlösung: Schneiders Medium, das in Schritt 5.2 hergestellt wurde, und 2 μL Hormon / Medikament). Für nicht stimulierte Kontrollen füllen Sie die Vertiefungen mit 20 μL 1X Aedes Kochsalzlösung:Schneiders Medium. Sobald alle Bohrlöcher gefüllt sind, gießen Sie hydratisiertes Mineralöl in die Assay-Schale, bis die Bohrlöcher und Minutien-Pins untergetaucht sind. Verwenden Sie eine 20-μL-Pipettenspitze, um Luftblasen zu platzen oder zu entfernen, die die sezernierten Tröpfchen stören könnten.

5. Lösungen vorbereiten

  1. Bereiten Sie 2X Aedes aegypti Kochsalzlösung und 10x Glucose vor, wie in Tabelle 1 beschrieben, angepasst von Petzel und Kollegen36. Stammlösungen sollten bei 4 °C gelagert werden. Stellen Sie Arbeitsvorräte aus 1X Aedes aegypti Kochsalzlösung her (Tabelle 1) und lagern Sie sie bei 4 °C. Lassen Sie am Experimenttag die Arbeitsbestände vor dem Gebrauch zu RT kommen. Bereiten Sie sich frisch zu, wenn es Anzeichen von Pilz- oder Bakterienwachstum gibt.
  2. Um den Badetropfen vorzubereiten, mischen Sie Aedes Kochsalzlösung (aus Schritt 5.1) mit Schneiders Medium im Verhältnis 1:1. Bereiten Sie in kleinen Aliquots zu, je nachdem, wie viel benötigt wird. Bewahren Sie Schneiders Medium im Kühlschrank auf und entsorgen Sie es, wenn es Anzeichen von Pilz- oder Bakterienwachstum gibt. (Dieser Schritt sollte am Tag des Experiments durchgeführt werden).
  3. Für Na+ -Flussmessungen mit dem SIET ist eine modifizierte Ca2+-freie Aedes-Kochsalzlösung (Tabelle 2) herzustellen, wie zuvor beschrieben26.

6. Motten-MTs und Hinterdarmdissektionen

  1. Für erwachsene Mückensektionen, sammeln Sie Puppe in einem kleinen Becher und legen Sie in ein Glas mit einer Saccharoselösung zum Füttern. Um das Alter der Mücke zu bestimmen, isolieren Sie geschlüpfte Moskitos und legen Sie sie in ein anderes Glas, wobei Sie das Alter und geschlecht der Moskitos für zukünftige Sezierungen notieren.
  2. Legen Sie die zu sezierenden Moskitos kurz auf ein CO2-Pad und warten Sie, bis sie nicht mehr reagieren. Heben Sie die Mücke mit einer feinen Pinzette von ihrem Bein oder Flügel auf und legen Sie sie auf eine mit Silikonelastomeren beschichtete Sezierschale, die in Schritt 1 vorbereitet wurde. Legen Sie die Mücke auf eine Seite (seitliche Seite nach oben) und mit einem Minutien-Stift in den Thorax aufspießen, um die Mücke an Ort und Stelle zu sichern. Entfernen Sie optional Flügel und Beine von Moskitos, um die Sezierung zu erleichtern.
  3. Fügen Sie mit einer Pasteur-Pipette einen Tropfen RT Aedes-Kochsalzlösung hinzu, um die Mücke vollständig in Kochsalzlösung einzutauchen. Stellen Sie sicher, dass die Sezierung vollständig unter Kochsalzlösung steht (siehe Tabelle 1 zur Herstellung von Aedes-Kochsalzlösung ).
  4. Legen Sie die Sezierschale unter ein stereoskopisches Mikroskop. Kneifen Sie das letzte Bauchsegment mit einer feinen Pinzette ein und ziehen Sie sich langsam von der Mücke weg. Dieser Schritt wird durch den gleichzeitigen Blick unter das Mikroskop erleichtert. Der Mitteldarm, der mit den MTs und dem Hinterdarm verbunden ist, sollte freigelegt werden (Abbildung 6).
  5. Für den Ramsay-Assay entfernen Sie vorsichtig jeden Tubulus aus der Mitteldarm-Hinterdarm-Verbindung und achten Sie darauf, die Organe nicht zu beschädigen. Verwenden Sie eine scharfe feine Pinzette, um die Tubuli einzeln zu entfernen - verwenden Sie keine beschädigten Tubuli für den Assay. (Siehe Schritt 7 für die Einrichtung.)
  6. Für die SIET sezieren Sie den Hinterdarm in Ca2+-freier Aedes-Kochsalzlösung (Schritt 5.3). Stellen Sie sicher, dass die Poly-L-Lysin-Schale auch ein festes Volumen an Ca2+-freier Aedes-Kochsalzlösung aufweist. Entfernen Sie vorsichtig die Nagelhaut aus dem Rektum und legen Sie den Hinterdarm (kann alle anderen angeschlossenen Organe entfernen, je nachdem, was gemessen wird) in die Poly-L-Lysin-Schale. Wenn Sie den Ionentransport entlang der rektalen Padepithelien messen, positionieren Sie die Hämolymphe-seite von mindestens einem Rektalpolster so, dass sie für die Mikroelektrode zugänglich ist (Abbildung 7).
    1. Verwenden Sie eine Pinzette, um das hinterste Ende zu greifen, bringen Sie den Hinterdarm auf den Boden der Schüssel (ohne die zu messenden Strukturen zu beschädigen). Sobald das Organ den Poly-L-Lysin-Mantel berührt, haftet es. Diese sezierte Probe ist bereit für Messungen. (Siehe Schritte 14 bis 16 für die EINRICHTUNG und Messung von SIET.)
  7. Stellen Sie für den Ileumkontraktionstest sicher, dass der Hinterdarm während der Dissektion am Mitteldarm befestigt bleibt (Abbildung 4D). Entfernen Sie vorsichtig die MTs, um einen ungehinderten Blick auf den Hinterdarm zu haben. Dieses Organ wird auf eine neue Schale übertragen, die wie in Schritt 4.1 beschrieben zubereitet wird. (Siehe Schritt 17 zum Abrufen von Assay-Videos.)

7. Einrichten des Ramsay-Assays

  1. Heben Sie mit der Spitze der Pinzette vorsichtig das proximale (offene) Ende des Tubulus an, indem Sie es über die Pinzette drapieren (kneifen Sie den Tubulus nicht ein) und geben Sie es in eine Vertiefung der Assay-Schale. Dieser Schritt kann auch mit feinen Glassonden durchgeführt werden.
  2. Sobald der Tubulus in den Brunnen eingetaucht ist, nehmen Sie das proximale Ende des Tubulus mit der Pinzette auf, entfernen Sie es aus dem Badetröpfchen und wickeln Sie das Ende um den Stift. Wickeln Sie den Tubulus zweimal um den Stift – und halten Sie die Länge des im Badetröpfchen verbleibenden Tubulus konsistent mit den anderen Tubuli. An diesem Punkt sollte sich das distale Ende des Tubulus im Badetröpfchen befinden, während das proximale Ende um den vom Badetröpfchen entfernten Stift gewickelt ist, damit sich die sezernierte Flüssigkeit vom offenen proximalen Ende an der Spitze des Stiftes ansammeln kann.
  3. Unmittelbar nachdem der Tubulus um den Stift gewickelt wurde, notieren Sie sich die Vertiefungen (z. B. A, B, C), die Uhrzeit (die die Startzeit ist, zu der die Flüssigkeit aus dem Tubulus abgesondert wird) und alle anderen identifizierenden Informationen (z. B. Hormon, Genotyp usw.).
  4. Jede Mücke hat fünf Tubuli, also wiederholen Sie die Schritte 7.1–7.3 mit dem Rest der Tubuli. Für Kontroll- und experimentelle Behandlungen teilen Sie die fünf Tubuli innerhalb der verschiedenen Behandlungen auf. Fahren Sie mit der nächsten Sezierung fort, bis die gesamte Assay-Schale gefüllt ist. Mit der Praxis sollte diese Technik typischerweise 2-3 Minuten dauern, um die Tubuli zu sezieren, sie auf die Badesalzlösung zu übertragen und sich um den Stift zu wickeln, wodurch ein Unterschied von 2-3 Minuten in der Startzeit zwischen jedem Tubulus entsteht.
    HINWEIS: Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, kalibrieren Sie das Augenmikrometer des Mikroskops mit einem Stufenmikrometer unter dem ausgewählten Objektiv. Sezernierte Tröpfchen werden routinemäßig unter einer 40-fachen Bis 50-fachen Gesamtvergrößerung gemessen.
  5. Nach der zugeteilten Inkubationszeit kann das sezernierte Tröpfchen gemessen werden. Messen und notieren Sie mit dem Augenmikrometer des Mikroskops den Durchmesser des sezernierten Tröpfchens. Berechnen Sie den Durchmesser (d) des sezernierten Tröpfchens durch Multiplikation des Durchmessers der Augeneinheit, gemessen mit der Kalibrierumrechnung (Tabelle 3). Berechnen Sie das Volumen des sekretierten Tröpfchens mit der Gleichung V = πd3/6.
  6. Um die Sekretionsrate (nL min-1) zu berechnen, verwenden Sie die Gleichung Fluidsekretionsrate = V /Sekretionszeit, wobei V das Volumen des in Schritt 7.5 berechneten sezernierten Tröpfchens ist und die Sekretionszeit sich auf die Inkubationszeit des Tubulus bezieht.

8. ISME-Einrichtung

  1. Platzieren Sie Mikromanipulatoren auf beiden Seiten des Stereomikroskops, um die ISME-Station einzurichten. Die Chloridierung der Silberdrähte kann erreicht werden, indem man in eine Eisenchloridlösung eintaucht und jeden Silberdraht in jeden der Mikroelektrodenhalter einfädelt (oder die Drähte bei Bedarf auf die Koaxialkabel lötet). Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn die Silberdrähte chloridfrei werden.
  2. Schließen Sie die Silberdrähte an einen Verstärker an, der an ein Datenerfassungssystem liest. Richten Sie das System gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kalibrieren Sie es. Verwenden Sie bei erhöhten elektrischen Störungen einen ordnungsgemäß geerdeten Faradayschen Käfig.

9. Vorbereitung der Mikroelektroden für ISME und SIET

  1. Ziehen Sie mit einem P-97 Flaming Brown Pipettenabzieher ~5–6 unfilamentierte Borosilikatglaskapillaren (Außendurchmesser 1,5 mm, Innendurchmesser 1,12 mm, Länge 100 mm) mit einer Spitze von 1–5 μm. Diese werden als ionenselektive Mikroelektroden verwendet. Bei SIET-Mikroelektroden sollte die resultierende Elektrode eine Spitzenöffnung von ~5 μm aufweisen, die durch einen kurzen Schaft gekennzeichnet ist.
  2. Legen Sie die Mikroelektroden in eine Haube auf eine Kochplatte (vorsichtig abstellen, um die Spitzen der Elektroden nicht zu brechen). Fügen Sie Dichlordimethylsilan in eine 15 cm glasige Petrischale hinzu und kehren Sie sie über die Elektroden auf der Kochplatte um. Verwenden Sie Dichlordimethylsilan, um die ionenselektiven Elektroden zu silanisieren, indem Sie allen Oberflächen der Elektrode eine hydrophobe Schicht hinzufügen, so dass sie das hydrophobe Ionophor37 zurückhalten kann. Unbenutzte silanisierte Elektroden können für einige Wochen belassen werden; Daher wird dieser Schritt alle paar Wochen oder für neu gezogene Elektroden durchgeführt.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Dichlordimethylsilan – brennbar, korrosiv und giftig, siehe Sicherheitsdatenblätter zur sicheren Handhabung.
    1. Drehen Sie die Kochplatte auf 350 °C und lassen Sie sie 75 min einwirken. Verwenden Sie ein 1: 2-Verhältnis der Anzahl der Mikroelektroden zu Volumen (μL) von Dichlordimethylsilan, um es auf die Glas-Petrischale zu geben. So werden für 10 Mikroelektroden 20 μL Dichlordimethylsilan zugegeben.
  3. Nach 75 Minuten schalten Sie die Heizplatte aus. Nachdem die Elektroden und die Heizplatte abgekühlt sind, entfernen Sie die Glas-Petrischale und übertragen Sie die Elektroden (mit Pinzette) in eine Aufbewahrungsbox mit Formton. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Elektrode nach oben zeigt, um Schäden zu vermeiden.
  4. Um die Referenzelektroden für ISME herzustellen, ziehen Sie ~ 4–5 filamentierte Borosilikatglas-Kapillarrohre (Außendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser 0,58 mm, Länge 100 mm). Diese Elektroden müssen nicht silanisiert werden. Etikettieren und in einer ähnlichen Box aufbewahren, um Schäden an der Spitze zu vermeiden.
  5. SIET-Referenzelektroden bestehen aus Standard-Glaskapillaren (Außendurchmesser 2 mm, Innendurchmesser 1,12 mm, Länge 102 mm). Die Kapillaren sind mit geschmolzenem 1 M KCl + 3% Agar gefüllt und sollten bis zum Gebrauch in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 1 M KCl (vollständig untergetaucht) gelagert werden. Sie können wiederholt verwendet werden, bis sich Blasen bilden oder wenn das Agar bricht. Wenn Luftraum vorhanden ist, entsorgen Sie das Glas und verwenden Sie ein neues, um sicherzustellen, dass der Stromkreis vollständig ist.

10. Vorbereiten der Verfüllspritzen

HINWEIS: Dieser Schritt wird ausgeführt, um Spritzen mit feiner Spitze zum Verfüllen von Elektroden für ISME zu erstellen.

  1. Verwenden Sie eine 1 ml Slip-Tip-Spritze mit einer Einwegnadel. Entsorgen Sie die Nadel und ziehen Sie die Spritze bis zur 1 ml Markierung zurück. Schalten Sie unter dem Abzug den Bunsenbrenner ein und erhitzen Sie die Plastikspitze der Spritze, bis sie zu schmelzen beginnt. Mit einer alten Pinzette vorsichtig die geschmolzene Spritzenspitze einklemmen und nach unten ziehen, um die Spitze zu dehnen.
  2. Schneiden Sie die geschmolzene Spitze mit einer Schere auf die gewünschte Länge, so dass der Durchmesser klein genug ist, um in die Elektroden zu passen (siehe Diagramm). Nachdem die Spritze abgekühlt ist, testen Sie den Druck der Spritze mit Wasser, um sicherzustellen, dass keine Verstopfung vorliegt. Erstellen Sie eine für jede erforderliche Verfülllösung, und beschriften Sie sie entsprechend (Abbildung 8).

11. Befüllung der ionenselektiven und Referenzmikroelektrode für ISME und SIET

HINWEIS: Die Mikroelektrode darf wiederverwendet werden, solange sie noch funktioniert (vor jedem Experiment kalibrieren). Für ISME kann dieser Schritt durchgeführt werden, während die MTs im Ramsay-Assay inkubiert werden.

  1. Um eine Na+-selektive Mikroelektrode herzustellen, verwenden Sie die in Schritt 10 erstellte 1-ml-Spritze, um die Elektrode mit 100 mM NaCl zu füllen. Stellen Sie sicher, dass sich die Verfülllösung bis zur Spitze der Elektrode füllt. Wenn Luftblasen auftreten, streichen Sie vorsichtig mit der Mikroelektrode oder entfernen Sie die Lösung und füllen Sie sie wieder auf. Dies sollte unter einem stereoskopischen Mikroskop erfolgen, um besser sichtbar zu machen.
  2. Tauchen Sie unter einem stereoskopischen Mikroskop eine 10-μL-Pipettenspitze in die Na+-selektive Ionophorlösung. Richten Sie die Elektrode senkrecht zur Pipette aus, legen Sie einen behandschuhten Finger über die Unterseite der Spitze, um Druck zu erzeugen und einen kleinen Tropfen Ionophor auszustoßen. Betrachten Sie unter hohem Objektiv eines Mikroskops vorsichtig den Ionophortropfen an der Mikroelektrodenspitze, um ein Brechen der Spitze zu vermeiden. Normalerweise sind Mikroelektroden mit einer Ionophor-Cocktailsäulenlänge zwischen 150 und 300 μm vorwärts gefüllt, bis der Ionophor/Backfill-Lösungsrand flach ist.
    VORSICHT: Dieser Ionophor ist giftig, siehe Sicherheitsdatenblätter zur sicheren Handhabung.
  3. Füllen Sie in einem kleinen Becher auf halbem Weg 100 mM NaCl auf und legen Sie etwas Modelliermasse auf die Innenseite an der Oberseite des Becherglases. Nachdem der Na+ -Ionophor aufgenommen wurde, legen Sie die Elektrode tip-down auf die Wand des Becherglases, lassen Sie die Spitze innerhalb des 100 mM NaCl sitzen und bewahren Sie ISME im Becherglas auf, bis es gebrauchsfertig ist.
  4. Um die ISME-Referenzelektrode herzustellen, füllen Sie eine Elektrode mit 500 mM KCl ab, um sicherzustellen, dass die Lösung bis zur Spitze gefüllt ist (befolgen Sie das gleiche Protokoll wie oben). Bewahren Sie die KCl in einem Becherglas auf.

12. Kalibrieren von Elektroden für ISME

HINWEIS: Dieser Schritt wird direkt vor der Messung der sezernierten Flüssigkeit durchgeführt (~ 10-15 Min vorher). Kalibrierungen sollten alle ~ 5-6 Messungen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Steigung konsistent ist.

  1. Beschichten Sie die Elektrodenspitzen mit einer Lösung von ~ 3,5% (w / v) Polyvinylchlorid, das in Tetrahydrofuran gelöst ist, um eine Verschiebung des Ionophors beim Eintauchen in Paraffinöl zu vermeiden.
    ACHTUNG: Dies ist brennbar, siehe Sicherheitsdatenblatt für die sichere Handhabung.
  2. Um die Na+ -Elektrode zu kalibrieren, legen Sie 10 μL Tröpfchen der folgenden NaCl-Standardkonzentrationen mit den inkubierten MTs auf den Rand der Ramsay-Schale: 200 mM NaCl und 20 mM + 180 mM LiCl. Legen Sie die Standardtröpfchen ~ 2 cm auseinander, mit der höheren Konzentration oben.
  3. Führen Sie sowohl die Referenzelektrode als auch die ionenselektive Elektrode über die Drähte aus chloridiertem Silber ein und befestigen Sie sie sicher mit Elektrodenhaltern, die an Mikromanipulatoren befestigt sind. Navigieren Sie beide Elektroden mit den Mikromanipulatoren zum 200 mM NaCl-Tröpfchen und stellen Sie sicher, dass die Elektrodenspitzen den Boden der Schüssel nicht berühren. Schalten Sie das Elektrometer ein, um die Aufnahme zu starten und den Messwert stabilisieren zu lassen.
  4. Zeichnen Sie den Messwert auf und fahren Sie mit dem nächsten Standard (20 mM NaCl + 180 mM LiCl) fort. Berechnen Sie die Steigung, und wenn der Elektrodenwert stabil ist und die Steigung im Bereich liegt, verwenden Sie die Elektrode für die sezernierten Tröpfchenmessungen. Wenn der Messwert instabil ist, keine ordnungsgemäße Aufzeichnung oder Steigung ergibt oder eine Weile braucht, um sich auszugleichen, bereiten Sie entweder eine neue ionenselektive Elektrode vor oder brechen Sie die Spitze der Referenzelektrode, indem Sie ein Gewebe über die Spitze führen. Die Steigung für Na+ sollte ~58–60 mV38 betragen, obwohl ein akzeptabler Bereich 50–60 mV beträgt.

13. ISME-Aufzeichnungen und Berechnungen

  1. Nach Messungen der Flüssigkeitssekretionsrate (siehe Schritt 7.7) werden sowohl die Referenz- als auch die ionenselektive Elektrode vorsichtig mit den Mikromanipulatoren in das sezernierte Tröpfchen bewegt. Schalten Sie die Aufzeichnung ein und lassen Sie den Messwert stabilisieren und aufzeichnen. Wiederholen Sie diesen Schritt für die anderen Tröpfchen (wiederholen Sie die Kalibrierungsmessungen alle ~5–6 Messungen).
  2. Die Kationenkonzentrationen werden unter Verwendung der zuvor beschriebenen Gleichung berechnet22,38, [Ion] = [C] x 10ΔV/m, wobei [C] die Konzentration in mmol L-1 der Kalibrierlösung ist, die zur Kalibrierung der ISME verwendet wird, ΔV die Änderung der Spannung zwischen der vom sezernierten Flüssigkeitstropfen aufgezeichneten Spannung und der Spannung derselben Kalibrierlösung ist; und m ist die Spannungsdifferenz zwischen den beiden Standardkalibrierungen, die auch die Steigung ist.

14. SIET-Einrichtung

HINWEIS: Das SIET-System wurde bereits beschrieben27,39. Um Hintergrundgeräusche zu reduzieren, ist ein Faradayscher Käfig um das Lichtmikroskop und die Kopfbühne installiert. Die in diesem Artikel vorgestellten Experimente verwenden die folgenden Einstellungen auf der Automated Scanning Electrode Technique (ASET) Software 2.0: eine Wartezeit von 4 Sekunden, damit sich ionengradienten nach Mikroelektrodenbewegungen vollständig wiederherstellen können, wobei die Spannung für 0,5 s nach der Wartezeit aufgezeichnet wird, eine Exkursionsdistanz von 100 μm und drei Wiederholungen für jede Aufnahme. Bestimmte Einstellungen können in ASET nach Bedarf vom Benutzer geändert werden.

  1. Schalten Sie den IPA-2 Ionen-/Polarographie-Verstärker, das Lichtmikroskop (mit angeschlossener Videokamera) und die Computer ein, die an jeden dieser Computer angeschlossen sind, auf denen ASET und cellSens ausgeführt werden.
  2. Herstellen von Mikroelektroden und Referenzelektroden, die in den Schritten 9.1–9.3, 9.5, 10 und 11.1–11.3 beschrieben sind. Die ionenselektive Mikroelektrode enthält Na+ Ionophor mit 100 mM NaCl-Verfüllung und die Referenzelektrode (mit den Agarbrücken) wird immer mit 3 M KCl gefüllt.
  3. Legen Sie die Na+-selektive Mikroelektrode auf den Halter, der aus einem Silberchloriddraht (AgCl) besteht, und befestigen Sie ihn in der Buchse. Füllen Sie den Referenzelektrodenhalter mit einer Spritze mit frischen 3 M KCl (kann vor dem Experimentiertag hergestellt und bei RT gelagert werden).
    HINWEIS: Nach Versuchen den Referenzelektrodenhalter mit ddH2O auswaschen.
  4. Entfernen Sie eine Referenzelektrode aus dem Becherglas, die alle in 3 M KCl eingetauchten Referenzelektroden enthält, legen Sie einen Finger an ein Ende und neigen Sie die Glaskapillar zu diesem Finger, um zu verhindern, dass das Agar herausfällt. Legen Sie vorsichtig ein Ende in den Halter, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen bilden. Wenn es eine Blase gibt, entfernen Sie die Referenzelektrode, füllen Sie den Halter mit mehr 3 M KCl auf und wiederholen Sie ihn. Setzen Sie den Elektrodenhalter in die Buchse ein.

15. Kalibrieren von Elektroden für SIET

  1. Verwenden Sie für Na+ Messungen eine 150 mM NaCl und 15 mM NaCl + 135 mM LiCl Lösung24. Zwischen den beiden Lösungen sollte ein 10-facher Unterschied in den Na+ -Konzentrationen bestehen, der den Bereich der Na+ -Spiegel (20 mM) in der Kochsalzlösung umfasst (Tabelle 2).
  2. Lagern Sie Kalibrierlösungen bei RT in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen und aliquot in einer Petrischale, während Sie das Experiment durchführen. Dieser Aliquot wird am Ende des Tages entsorgt. Wenn es Hinweise auf eine Kontamination in den Lagerlösungen gibt, entsorgen Sie sie und stellen Sie frische Lösungen her.
  3. Zur Kalibrierung aliquotieren Sie die beiden Kalibrierlösungen (Schritt 15.1) in einzelne 35 mm Petrischalen und legen Diese auf das Mikroskoptisch. Stellen Sie mit den manuellen Einstellknöpfen sicher, dass sich die Mikroelektrodenspitze in der Kalibrierlösung befindet, wenn die Schrittmotoren mit der Option "Deaktivieren" auf der Computer-Bewegungssteuerungseinheit gesteuert werden. Tauchen Sie die Spitze nicht zu weit ein, da sie brechen kann. Wenn die Spitze bricht, bereiten Sie eine neue ionenselektive Mikroelektrode vor und kalibrieren Sie sie neu.
    1. Öffnen Sie auf dem an den Verstärker angeschlossenen Computer die ASET-Software. Öffnen Sie die Kalibrierungseinstellungen. Wählen Sie Nernst Slope für den Kalibriertyp, stellen Sie die Probe auf 3 Sekunden und geben Sie die Konzentrationen der Kalibrierlösungen ein. Geben Sie beispielsweise für Na+ -Messungen 150 mM in Lösung 1 ein, platzieren Sie die Na+-selektive Mikroelektrodenspitze und die Referenzelektrode in dieser Kalibrierlösung. Die Spannungsmessung am Verstärker sollte stabil sein. Klicken Sie auf Lösung 1 und warten Sie, bis die Spannung (in mV) aufgezeichnet wurde. Als nächstes platzieren Sie die Mikroelektrode und die Referenzelektrode in der 15 mM NaCl + 135 mM LiCl-Lösung, geben Sie 15 mM in Lösung 2 ein und klicken Sie auf Lösung 2 , um den Spannungsmesswert zu erhalten. Die Steigung ist die Differenz zwischen diesen beiden Spannungen, die in diesen Einstellungen berechnet wird. Klicken Sie nach der Kalibrierung auf OK.
    2. Die Steigungen für Na+-selektive Mikroelektroden für eine zehnfache Änderung der Ionenkonzentration sollten bei etwa 59,0 ± 1,624 liegen. Wenn die Nernst-Steigung stark von diesem Bereich abweicht, bereiten Sie eine neue Mikroelektrode vor oder aliquot neue Standards (da sie kontaminiert sein können). Je nach Spannungsstabilität ist vor jeweils 2–3 Proben eine Kalibrierung erforderlich. Wenn die Spannung instabil wird und zu schwanken beginnt, bereiten Sie eine neue ionenselektive Mikroelektrode vor.

16. SIET-Messungen

HINWEIS: Der Motorschalter an der Computer Motion Control-Einheit sollte immer auf Deaktivieren geschaltet werden, außer bei der Manipulation der Elektrode mit Computertasten über ASET oder während der Messaufzeichnungen (an diesem Punkt sollte die Taste auf Aktivieren geschaltet werden).

  1. Nach der Kalibrierung sezieren Sie das Organ (siehe Schritt 6.6). Legen Sie die Poly-L-Lysin-Schale mit der sezierten Probe auf das Mikroskoptisch und führen Sie die Spitze der Referenzelektrode in die Kochsalzlösung ein. Tauchen Sie die Spitze der ionenselektiven Mikroelektrode in die Kochsalzlösung und achten Sie darauf, die Spitze nicht zu brechen.
  2. Verwenden Sie die manuellen Einstellknöpfe, um die Mikroelektrodenposition einzustellen, während Sie unter das Lichtmikroskop schauen. Stellen Sie die vertikale Position der Mikroelektrode so ein, dass sich ihre Spitze auf der gleichen Ebene wie das Organ oder Gewebe befindet. Sobald Sie sich an der gewünschten Position befinden, drehen Sie den Motorschalter auf Aktivieren. Zu diesem Zeitpunkt können die Schrittmotoren nur mit der Computersoftware betrieben werden.
  3. Bewegen Sie die Mikroelektrode mit den Pfeiltasten des Computers horizontal in eine Position, die 3 mm vom Gewebe entfernt ist, um Hintergrundaufnahmen zu messen. Fügen Sie Notizen ein, indem Sie F2 drücken. Wenn Sie fertig sind, beginnen Sie mit der Aufnahme (indem Sie F5 drücken). Erhalten Sie fünf Messungen der Hintergrundaktivität. Die durchschnittliche Hintergrundspannungsaktivität für jede Probe wird von den Spannungsgradienten subtrahiert, die entlang des Gewebes für dieselbe Probe gemessen werden.
  4. Bewegen Sie die Mikroelektrodenspitze wieder in die Nähe des Gewebes und achten Sie darauf, das Organ nicht zu durchbohren. Reduzieren Sie die Keyhit-Empfindlichkeit, um die Mikroelektrodenspitze 2 μm direkt rechts, senkrecht zum Gewebe, zu platzieren. Erhalten Sie drei Aufzeichnungen an jeder Stelle entlang des Rektalpolsters, um den Ort der größten Ionenaktivität zu identifizieren. Erhalten Sie Basis-Salzlösungsmessungen an dem Standort mit der größten Aktivität (dem "Hotspot"-Standort).
  5. Schalten Sie den Motor auf Deaktivieren und fügen Sie die entsprechende Behandlung in die Schale ein, um die endgültige gewünschte Dosis zu erhalten. Erstellen Sie nach der Anwendung eine neue Notiz (z. B. Behandlungsname und Dosis), schalten Sie den Motor zurück auf Aktivieren und nehmen Sie Spannungsaufzeichnungen mit F5 auf. Wenn das Ziel darin besteht, Veränderungen im Laufe der Zeit zu beobachten, führen Sie weiterhin Messungen in bestimmten Zeitintervallen durch. Mehrere Protokolle können für bestimmte Anwendungen mit dem SIET erstellt werden, abhängig vom Ziel des Forschers.
  6. Beobachten Sie, wie die ASET-Software die Spannung an der Stelle entlang des Gewebes aufzeichnet und diese von der Spannung in einem Auslöseabstand (Abbildung 7) von 100 μm vom Gewebe abzieht. Da die erste Aufnahme am Gewebe gemacht wird, zeigt eine positive Spannungsdifferenz an, dass die Spannung am Epithel (Gewebe) höher ist (Abbildung 7A) als weg vom Epithel (Abbildung 7B), und somit das Kation absorbiert wird. Ein negativer Spannungsgradient weist auf eine Kationssekretion hin.
  7. Erhalten Sie nach der Behandlung erneut Hintergrundaufnahmen (3 mm entfernt) und verwenden Sie diese bei der Berechnung des Ionenflusses nach der Behandlung. Machen Sie einen Satz Hintergrundaufnahmen in "Baseline" und einen Satz nach der Behandlung. Schalten Sie den Motor immer dann auf Deaktivieren, wenn die Mikroelektrode nicht mit den Computertasten eingestellt wird oder wenn die Spannung nicht aufgezeichnet wird. Exportieren Sie die Daten in eine Textdatei und öffnen Sie sie mit Excel, um alle Berechnungen durchzuführen.
  8. Berechnen Sie den Ionenfluss anhand der zuvor beschriebenen Gleichungen24,26. Der Nettoionenfluss für jede Behandlung kann als absolute Änderung gegenüber den Basis-Ionenflussmessungen ausgedrückt werden. Um die Signifikanz der Ergebnisse zu überprüfen, kann eine Fahrzeugkontrolle (d. H. Hinzufügen von Kochsalzlösung allein in die Schale anstelle einer Behandlung) verwendet werden. Veränderungen des Ionentransports nach der Hormonbehandlung sollten im Verhältnis zu etwaigen Veränderungen als Reaktion auf diese Kontrolle beurteilt werden.

17. Hindgut-Kontraktionstests

  1. Füllen Sie eine der Vertiefungen in der in Schritt 4.1 beschriebenen Schale mit einem bekannten Volumen Aedes-Kochsalzlösung (Schritt 5.1). Nach der Dissektion (Schritt 6.7) wird das am Mitteldarm befestigte sezierte Hinterdarm vorsichtig in den Brunnen in der anderen Schale gegeben, wobei darauf zu achten ist, dass das untersuchte Organ (Ileum) nicht eingeklemmt wird. Tauchen Sie den Darm in die Kochsalzlösung im Brunnen ein und legen Sie Minutien-Stifte in den Mitteldarm und das Rektum. Auf diese Weise sollte das Ileum nicht unter Spannung stehen, und spontane Kontraktionen, die an der Pylorusklappe am vorderen Ileum entstehen, sollten beobachtet werden.
  2. Schließen Sie eine Videokamera an ein stereoskopisches Mikroskop an und nehmen Sie Videos mit einer Videoaufnahmesoftware auf (z. B. INFINITY CAPTURE von Luminera). Legen Sie die Schale mit dem sezierten Organ unter das Mikroskop und nehmen Sie für 2 min auf. Dies ist die Bedingung "Baseline".
  3. Fügen Sie dem Bohrloch ein bekanntes Volumen von 1X Aedes-Kochsalzlösung (Schritt 5.1) hinzu, um Änderungen der Ileummotilität bei steigendem Volumen innerhalb des Bohrlochs zu berücksichtigen. Warten Sie nach der Anwendung 1 Minute und nehmen Sie dann erneut 2 Minuten auf. Dies ist die "salzhaltige" Bedingung.
  4. Fügen Sie ein bekanntes Behandlungsvolumen hinzu (aus einer 10-fachen Stammkonzentration, um die gewünschte Dosis im Bohrloch zu erhalten). Warten Sie nach der Anwendung 1 Minute und nehmen Sie dann erneut 2 Minuten auf. Dies wird die "Behandlung" -Bedingung sein.
  5. Speichern Sie alle Videos und konvertieren Sie sie in MP4. Um zu analysieren, zählen Sie die Anzahl der Kontraktionen in den 2-Minuten-Intervallen (definiert als eine peristaltische Welle, die an der Pylorusklappe beginnt und sich über das gesamte Ileum erstreckt). Teilen Sie diese Zahl durch 2 Minuten, um die Kontraktionsrate zu erhalten. Auch andere Parameter können bewertet werden, wie z.B. Kontraktions- oder Entspannungsdauer. Drücken Sie nach dem Sammeln von Rohdaten jeden Parameter relativ zu den Daten für "Basisbedingungen" für jede Stichprobe aus. Zeichnen Sie die Faltenänderung für die "Kochsalzlösung" und die "Behandlung" alle relativ zur "Baseline" auf.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Anwendung von DH31 gegen unstimulierte MTs führt zu einer signifikanten Erhöhung der Flüssigkeitssekretionsrate, was seine Rolle als harntreibendes Hormon bei Aedes-Mücken bestätigt (Abbildung 1A). Wenn Tubuli mit AedaeCAPA-1 behandelt werden, wird eine Verringerung der Sekretionsrate in DH31-stimulierten MTs beobachtet. Abbildung 1B zeigt die Verwendung von ionenselektiven Elektroden zur Messung der Na+ -Ko...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei der Einnahme einer Blutmahlzeit stehen hämatophage Insekten vor der Herausforderung von überschüssigen gelösten Stoffen und Wasser in ihrer Hämolymphe2. Um damit fertig zu werden, haben sie ein spezialisiertes Ausscheidungssystem, das durch hormonelle Faktoren streng kontrolliert wird, so dass die Insekten schnell eine postprandiale Diurese einleiten können. Der Ramsay-Assay und die Verwendung von ionenselektiven Mikroelektroden ermöglichen die Messung von Flüssigkeitssekretionsraten zusammen ...

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Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durch Die Discovery Grants des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) für AD und J-PP finanziert. AL und FS erhielten NSERC CGS-M-Auszeichnungen zur Unterstützung ihrer Graduiertenforschung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mLSpritzen Fisher Scientific14955456
35 mm PetrischalenCorning Falcon (Fisher Scientific)C351008
Borosillicate Glaskapillarfilamentröhrchen
(AD 1 mm, ID 0,58 mm, Länge 100 mm)		World Precision Instruments1B100F-4für ISME-Referenzelektroden
Borosillicat-Glas-Kapillarfilamentrohre
(AD 2 mm, ID 1,12 mm, Länge 102 mm)		World Precision Instruments1B200F-4für SIET-Referenzelektroden
Borosilcat-Glaskapillarrohre
(OD 1,5 mm, ID 1,12 mm, Länge 100 mm)		World Precision InstrumentsTW150-4für ISME- und SIET-Elektroden
CO2 PadDiamedGEN59-114
DimethyltrimethylsilylaminlösungSigma-Aldrich41716
Faradayscher KäfigCustomKann von einer lokalen Maschinenwerkstatt hergestellt werden
EisenchloridSigma-Aldrich157740
Pinzette (Dumont # 5)Fine Science Tools91150-20
Petrischale aus GlasFisher Scientific08-748A
Hydratisiertes MineralölFisher Scientific8042-47-5Spezifische Marke ist nicht wichtig
INFINITY1-2CB VideokameraLumineraINFINITY1-2CB
Mikromanipulatoren (Links- und Rechtshänder)World Precision InstrumentsMMJL und MMJRSpezifische Marke ist nicht wichtig, solange hochwertiger Manipulator
Mineralöl, LichtFisher Scientific0121-4
Winzige Stifte (0,1 mm Edelstahl)Fine Science Tools26002-10
Nicht aushärtende ModelliermasseSargent ArtSpezifische Marke ist nicht wichtig
Olympus Lichtmikroskop (FÜR SIET)Olympus kundenspezifisches System
Kunststoff Pasteur (Transfer) PipetteFisher Scientific13-711-7M
Poly-L-Lysin Lösung (0,1 mg/ml)Sigma-AldrichA-005-M84 kDa
Polyvinylchlorid (PVC)Sigma-Aldrich81395
SkalpellklingeFine Science Tools10050-00
SkalpellgriffFine Science Tools10053-09
Schneider's Drosophila MediumSigma-AldrichS0146
SIET-SystemAnwendbare Elektronikkundenspezifisches SystemDetails verfügbar unter: http://www.applicableelectronics.com/overview
SilberdrahtWorld Precision InstrumentsAGW1010
Natriumionophor II Cocktail AFluka99357
Standard-Polystyrol-Petrischalen (Kulturschalen)FisherbrandFB012921Jede Größe würde funktionieren, aber 60-mm-Schalen eignen sich sowohl zum Sezieren als auch Stereomikroskop
mit OkularmikrometerNikonSMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown PipettenabzieherSutter InstrumentsFGPN7
Sylgard 184 Silikon-Elastomer-KitDow Chemical CompanyNC9285739
TetrahydrofuranSigma-Aldrich401757
VWR fortschrittlicher Heizplattenrührer - AluminiumVWR9578Bestimmte Marke ist nicht wichtig

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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