Summary
在这里，我们描述了一种易于使用的方法，用于生成由预分化的人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞，心脏成纤维细胞和内皮细胞组成的3D自组装心脏微组织阵列。这种用户友好且需要低细胞的技术来生成心脏微组织，可用于疾病建模和药物开发的早期阶段。
Abstract
从诱导多能干细胞（iPSCs）中产生人心肌细胞（CM），心脏成纤维细胞（CFs）和内皮细胞（EC）为研究驱动组织发育和疾病的不同心血管细胞类型之间的复杂相互作用提供了独特的机会。在心脏组织模型领域，几种复杂的三维（3D）方法使用诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（iPSC-CM）来模拟生理相关性和天然组织环境，结合细胞外基质和交联剂。然而，这些系统在没有微细加工专业知识的情况下制造起来很复杂，并且需要数周才能自行组装。最重要的是，许多这些系统缺乏血管细胞和心脏成纤维细胞，它们占人类心脏非肌细胞的60%以上。在这里，我们描述了从iPSCs中衍生出所有三种心脏细胞类型以制造心脏微组织。这种简单的复制成型技术允许心脏微量组织在标准的多孔细胞培养板中培养数周。该平台允许用户根据初始播种密度自定义控制微量样本大小，并且自组装时间不到3天即可实现可观察的心脏微组织收缩。此外，心脏微量组织可以很容易地被消化，同时通过使用流式细胞术和单细胞RNA测序（scRNA-seq）保持高细胞活力，用于单细胞质询。我们设想，这种心脏微组织的 体外 模型将有助于加速药物发现和疾病建模的验证研究。
Introduction
由于缺乏临床相关样本和转化工具不足，心血管研究领域的药物发现和疾病建模面临多项挑战1。高度复杂的临床前模型或过度简化 的体外 单细胞模型不会以可重复的方式表现出病理生理学条件。因此，已经发展了几个小型化的组织工程平台，以帮助弥合差距，目标是在高通量方式的易用性和忠实地概括组织功能之间实现平衡2，3。随着诱导多能干细胞（iPSC）技术的出现，组织工程工具可以应用于具有或不具有潜在心血管疾病状态的患者特异性细胞，以回答研究问题4，5，6。这种具有类似于心脏组织的细胞组成的组织工程模型可用于药物开发工作，以测试由一种或多种细胞类型的行为的病理变化引起的心脏毒性和功能障碍。
来自人类iPSCs的自组装微组织或类器官是三维（3D）结构，是微型组织样组件，与 体内 对应物表现出功能相似性。有几种不同的方法允许通过iPSCs的定向分化或通过胚状体 的形成在原位 形成类器官4。由此产生的类器官是研究驱动器官发生的形态发生过程的不可或缺的工具。然而，各种细胞群的存在和自组织的差异可能导致不同类器官之间结果的差异5。或者，预分化细胞自组装成具有组织特异性细胞类型的微组织以研究局部细胞 - 细胞相互作用是极好的模型，其中分离自组装组分是可行的。特别是在人类心脏研究中，当细胞来自不同的患者品系或商业来源时，具有多细胞成分的3D心脏微组织的开发已被证明是具有挑战性的。
为了在生理相关、个性化的 体外模型中 提高我们对细胞行为的机制理解，理想情况下，所有组分细胞类型都应来自同一患者品系。在人类心脏的背景下，真正具有代表性 的心脏体外 模型将捕获主要细胞类型之间的串扰，即心肌细胞（CM），内皮细胞（EC）和心脏成纤维细胞（CFs）6，7。心肌的忠实概括不仅需要生物物理拉伸和电生理刺激，还需要来自EC和CFs8等支持细胞类型的细胞 - 细胞信号传导。CFs参与细胞外基质的合成并维持组织结构;在病理状态下，CFs可以诱导纤维化并改变CMs9中的电传导。同样，EC可以通过旁分泌信号传导和满足重要的代谢需求来调节CM的收缩特性10。因此，需要由所有三种主要细胞类型组成的人类心脏微组织，以允许进行生理相关的高通量实验。
在这里，我们描述了通过衍生人iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CM），iPSC衍生的内皮细胞（iPSC-EC）和iPSC衍生的心脏成纤维细胞（iPSC-CFs）及其在均匀的心脏微组织阵列中的3D培养来制造心脏微组织的方法。这种产生自发跳动的心脏微系统的简单方法可用于疾病建模和药物的快速测试，以对心脏生理学的功能和机制理解。此外，这种多细胞心脏微组织平台可以通过基因组编辑技术来模拟慢性或急性培养条件下心脏病随时间的进展。
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Protocol
1. 培养基、试剂、培养板制备
- 用于细胞培养的细胞洗涤溶液：使用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）或汉克斯平衡盐溶液（HBSS），不含钙或镁。
- 心肌细胞分化培养基
- 通过将 10 mL 补充剂（50x B27 加胰岛素）加入 500 mL 心肌细胞基础培养基 （RPMI 1640） 来制备分化培养基 #1。
- 通过将 10 mL 补充剂（50x B27 减去胰岛素）加入 500 mL 心肌细胞基础培养基 （RPMI 1640）， 准备分化培养基 #2。
- 通过将补充剂（50x B27加胰岛素）加入500 mL心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）减去葡萄糖来制备纯化培养基#3。
- 内皮生长培养基和磁活化细胞分选（MACS）试剂
- 用市售的内皮细胞生长培养基补充剂试剂盒制备内皮生长培养基（EGM）。
- 通过将牛血清白蛋白（BSA）储备溶液稀释至1：20与漂洗溶液来制备细胞分离分选缓冲溶液。
- 心脏成纤维细胞分化培养基：用成纤维细胞基础培养基（DMEM-高葡萄糖）和无血清成纤维细胞生命因子试剂盒制备心脏成纤维细胞分化培养基。
- 心脏微组织制造和维护培养基：用心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）制备过滤培养基，补充（50x B27加胰岛素）和EGM，比例为70/30 v / v%。
- 小分子和生长因子储备溶液
- 为了分化所有三种细胞类型，制备200μL等分GSK3-β抑制剂 CHIR 99021 （6-[[2-[[4-（2，4-二氯苯基）-5-（5-甲基-1H-咪唑-2-基）-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈）;Wnt抑制剂 IWR-1-endo （4-（1，3，3a，4，7，7a-六氢-1，3-二氧代-4，7-甲基-2H-异吲哚基）-N-8-喹啉基苯甲酰胺;和转化生长因子β（TGF-β）抑制剂 SB431542 （4-[4-（1，3-苯并二氧杂环戊基-5-基）-5-（2-吡啶基）-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺）在二甲基亚砜（DMSO）中浓度为10 mM。
- 对于人iPSC-EC分化，在超纯蒸馏水中制备100μL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（20μg/ mL），血管内皮生长因子165（VEGF165;50μg/ mL）和骨形态发生蛋白4（BMP4;20μg/ mL）等分试样。将等分试样储存在-20°C;对于长期储存，等分试样可以在-80°C下储存长达1年。
- 用于维护 iPSC-CM、iPSC-EC 和 iPSC-CF 的预涂覆板。
- 通过以1：200的比例稀释DMEM / F12中的生长因子还原（GFR）基底膜基质基质培养基，制备基底膜基质介质包被的6孔板用于iPSC-CM重镀。向6孔板的每个孔中加入2mL稀释的基底膜基质培养基，并使其设置至少2至4小时。
- 用明胶预涂6孔板或10厘米培养皿。在37°C的水浴中液化2%明胶溶液，并根据需要在PBS中以适当的体积制备过滤的0.2%（v / v）明胶。使用前用10 mL 0.2%明胶在37°C下包衣培养板至少30分钟。
注：明胶板可用于MACS之后的iPSC-CF和iPSC-EC。
- 微量组织模具的制造：在干燥的100 mL玻璃瓶中制备PBS中的2%低熔点琼脂糖溶液。使用前在121°C，15 psi下灭菌琼脂糖20分钟。将硅胶微模铸造在121°C，15 psi下高压灭菌15分钟。
- 用于消化、免疫染色和流式细胞术的解决方案
- 对于微量酶消化，在PBS中制备Dispase I（1 U / mL）和Liberase（3 U / mL）的酶消化缓冲液。将此溶液放在冰上。
- 对于细胞和微量组织固定，使用含有4.2%多聚甲醛（PFA）的冰镇市售固定试剂。
- 在PBS中制备0.25%的Triton X-100用于透化，0.1%的吐温-20用于洗涤。该溶液可以在室温下储存。
- 对于荧光激活细胞分选（FACS）分析，制备FACS缓冲液[PBS或HBSS与2%胎牛血清（FBS）]并储存在4°C。
- 对于免疫染色，在PBS中制备2%正常的山羊/驴/兔血清。根据抗体培养的宿主选择血清种类。
2. 心脏分化和纯化
注意：在心肌细胞分化之前，所有 iPSC 应保持在 ~75% 至 80% 的汇合度。用于该协议的iPSCs来自外周血单核细胞（PBMC），使用在斯坦福心血管研究所（SCVI）生物库进行的仙台病毒重编程。
- 在分化之前，培养iPSC菌落直至传代（P20）。
- 从6孔板中取出iPSC培养基，并用2mL PBS洗涤细胞一次。
- 在第0天，通过在每个孔中加入2mL具有CHIR（6μM最终）的分化培养基#1来开始介十二菌诱导。对于不同的iPSC谱系，最终浓度可能在6至9μM之间变化。因此，建议在6孔板上测试不同的CHIR浓度，以确定最佳的心脏中胚层诱导。
- 在第2天，通过在每个孔中更换新鲜的2 mL培养基#1来恢复细胞。
- 在第3天，用2 mL分化培养基#1替换每个孔中的培养基，用Wnt抑制剂IWR-1-endo（5μM）诱导心脏谱系规格。
- 在第5天，通过在每个孔中用新鲜的2 mL培养基#1替换培养基来回收细胞。
- 在第7天，用每个孔中的2 mL培养基#2代替培养基。心肌细胞的自发跳动最早可在第8-9天观察到。对于某些细胞系，跳动细胞可能最晚出现在第11天。
- 为了纯化分化培养物，在第10天用2mL减去葡萄糖培养基#3在每个孔中替换。
- 在第13天，通过在每个孔中用2 mL加葡萄糖培养基#2改变培养基来恢复细胞。
- 在第16天，在每个孔中用2 mL培养基#3进行第二轮纯化。
- 在第19天用2 mL加葡萄糖培养基#2恢复细胞。
- 在第20天，用1mL PBS洗涤孔一次，并在37°C下使用1mL 10x胰蛋白酶解离细胞6分钟。 孵育后，将细胞从孔表面提升到单细胞中少于15秒，并加入到15mL锥形管中，具有等体积的培养基#2以中和酶。将细胞悬浮液在270× g下离心3分钟。
- 将细胞沉淀重悬于3mL培养基#3中。计数细胞并添加适当体积的培养基#3，以在新的基底膜基质基质包被的6孔板的每个孔中总共约300万个细胞。在重新接种后的第二天，用新鲜的2 mL培养基#2替换培养基，每隔一天用2 mL培养基#2补充，直到心肌细胞胰蛋白酶消化以进行冷冻或未来的实验。
3. 内皮细胞分化和MACS
- 在75%至80%iPSC汇合处，用PBS洗涤板，每孔2 mL。
- 在第0天开始分化，用2mL分化培养基#1与6μM CHIR代替。
- 在第2天，用2mL分化培养基#1与2μM CHIR代替培养基。
- 在第4天，用2毫升EGM替换培养基，补充20ng bFGF-2，50 ng VEGF165和20ng BMP4。
- 从第6天到第10天，每2天更换2毫升EGM，补充生长因子。在8μM浓度下加入TGFβ抑制剂（SB431542）是可选的，以促进内皮扩增并抑制其他间充质来源细胞类型的分化。
- 在第12天，开始MACS的步骤，用1mL PBS冲洗每个孔，然后在37°C下使用1mL的10x胰蛋白酶在6孔板的每个孔中冲洗细胞解离8分钟。
- 在50 mL锥形管中制备等体积的EGM培养基以中和解离酶。将40μm细胞过滤器放在50mL锥形管上，并将解离的细胞悬浮液通过过滤器。每更换 2 到 3 个解离孔的过滤器。
- 使用血细胞计数器或自动细胞计数器使用0.4%台盼蓝枚举总活细胞。
- 在设置为4°C的预冷离心机中以300× g 沉淀细胞悬浮液5分钟。
- 弃去上清液并根据步骤3.8中的总计数将细胞沉淀重悬于适当体积的分选缓冲液中。
注意：每107 个细胞加入80μL分选缓冲液。 - 对于磁珠标记，每107 个细胞加入20μLFcR阻断试剂，孵育5分钟。
- 每107 个细胞加入20μLCD144或CD31微珠并充分混合。将细胞悬浮液在4°C的黑暗中孵育15分钟。
- 加入20mL分选缓冲液以洗涤标记的细胞，并在设置在4°C的预冷离心机中沉淀细胞300× g 5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于3mL分选缓冲液中，并将其留在冰上。
- 通过将磁分离柱放置在分离器槽口中来准备磁选柱。
- 通过用3 mL分选缓冲液冲洗来平衡色谱柱，并将流收集在废物锥形管中。
- 一旦冲洗缓冲液流过，彻底重悬细胞悬浮液以打破任何团块并将细胞悬浮液施加到色谱柱上。
- 细胞悬浮液流过后，用3mL分选缓冲液洗涤柱三次以除去任何未标记的细胞。
- 从分离器中取出色谱柱，并将其置于15 mL锥形管中，用于CD144 + / CD31 + 细胞洗脱。
- 将5mL分选缓冲液加入色谱柱上，并立即用柱塞冲洗磁性标记的细胞。
- 使用0.4%台盼蓝使用血细胞计数器或自动细胞计数器确定活细胞数量。
- 将细胞悬浮液在预冷的离心机中以300× g 离心3分钟。
- 根据步骤3.21中的总计数，用5-8μM的TGFβ抑制剂（SB431542）将细胞沉淀重悬于适当体积的EGM中。
- 将该传代0（P0）细胞以适当的细胞密度（4×10 4 个细胞/ cm 2）接种在预包被的0.2%明胶板上。
- 对于 P0 和 P1，继续用 TGFβ 抑制剂每 2 天补充一次新鲜 EGM 培养基。从P2开始，细胞可以在没有TGFβ抑制剂的内皮生长培养基中培养。
4. 心脏成纤维细胞分化
- 允许iPSC成为90%至95%的汇合;用 1 mL PBS 清洗每孔。
- 在第0天开始分化，加入2mL分化培养基#1和11μM CHIR。对于敏感的iPSC谱系，浓度可能在9-10μM之间变化。
- 在第1天，观察盘子。观察到显着的细胞死亡是正常的，约30%至40%的细胞粘附在板上。
- 在第3天，加入2mL分化培养基#1和5μM IWR-1-endo，以促进心脏祖细胞的扩增。
- 在第4天，用2mL心脏成纤维细胞分化培养基代替培养基。每2天更换一次新鲜培养基，直到第16天。
- 在第18天，在37°C下使用1mL在6孔板的每个孔中使用1mL10x胰蛋白酶分离细胞。
- 彻底破坏细胞层，并将细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器，该过滤器位于含有等体积DMEM / F12培养基并补充有5%FBS的50 mL锥形管中。
- 使用0.4%台盼蓝使用血细胞计数器或自动细胞计数器确定活细胞数量。
- 将细胞悬浮液以300× g 离心5分钟以获得沉淀。
- 对于第一次重新接种，将细胞沉淀重悬于适当体积的分化培养基中，并在0.2%明胶包衣板上以细胞密度（6×104个细胞/ cm 2）重悬细胞沉淀，直到90%汇合。
- 将板分开并维持常规DMEM / F12中的心脏成纤维细胞，在明胶涂层板上涂有10%血清。
5. 心脏微量组织模具的铸造和细胞接种
- 将琼脂糖放入微波炉中放入100 mL玻璃瓶中融化至沸腾。喷洒琼脂糖瓶并将其放入生物安全柜中。让琼脂糖冷却约3分钟。
- 将700μL熔融琼脂糖移液在9 x 9阵列的有机硅微模中。避免在移液时产生气泡。
- 小心地将模具放在预冷却的冰块上，以加速琼脂糖凝胶化。
- 确保琼脂糖凝胶化后，它变得半透明。小心地弯曲微模具的边缘，以松开琼脂糖复制品。然后，从各个侧面轻轻剥离复制品，将琼脂糖复制品从硅胶微模中分离出来。
- 将含有81个圆形凹槽（直径800μm;深度800μm）的琼脂糖微量组织托盘转移到无菌的12孔板中。
- 将2 mL PBS加入琼脂糖微量组织托盘中，并在显微镜下检查是否有任何捕获的气泡或不规则形状的孔。
- 将琼脂糖托盘浸没在2 mL 70%乙醇中过夜，然后在生物安全柜中进行紫外线处理1小时。
- 使用前，除去70%乙醇，用蒸馏水洗涤两次，最后用2 mL PBS洗涤。
- 胰蛋白酶消化、中和计数 iPSC-CM、iPSC-EC 和 iPSC-CFs，并将细胞悬浮液置于冰上。
- 小心地从孔和细胞接种室中取出PBS，不要触摸凹槽。
- 在新试管中，分别以7：2：1的比例混合iPSC-CM，iPSC-EC和iPSC-CFs，以达到106 个细胞/ mL的最终细胞密度。较高的细胞密度将导致更大的微组织。
注意：不要超过2 x 106 个细胞/毫升。 - 小心地在接种室中滴加200μL细胞悬浮液。
- 让细胞在37°C下在CO2 培养箱中沉降2小时。
- 在琼脂糖模具周围添加微组织制造介质，以仅覆盖内腔的表面。
- 24小时后，细胞自组装并在圆形凹槽中显着致密。每2天更换一次新鲜培养基以进行维护。
6. 细胞和心脏微组织的固定和透化，用于免疫染色
- 对于每种单独的细胞类型，在基底膜基质培养基或明胶包被的腔室载玻片（约2.5-3×105 个细胞/ mL）上单独培养细胞。心脏微量组织可以通过轻轻地将其从圆形凹槽中冲洗出来，将其收集在15 mL锥形管中。
- 吸出培养基并用1 mL PBS冲洗细胞或微量组织;此后，用含有4.2%PFA的固定缓冲液固定20分钟，用于室载玻片，1小时用于室温下的微组织。
- 吸出PFA并加入1mL渗透溶液（PBS中的0.25%Triton X-100），对于腔室载玻片5至7分钟，对于微组织在15mL锥形管中20分钟。
注意：从此步骤开始，样品可以在台式摇摆平台上轻轻摇晃。 - 吸出透化溶液，用 2 至 3 mL PBS 冲洗一次。
- 用500-1，000μL封闭溶液（2%至5%正常山羊血清或驴血清）孵育细胞至少1小时，用于腔室载玻片至少1小时，对于微量组织3至4小时。
- 用在封闭溶液中制备的偶联抗体孵育细胞或心脏微组织，足以覆盖样品。与抗心脏肌钙蛋白-T（cTnT2）（1：50），抗CD31（1：75）和抗DDR2 / Vimentin（1：50）一起孵育1小时用于腔室载玻片，并在4°C下过夜用于心脏微组织。
- 用500μL 0.1%吐温-20洗涤室载玻片三次，每次洗涤和PBS最终洗涤之间5分钟。
- 对于心脏微组织，用2 mL 0.1%吐温-20洗涤五次，每次洗涤间隔20分钟。再进行20分钟的最后一次洗涤步骤。
- 在共聚焦显微镜检查之前，用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（1μg/ mL）孵育细胞或微组织。
- 对于心脏微量组织，小心地转移到35毫米玻璃底皿中，并加入PBS以浸没微量组织。
- 对于3D成像，使用20x或40x油浸物镜获得微量系统的中心焦点，并调整每个荧光团的曝光参数。
- 要获得 Z 轴堆栈，请在实时模式下设置第一个和最后一个坐标，总成像深度为 100-200 μm，切片间隔为 5-10 μm。
7. 心脏微团的消化和流式细胞术细胞的制备
- 要消化微量组织，请使用宽孔径1 mL移液器吸头将带有Medium #1的微组织从圆形凹槽中轻轻冲洗到15 mL锥形管中。
- 让微组织沉降并小心地吸出培养基，并用1mL PBS冲洗细胞或微组织，并在37°C下加入200-300μL酶消化缓冲液20分钟。 在10分钟时，轻轻混合微量组织1分钟，并在剩余时间内再次在37°C下孵育。
- 孵育后，使用常规的1 mL移液器吸头大力混合微组织，以获得浑浊的细胞悬浮液。
- 一旦微量组织被充分消化到单个细胞中，立即用含有5%FBS的5mL培养基中和细胞悬浮液，并通过40μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液。计数细胞总数，并在4°C下以300× g 离心单细胞悬浮液5分钟。
- 吸出上清液，将1 x 105-1 x 10 6 个细胞重悬于100μL膜联蛋白结合缓冲液中，加入FITC膜联蛋白V和100μg/mL碘化丙啶（PI）或To-Pro3死细胞排除染料，在冰上重悬10分钟。
- 孵育后，将300μL膜联蛋白结合缓冲液加入细胞悬浮液中，并转移到圆底FACS管中进行流式细胞术分析。为选定的荧光团使用正确的激光器和发射滤光片。
- 为了使用固定细胞定量细胞表面标记物，如步骤6.2和6.3所述，对细胞沉淀进行固定和透化。
- 通透后，冲洗细胞沉淀并用各自的偶联抗体孵育细胞1小时。在4mL FACS缓冲液（PBS中为2%FBS）中洗涤细胞沉淀，并以300× g 离心3分钟。重复洗涤步骤两次。
- 将细胞重悬于200-300μL FACS缓冲液中，用于流式细胞术分析。
- 使用未染色的样品调整正向和侧面散射特性，并考虑对每个荧光团使用同种型对照来调节激光电压。收集至少 20，000 个事件以进行数据分析。
8. 对自发跳动的心脏微组织进行收缩分析
- 录制心脏微量系统的视频以捕获至少三个节拍。将录制分辨率设置为至少 1280 x 720 像素（帧速率>30 帧/秒），并将视频保存在 中。AVI 格式。
- 在 MATLAB 环境中运行 MotionGUI 脚本11 以启动用户界面。
- 找到 .文件夹中的AVI文件位置以加载视频。然后，在"输入"面板中输入捕获视频的帧速率。
- 在高级输入面板中，可以根据分辨率和捕获放大倍率指定像素大小。
- 可以指定合适的宏块像素大小（默认为16）和可检测的像素运动，具体取决于微量收缩的强度。
- 调整参数后，单击获取 运动矢量 以开始分析。
- 使用" 选择AOI" 单选按钮选择感兴趣的区域，以排除圆形凹槽中单个微量组织周围的区域。
- 使用 函数"映射时间平均值" 可根据在 X 轴和 Y 轴上检测到的运动生成平均收缩热图。
- 对于峰值跟踪数据，请使用 函数获取收缩数据 自动测量收缩和松弛峰值。
- 在信噪比较低的情况下，应用峰值高度和距离阈值以正确注释最大收缩速度（蓝点）和最大弛豫速度（红色三角形）。
- 设置正确的阈值后，选择 分析峰值 以获取具有节拍率和节拍间隔的收缩和松弛值。
- 从至少25个单独的微机构中获取测量值以进行统计分析。
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Representative Results
iPSC 衍生的 CM、EC 和 CF 的免疫染色和流式细胞术表征
为了产生由iPSC-CM，iPSC-EC和iPSC-CFs组成的心脏微组织，所有三种细胞类型都单独分化和表征。在过去几年中，iPSCs与iPSC-CM的 体外 分化有所改善。然而，iPSC-CM的产量和纯度因品系而异。目前的实验方案产生超过75%的纯iPSC-CM，这些iPSC-CM在第9天左右自发地开始跳动（图1A）。如前所述，从第9天到第14天的进一步纯化步骤可以将iPSC-CM纯度提高到80%以上12。类似地，可以使用先前发表的方案13，14 生成高纯度的iPSC-EC，其中包括添加几种血管生长因子，这些因子在第4-5天左右使中胚层产生的内皮祖细胞极化（图1B）以形成表型上定义明确的iPSC-EC。iPSC-CFs是一个高度异质的群体，基于它们的位置，并根据其形态和细胞外基质蛋白的表达进行表征。在这里，使用已发表的方案15，16，17 进行修饰，从心脏中胚层祖细胞中获得人iPSC-CFs（图1C）。
图 1：差异化时间表。 （A）iPSC-CM，（B）iPSC-EC和（C）iPSC-CF分化时间表的总体示意图，以及分化和纯化步骤后细胞的代表性相差图像。比例尺 = 100 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
分别使用cTnT2，血小板内皮细胞粘附分子（PECAM1 / CD31）和vimentin（VIM）通过免疫染色和流式细胞术测定iPSC-CM，iPSC-EC和iPSC-CFs的纯度（图2A）。定量分析显示，在第20天，纯化的群体含有超过90%的cTnT2细胞。使用CD31磁珠在MACS后第12天获得的iPSC-EC被鉴定为针对PECAM1 / CD31内皮细胞表面标志物的免疫染色。MACS产生高纯度的内皮细胞，P0处超过95%的CD31 +细胞证明了这一点。然而，必须注意的是，由于去分化，内皮细胞的纯度随着传代次数的增加而降低。同样，在第20天，流式细胞术分析显示，超过95%的iPSC-CFs表达了成纤维细胞标志物VIM（图2B）。
图2：免疫荧光和流式细胞术表征。 （A）[从左到右图]第25天的iPSC-CM用cTnT2染色（青色），用PECAM1 / CD31染色的iPSC-EC染色（绿色），用VIM染色的iPSC-CFs（红色）和用DAPI染色的细胞核（蓝色）。比例尺 = 50 μm. （B） [从左到右图] 流式细胞术定量显示分化后 iPSC-CM （91.8%）、iPSC-EC （98.1%） 和 iPSC-CFs （96.7%） 纯度较高。 请点击此处查看此图的放大版本。
心脏微量培养物的制备和大小分析
将iPSC-CM，iPSC-EC和iPSC-CFs的单细胞悬浮液以7：2：1的比例混合，并小心地分配到灭菌琼脂糖复制霉菌的细胞接种室中（图3A，B）。细胞在2小时内均匀地沉降在圆形凹槽内。在第3天左右，自组装的细胞组织成大小均匀的自发跳动的心脏微组织（图3C）。不同尺寸的微组织阵列可以通过调整最终的细胞密度来制造（图3D，E）。最终细胞密度为1 x 106 个细胞/ mL的心脏微组织直径约为300-350μm，2 x 106 个细胞/ mL的直径约为600μm，4 x 106 个细胞/ mL的直径超过800μm。微组织组装的细胞密度为1×10 6 个细胞/ mL，通常用于实验。这些微组织培养物可在培养物中维持长达 6 周。
图3：生成多细胞心脏微组织的复制成型技术。 （A）复制模制琼脂糖微孔托盘（B）iPSC-CM，iPSC-EC和iPSC-CF混合物捕获在微孔内进行自组装。比例尺 500 = μm. （C） 显微照片显示第 3 天心脏微组织的压实情况。比例尺= 500μm.（D）形成的心脏微量团尺寸与初始接种密度呈线性关系，细胞密度越高，微量组织越大。（E）显示微孔阵列中自组装的心脏微组织的代表性图。 请点击此处查看此图的放大版本。
酶消化后的免疫染色和活力
使用针对iPSC-CM的cTnT2抗体，用于iPSC-EC的CD31和用于iPSC-CFs的DDR2的抗体对制造后的第12天的免疫荧光染色显示心脏微组织中独特的细胞分布。iPSC-CM是所有三种细胞类型中最重的，占据了中心，而iPSC-EC散布在整个微系统中，观察到iPSC-CFs主要占据外围（图4A）。使用Dispase I和Liberase TL实现的微组织的快速消化导致整体高度活泼的细胞比例（图4B，上图），在培养2周后凋亡细胞小于5%。随后将心脏微组织暴露于高浓度（5μM）的阿霉素中短暂1小时，阿霉素是一种已知可诱导剂量依赖性心脏毒性的化疗药物（图4B，底图）。
图 4：心脏微量组织胞的免疫染色和细胞活力评估。 （A） 用于 iPSC-CM （cTnT2）、iPSC-EC （CD31）、iPSC-CF （DDR2） 和染色的细胞核的人心微量密闭的共聚焦 z-stack 图像。比例尺= 200μm.（B）心脏微量组织的流式细胞术图，酶消化成单细胞悬浮液并用膜联蛋白V（凋亡标记物）和死细胞排除染料（To-Pro3）染色。与用凋亡诱导化疗药物阿霉素处理的单细胞悬浮液相比，消化的单细胞悬浮液显示出高细胞活力（91%），凋亡细胞群为<5%（上图），以5μM浓度处理1小时（下图）。 请点击此处查看此图的放大版本。
计算收缩力分析
单个心脏微机构的收缩力分析可以在基于MATLAB的图像分析工具的帮助下进行。以30 fps的速度获得自发跳动的心脏微组织的视频记录进行分析。如前所述11，块匹配方法采用运动跟踪算法来捕获作为运动矢量的时间序列获取的总帧的像素块的运动。微机构的收缩性和载体的运动生成伪热图，该热图说明了整个微组织的均值或平均收缩曲线（图5A）。心脏微系统的收缩运动产生正峰，其测量为收缩速度（蓝色圆圈），弛豫速度（红色三角形）和跳动速率，其中最后一个被计算为两个收缩周期之间的时间（图5B）。此外，心脏微组织在培养物中4周内没有显着变化（图5C）。
图5：心脏微组织的收缩分析（A）制造后1周心脏微组织的相差图像和收缩图。比例尺 = 200 μm. （B） 心脏微机构显示规律的收缩和松弛曲线以及心跳率。表显示了拍频、最大收缩和松弛速度的代表性值。（C）心脏微机构的长期培养长达4周不会显着影响收缩性参数（n = 20 /组）。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
为了从预分化的iPSC-CM，iPSC-EC和iPSC-CFs中产生心脏微组织，在心脏微组织内接触抑制细胞压实后，必须获得高纯度的培养物以更好地控制细胞数量。最近，贾科梅利等人。al.18 已经证明了使用iPSC-CM，iPSC-EC和iPSC-CF制造心脏微组织。使用所述方法生成的心脏微组织由约5，000个细胞组成（70%iPSC-CM，15%iPSC-EC和15%iPSC-CF）。在该方法中，心肌细胞和内皮细胞共分化，然后使用CD34 +标记物分离内皮祖细胞。这里描述的当前方案由每个微量组织12，000个细胞（70%iPSC-CM，20%iPSC-EC和10%iPSC-CFs）组成，每个构建体产生更高的细胞数，用于下游单细胞分析。此外，由于所有三种细胞类型都是单独分化的，因此细胞群中的异质性有限，这对于理解细胞对治疗的特异性反应是独一无二的。
对于心肌细胞分化，我们和其他人之前已经使用化学定义的培养条件证明了纯心肌细胞的衍生12，19，20。简而言之，分化始于中胚层诱导，然后是Wnt / β-连环蛋白信号传导的调节，以促进心脏谱系规范。在葡萄糖剥夺的培养基中进一步纯化心肌细胞可以消除非心肌细胞。在这里，重要的是要注意，在纯化培养基中长时间培养会阻碍心肌细胞的质量。最近发表的一项方案显示，可以利用早期心肌细胞的增殖能力来获得大量细胞。人类iPSC-CM的扩增是通过重新引入CHIR诱导的，CHIR是早期增殖阶段的一种有效的有丝分裂原21。虽然确切的分子机制尚不清楚，但该技术可以显着提高iPSC-CM产量十倍或一百倍。此外，为了提高iPSC-CM在疾病建模中的保真度，可以在成熟培养基中培养它们，以增强电生理，机械和结构成熟22。有关 iPSC-CM 成熟技术的全面概述，详见其他部分23。
血管内皮细胞由具有不同纯化可变效率的多能干细胞产生13，24，25。目前的协议提供了高分化效率和选择具有MACS26的表型稳定的iPSC-EC。产生功能性心脏成纤维细胞的分化方法遵循Wnt途径和成纤维细胞生长因子（FGF）信号传导的调节以产生iPSC-CFs17。体内CF起源于上饍、心内膜和神经嵴祖16、27、28、29。在这里，CF谱系是从承诺的中胚层心脏祖细胞产生的，而不产生心外膜细胞作为中间体。总体而言，此处描述的生成iPSC-CM，iPSC-EC和iPSC-CF的方案考虑了基于表型特征的易重复性和高纯度。为了获得高质量的微量组织，重要的是要获得每种细胞类型的>90%纯度。细胞表型中更高的纯度也将确保检测由于不同处理而导致的细胞轨迹变化。
在成功衍生出所有三种细胞类型后，将细胞小心地分配到琼脂糖接种室中，以使细胞在圆形凹槽中沉降。关键参数包括实现均匀的单细胞悬浮液和防止可能导致心脏微组织大小分布变化的细胞聚集体或团块。从整体结构的角度来看，3D结构通常受到营养物质扩散的限制，并且随着细胞密度的增加，结构的大小和厚度也线性增加。球形结构形式的组织工程结构由于各向同性扩散性和从核心到表面的固定距离而具有均匀的养分消耗率30，31。微量系统的最终大小决定了营养物质的浓度梯度和氧气向中心的扩散。在静态培养系统中，超过350-400μm的构建体在长时间培养时可能导致坏死细胞核心。因此，应仔细考虑播种密度。心脏微量组织模型的局限性在于，它不允许涉及单细胞几何限制的方法提供的心肌细胞排列。因此，由于随机多维细胞组装，诸如肌节比对或长度之类的参数的定量仍然受到限制。尽管有局限性，但该技术可以快速评估药物或小分子对心血管细胞的毒性32。在最近的一项研究中，我们采用由iPSC-CM组成的3D微组织来模拟继发性铁过载诱导的心肌病，并且由于高浓度的铁处理，我们观察到微量组织的大小显着减小33。
在免疫染色方面，与2D培养物不同，需要更长的通透性和一抗孵育持续时间，以允许抗体在整个微组织中扩散。对于直径大于~400μm的微组织，充分抗体渗透的孵育时间可能需要进一步优化。另一个重要方面是用血清蛋白进行更长的阻断步骤，以减少由非特异性结合引起的背景荧光。通常，优选含有高IgG水平的阻断血清，例如山羊或驴血清。为了保持心脏微组织的结构完整性，我们尚未探测参与特定细胞 - 细胞相互作用的蛋白质及其在培养期间的维持。对于细胞表型，必须在短时间内消化微组织，以确保高细胞活力和目标细胞外抗原的保存。酶消化和机械破碎与宽口径移液器吸头相结合，可以在消化过程中对微组织进行有效和温和的处理。通过这种快速消化方案获得的高质量活单细胞可用于在scRNA-seq34，35，36的帮助下阐明复杂的生物细胞 - 细胞相互作用。
除了形态学和结构表征外，评估心脏微组织的功能特性以评估 体外组织组件的功效，毒性和疾病状态也很重要。组织收缩的定量分析是评估心脏功能的相关参数。几种非侵入性视频显微镜技术与运动跟踪算法相结合，通过对与表型特征相关的心脏组织收缩进行稳健的测量，实现了实时监测。为了量化表型的变化，心脏微组织可以在 体外 维持长达4周，而不会发生显着的收缩参数变化。大多数软件算法基于光流和矢量映射的原理工作，这些原理叠加在捕获的一系列视频帧上11，37，38。光流分析可能导致伪影的检测;因此，用户应避免或尽量减少可能导致样品移动或振动传递到显微镜载物台的无意周围干扰。必须注意的是，收缩力分析可能无法检测到由于微组织悬挂形式而导致的被动张力或负载效应，这与在预定义刚度的柔性柱之间形成的微组织相反。然而，在这两种情况下，重要的是要注意，工程心肌组织的收缩曲线不会实现器官水平产生的收缩力。基于图像的检测的主要优点是它们是非破坏性的，并且无需大量校准即可测量急性和慢性药物暴露。这些工具可以应用于各种2D和3D平台，以测量由于治疗或潜在遗传疾病引起的心脏收缩力的变化，并评估组织成熟策略。这种微量测定模型的未来研究可能涉及结合电生理测量，这将允许同时记录钙或电压敏感染料，以高通量方式获得阵列中每个微量组织的多个独立记录。
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Disclosures
J.C.W.是Khloris Biosciences的联合创始人，但没有竞争利益，因为这里介绍的工作是完全独立的。其他作者报告没有冲突。
Acknowledgments
我们感谢Amanda Chase博士对手稿的有益反馈。资金支持由加州大学烟草相关疾病研究计划（TRDRP）T29FT0380（D.T.）和27IR-0012（J.C.W.）提供;美国心脏协会 20POST35210896 （H.K.） 和 17MERIT33610009 （J.C.W.）;和美国国立卫生研究院 （NIH） R01 HL126527、R01 HL123968、 R01 HL150693、R01 HL141851 和 NIH UH3 TR002588 （J.C.W）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
References
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