Methodenartikel

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

DOI:

10.3791/61879

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14. März 2021

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1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Erzeugung von humanen Kardiomyozyten (CMs), kardialen Fibroblasten (CFs) und Endothelzellen (ECs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) bot eine einzigartige Gelegenheit, das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen kardiovaskulären Zelltypen zu untersuchen, das die Gewebeentwicklung und -krankheit antreibt. Im Bereich der Herzgewebemodelle verwenden mehrere ausgeklügelte dreidimensionale (3D) Ansätze induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs), um die physiologische Relevanz und die native Gewebeumgebung mit einer Kombination aus extrazellulären Matrizen und Vernetzern nachzuahmen. Diese Systeme sind jedoch ohne Mikrofabrikationskenntnisse komplex herzustellen und benötigen mehrere Wochen für die Selbstmontage. Am wichtigsten ist, dass vielen dieser Systeme Gefäßzellen und Herzfibroblasten fehlen, die über 60% der Nichtmyozyten im menschlichen Herzen ausmachen. Hier beschreiben wir die Ableitung aller drei Herzzelltypen aus iPS-Zellen zur Herstellung kardialer Mikrogewebe. Diese einfache Replik-Formgebungstechnik ermöglicht die kardiale Mikrobearbeitungskultur in Standard-Multi-Well-Zellkulturplatten für mehrere Wochen. Die Plattform ermöglicht eine benutzerdefinierte Kontrolle über Mikrogewebegrößen basierend auf der anfänglichen Seeding-Dichte und benötigt weniger als 3 Tage für die Selbstorganisation, um beobachtbare kardiale Mikrogewebekontraktionen zu erreichen. Darüber hinaus können die kardialen Mikrogewebe leicht verdaut werden, während eine hohe Zelllebensfähigkeit für die Einzelzellbefragung unter Verwendung von Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) erhalten bleibt. Wir stellen uns vor, dass dieses In-vitro-Modell von kardialen Mikrogeweben dazu beitragen wird, Validierungsstudien in der Arzneimittelentdeckung und Krankheitsmodellierung zu beschleunigen.

Einleitung

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Die Wirkstoffforschung und Krankheitsmodellierung im Bereich der kardiovaskulären Forschung steht aufgrund des Mangels an klinisch relevanten Proben und unzureichender translationaler Werkzeuge vor mehreren Herausforderungen1. Hochkomplexe präklinische Modelle oder stark vereinfachte in vitro Einzelzellmodelle zeigen keine pathophysiologischen Bedingungen in reproduzierbarer Weise. Daher haben sich mehrere miniaturisierte Tissue-Engineering-Plattformen entwickelt, um die Lücke zu schließen, mit dem Ziel, ein Gleichgewicht zwischen einfacher Anwendung in hochdurchsatziger Weise und einer getreuen Rekapitulation der Gewebefunktion zu erreichen2,3. Mit dem Aufkommen der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) können Tissue-Engineering-Werkzeuge auf patientenspezifische Zellen mit oder ohne zugrunde liegenden Kardioerkrankungen angewendet werden, um Forschungsfragen zu beantworten4,5,6. Solche Gewebemodelle mit einer zellulären Zusammensetzung, die dem Herzgewebe ähnelt, könnten in der Arzneimittelentwicklung verwendet werden, um auf Kardiotoxizität und Dysfunktion zu testen, die durch pathologische Verhaltensänderungen eines oder mehrerer Zelltypen induziert werden.

Selbstorganisierte Mikrogewebe oder Organoide, die von menschlichen iPS-Zellen abgeleitet sind, sind dreidimensionale (3D) Strukturen, bei denen es sich um gewebeähnliche Miniaturanordnungen handelt, die funktionelle Ähnlichkeiten mit ihren In-vivo-Gegenstücken aufweisen. Es gibt verschiedene Ansätze, die die Bildung von Organoiden in situ durch gerichtete Differenzierung von iPS-Zellen oder durch die Bildung von embryoiden Körpern ermöglichen4. Die resultierenden Organoide sind ein unverzichtbares Werkzeug, um morphogenetische Prozesse zu untersuchen, die die Organogenese antreiben. Das Vorhandensein einer Vielzahl von Zellpopulationen und Unterschiede in der Selbstorganisation können jedoch zu einer Variabilität der Ergebnisse zwischen verschiedenen Organoiden führen5. Alternativ sind vordifferenzierte Zellen, die selbst zu Mikrogeweben mit gewebespezifischen Zelltypen zusammengesetzt sind, um lokale Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen, hervorragende Modelle, bei denen es möglich ist, die selbstorganisierten Komponenten zu isolieren. Insbesondere in der humanen Herzforschung hat sich die Entwicklung von 3D-Herzmikrogeweben mit mehrzelligen Komponenten als Herausforderung erwiesen, wenn Zellen aus verschiedenen Patientenlinien oder kommerziellen Quellen gewonnen werden.

Um unser mechanistisches Verständnis des Zellverhaltens in einem physiologisch relevanten, personalisierten In-vitro-Modell zu verbessern, sollten idealerweise alle Komponentenzelltypen aus derselben Patientenlinie abgeleitet werden. Im Kontext eines menschlichen Herzens würde ein wirklich repräsentatives kardiales In-vitro-Modell das Crosstalk zwischen vorherrschenden Zelltypen erfassen, nämlich Kardiomyozyten (CMs), Endothelzellen (ECs) und Herzfibroblasten (CFs)6,7. Die originalgetreue Rekapitulation eines Myokards erfordert nicht nur biophysikalische Dehnung und elektrophysiologische Stimulation, sondern auch Zell-Zell-Signale, die von unterstützenden Zelltypen wie ECs und CFs8 ausgehen. CFs sind an der Synthese der extrazellulären Matrix und der Aufrechterhaltung der Gewebestruktur beteiligt; und in einem pathologischen Zustand können CFs Fibrose induzieren und die elektrische Leitung im CMs9 verändern. In ähnlicher Weise können ECs die kontraktilen Eigenschaften von CMs durch parakrine Signalgebung regulieren und lebenswichtige Stoffwechselanforderungen liefern10. Daher besteht ein Bedarf an humanen kardialen Mikrogeweben, die aus allen drei Hauptzelltypen bestehen, um physiologisch relevante Hochdurchsatzexperimente durchführen zu können.

Hier beschreiben wir einen Bottom-up-Ansatz bei der Herstellung von kardialen Mikrogeweben durch Ableitung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs), iPSC-abgeleiteten Endothelzellen (iPSC-ECs) und iPSC-abgeleiteten kardialen Fibroblasten (iPSC-CFs) und ihrer 3D-Kultur in einheitlichen kardialen Mikrogewebe-Arrays. Diese einfache Methode zur Erzeugung spontan schlagender kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und das schnelle Testen von Medikamenten zum funktionellen und mechanistischen Verständnis der Herzphysiologie verwendet werden. Darüber hinaus könnten solche mehrzelligen kardialen Mikrogewebeplattformen mit Genom-Editing-Techniken genutzt werden, um das Fortschreiten der Herzkrankheit im Laufe der Zeit unter chronischen oder akuten Kulturbedingungen nachzuahmen.

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Protokoll

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1. Medium, Reagenz, Zuchtplattenvorbereitung

  1. Zellwaschlösung für die Zellkultur: Verwenden Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calcium oder Magnesium.
  2. Kardiomyozyten-Differenzierungsmedien
    1. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium Nr. 1 vor, indem Sie 10 ml Ergänzung (50x B27 plus Insulin) zu 500 ml Kardiomyozyten-Basalmedium (RPMI 1640) hinzufügen.
    2. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium Nr. 2 vor, indem Sie 10 ml Ergänzung (50x B27 minus Insulin) zu 500 ml Kardiomyozyten-Basalmedium (RPMI 1640) hinzufügen.
    3. Bereiten Sie das Reinigungsmedium Nr. 3 vor, indem Sie ergänzung (50x B27 plus Insulin) zu 500 ml Kardiomyozyten-Basalmedium (RPMI 1640) minus Glukose hinzufügen.
  3. Endothel-Wachstumsmedien und MACS-Reagenzien (Magnetic-activated cell sorting)
    1. Bereiten Sie endotheliales Wachstumsmedium (EGM) mit dem kommerziell erhältlichen Endothelzellwachstumsmedium-Ergänzungskit vor.
    2. Bereiten Sie die Pufferlösung für die Zelltrennungssortierung vor, indem Sie die Rinderserumalbumin (BSA) -Stammlösung mit Spüllösung auf 1:20 verdünnen.
  4. Kardiales Fibroblasten-Differenzierungsmedium: Bereiten Sie ein kardiales Fibroblasten-Differenzierungsmedium mit Fibroblasten-Basalmedium (DMEM-hohe Glukose) und serumfreiem Fibroblasten-Lebensfaktoren-Kit vor.
  5. Herstellung und Erhaltungsmedium für kardiale Mikroapparate: Herstellung eines gefilterten Mediums mit Kardiomyozyten-Basalmedium (RPMI 1640) mit Nahrungsergänzungsmittel (50x B27 plus Insulin) und EGM im Verhältnis 70/30 v/v%.
  6. Kleinmolekulare und Wachstumsfaktor-Aktienlösungen
    1. Zur Differenzierung aller drei Zelltypen werden 200 μL Aliquots des GSK3-beta-Inhibitors CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorphenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridincarbonitril) hergestellt; Wnt-Inhibitor IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-chinolinyl-Benzamid; und transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-β) Inhibitor SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamid) bei 10 mM Konzentration in Dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Für die humane iPSC-EC-Differenzierung werden 100 μL Aliquots des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors (bFGF) (20 μg/ml), des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors 165 (VEGF165; 50 μg/ml) und des knochenmorphogenetischen Proteins 4 (BMP4; 20 μg/ml) in 0,1% (w/v) BSA in hochreinem destilliertem Wasser hergestellt. Die Aliquots bei -20 °C lagern; für die Langzeitlagerung können Aliquots bei -80 °C bis zu 1 Jahr gelagert werden.
  7. Vorbeschichtungsplatten für die Wartung von iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs.
    1. Bereiten Sie mit 6-Well-Platten beschichtete 6-Well-Platten für die iPSC-CM-Neubeschichtung durch Verdünnung des Wachstumsfaktors reduzierten (GFR) Kellermembranmatrixmediums in DMEM/F12 im Verhältnis 1:200 vor. Geben Sie 2 ml verdünntes Basalmembranmatrixmedium in jede Vertiefung der 6-Well-Platte und lassen Sie es für mindestens 2 bis 4 h aushärten.
    2. 6-Well-Teller oder 10 cm Schale mit Gelatine vorbeschichten. 2%ige Gelatinelösung in einem Wasserbad bei 37 °C verflüssigen und filtriert 0,2% (v/v) Gelatine in PBS in einem geeigneten Volumen nach Bedarf zubereiten. Beschichten Sie die Kulturplatte vor Gebrauch mindestens 30 min bei 37 °C mit 10 ml 0,2% Gelatine.
      HINWEIS: Gelatineplatten können sowohl für iPSC-CFs als auch für iPSC-ECs nach MACS verwendet werden.
  8. Herstellung von Mikrozeugformen: Bereiten Sie 2% niedrigschmelzende Agaroselösung in PBS in einer trockenen 100 ml Glasflasche vor. Sterilisieren Sie die Agarose bei 121 °C, 15 psi für 20 min vor Gebrauch. Autoklavieren Sie die Gießsilikon-Mikroformen bei 121 °C, 15 psi für 15 min.
  9. Lösungen für Verdauung, Immunfärbung und Durchflusszytometrie
    1. Für die Mikrogewebeverdauung ist ein Enzymverdauungspuffer aus Dispase I (1 U/ml) und Liberase (3 U/ml) in PBS herzustellen. Halten Sie diese Lösung auf Eis.
    2. Verwenden Sie sowohl für die Zell- als auch für die Mikroetikettenfixierung eiskalte, handelsübliche Fixierungsreagenz, das 4,2% Paraformaldehyd (PFA) enthält.
    3. Bereiten Sie 0,25% Triton X-100 in PBS für die Permeabilisierung und 0,1% Tween-20 für Wäschen vor. Die Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
    4. Für fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalysen (FACS) FACS-Puffer [PBS oder HBSS mit 2% fetalem Rinderserum (FBS)] herstellen und bei 4 °C lagern.
    5. Bereiten Sie zur Immunfärbung 2% normales Ziegen-/Esel-/Kaninchenserum in PBS vor. Wählen Sie die Serumspezies basierend auf dem Wirt, in dem die Antikörper aufgezogen wurden.

2. Herzdifferenzierung und -reinigung

HINWEIS: Alle iPS-Zellen sollten vor der Kardiomyozytendifferenzierung bei ~ 75% bis 80% Konfluenz gehalten werden. iPS-Zellen, die für dieses Protokoll verwendet wurden, wurden aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung der Sendai-Virus-Reprogrammierung abgeleitet, die in der Biobank des Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) durchgeführt wurde.

  1. Vor der Differenzierung kultivieren iPSC-Kolonien bis zur Passage (P20).
  2. Entfernen Sie das iPSC-Kulturmedium von der 6-Well-Platte und waschen Sie die Zellen einmalig mit 2 ml PBS.
  3. Beginnen Sie am Tag 0 mit der Mesendoderm-Induktion, indem Sie 2 ml Differenzierungsmedium Nr. 1 mit CHIR (6 μM final) in jede Vertiefung geben. Die Endkonzentration kann für verschiedene iPSC-Leitungen zwischen 6 und 9 μM variieren. Daher wird empfohlen, verschiedene CHIR-Konzentrationen auf einer 6-Well-Platte zu testen, um eine optimale kardiale Mesoderm-Induktion zu identifizieren.
  4. Am Tag 2 erholen Sie die Zellen, indem Sie sie durch frisches 2 ml Medium # 1 in jedem Bohrloch ersetzen.
  5. Ersetzen Sie an Tag 3 das Medium in jeder Vertiefung durch das 2 ml Differenzierungsmedium Nr. 1 durch den Wnt-Inhibitor IWR-1-endo (5 μM), um die Spezifikation der Herzlinie zu induzieren.
  6. Am Tag 5 erholen Sie die Zellen, indem Sie medium durch frisches 2 ml Medium # 1 in jedem Bohrloch ersetzen.
  7. Ersetzen Sie an Tag 7 Medium durch 2 ml Medium #2 in jedem Bohrloch. Spontanes Schlagen von Kardiomyozyten kann bereits am Tag 8-9 beobachtet werden. Bei einigen Linien können schlagende Zellen erst am Tag 11 auftreten.
  8. Zur Reinigung der Differenzierungskultur ersetzen Sie durch 2 ml minus Glucose Medium #3 in jeder Vertiefung am Tag 10.
  9. Am Tag 13 erholen Sie die Zellen, indem Sie das Medium mit 2 ml plus Glukose Medium # 2 in jeder Vertiefung wechseln.
  10. Führen Sie an Tag 16 eine zweite Reinigungsrunde mit 2 ml Medium # 3 in jedem Bohrloch durch.
  11. Erholen Sie die Zellen am Tag 19 mit 2 ml plus Glukose Medium # 2.
  12. Am 20. Tag die Vertiefungen einmal mit 1 ml PBS waschen und die Zellen mit 1 ml 10x Trypsin für 6 min bei 37 °C dissoziieren. Nach der Inkubation werden die Zellen für weniger als 15 s von der Bohrlochoberfläche in einzelne Zellen abgehoben und in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit gleichem Volumen von Medium # 2 gegeben, um das Enzym zu neutralisieren. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 3 min bei 270 x g.
  13. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml Medium #3. Zählen Sie die Zellen und fügen Sie das entsprechende Volumen von Medium # 3 hinzu, um insgesamt ~ 3 Millionen Zellen in jeder Vertiefung einer neuen Basalmembranmatrix-Medium-beschichteten 6-Well-Platte zu erfassen. Ersetzen Sie am zweiten Tag nach der erneuten Beschichtung das Medium durch frisches 2 ml Medium Nr. 2 und füllen Sie es jeden zweiten Tag mit 2 ml Medium Nr. 2 auf, bis die Kardiomyozyten zum Einfrieren oder für zukünftige Experimente trypsinisiert werden.

3. Endothelzelldifferenzierung und MACS

  1. Bei 75% bis 80% iPSC-Konfluenz waschen Sie die Platte mit PBS, 2 ml pro Vertiefung.
  2. Beginnen Sie die Differenzierung an Tag 0, indem Sie Medium #1 durch 2 ml Differenzierung durch 6 μM CHIR ersetzen.
  3. Ersetzen Sie an Tag 2 das Medium durch 2 ml Differenzierungsmedium Nr. 1 durch 2 μM CHIR.
  4. Ersetzen Sie am Tag 4 das Medium durch 2 ml EGM, ergänzt durch 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 und 20 ng BMP4.
  5. Wechseln Sie das Medium mit 2 ml EGM, ergänzt mit Wachstumsfaktoren alle 2 Tage von Tag 6 bis Tag 10. Die Zugabe von TGFβ-Inhibitor (SB431542) bei einer Konzentration von 8 μM ist optional, um die endothelale Expansion zu fördern und die Differenzierung anderer Mesenchymalzelltypen zu unterdrücken.
  6. Beginnen Sie am Tag 12 mit den Schritten für MACS, indem Sie jede Vertiefung mit 1 ml PBS spülen, gefolgt von einer Zelldissoziation mit 1 ml 10x Trypsin in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte für 8 minuten bei 37 ° C.
  7. Bereiten Sie ein gleiches Volumen EGM-Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen vor, um das Dissoziationsenzym zu neutralisieren. Legen Sie ein 40 μm Zellsieb auf das 50 ml konische Rohr und führen Sie die dissoziierte Zellsuspension durch das Sieb. Wechseln Sie den Filter für alle 2 bis 3 dissoziierten Vertiefungen.
  8. Zählen Sie die gesamten lebensfähigen Zellen mit 0,4% Trypanblau mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler auf.
  9. Pelletieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min in einer vorgekühlten Zentrifuge, die auf 4 °C eingestellt ist.
  10. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Sortierpuffervolumen basierend auf der Gesamtzahl in Schritt 3.8.
    HINWEIS: Fügen Sie 80 μL Sortierpuffer pro 107 Zellen hinzu.
  11. Für die magnetische Perlenmarkierung 20 μL FcR Blocking Reagenz pro 107 Zellen hinzufügen und 5 min inkubieren.
  12. Fügen Sie 20 μL CD144 oder CD31 Microbeads pro 107 Zellen hinzu und mischen Sie gut. Inkubieren Sie die Zellsuspension im Dunkeln bei 4 °C für 15 min.
  13. Fügen Sie 20 mL Sortierpuffer hinzu, um die markierten Zellen zu waschen, und pelletieren Sie die Zellen 300 x g für 5 min in einer vorgekühlten Zentrifuge, die auf 4 ° C eingestellt ist.
  14. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml Sortierpuffer und lassen Sie es auf Eis.
  15. Bereiten Sie eine magnetische Trennsäule vor, indem Sie die Säule in die Trennkerbe legen.
  16. Gleichsetzen Sie die Säule durch Spülen mit 3 ml Sortierpuffer und sammeln Sie den Durchfluss in einem konischen Abfallrohr.
  17. Sobald der Spülpuffer durchströmt ist, resuspendieren Sie die Zellsuspension gründlich, um Klumpen zu brechen, und tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf.
  18. Nachdem die Zellsuspension durchgeflossen ist, waschen Sie die Säule dreimal mit 3 ml Sortierpuffer, um nicht markierte Zellen zu entfernen.
  19. Entfernen Sie die Säule vom Separator und legen Sie sie in ein konisches 15-ml-Rohr für die CD144+/CD31+- Zellelution.
  20. Geben Sie 5 ml Sortierpuffer auf die Säule und spülen Sie sofort die magnetisch markierten Zellen mit dem Kolben.
  21. Bestimmen Sie die lebensfähige Zellzahl mit 0,4% Trypanblau mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
  22. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension in einer vorgekühlten Zentrifuge bei 300 x g für 3 min.
  23. Resuspendieren Sie das Zellpellet in geeignetem Volumen VON EGM mit 5-8 μM TGFβ-Inhibitor (SB431542) basierend auf der Gesamtanzahl in Schritt 3.21.
  24. Platten Sie diese Passage 0 (P0) Zellen bei einer geeigneten Zelldichte (4 x 104 Zellen/cm2) auf einer vorbeschichteten 0,2% Gelatineplatte.
  25. Für P0 und P1 das Medium weiterhin alle 2 Tage mit frischem EGM mit TGFβ-Inhibitor auffüllen. Ab P2 können Zellen in endothelialem Wachstumsmedium ohne TGFβ-Inhibitor kultiviert werden.

4. Kardiale Fibroblastendifferenzierung

  1. Zulassen, dass iPS-Zellen zu 90% bis 95% konfluent werden; Waschen Sie jeden Brunnen mit 1 ml PBS.
  2. Beginnen Sie die Differenzierung an Tag 0, indem Sie 2 ml Differenzierung Medium #1 mit 11 μM CHIR hinzufügen. Bei empfindlichen iPSC-Linien kann die Konzentration zwischen 9-10 μM variieren.
  3. Beobachten Sie am Tag 1 die Platte. Es ist normal, einen signifikanten Zelltod mit ~ 30% bis 40% Zellen zu beobachten, die an der Platte haften.
  4. Fügen Sie an Tag 3 2 ml Differenzierungsmedium Nr. 1 mit 5 μM IWR-1-Endo hinzu, um die Expansion der kardialen Vorläufer zu fördern.
  5. Ersetzen Sie an Tag 4 das Medium durch 2 ml kardiales Fibroblasten-Differenzierungsmedium. Ersetzen Sie alle 2 Tage bis zum 16. Tag durch frisches Medium.
  6. Am Tag 18 lösen Sie die Zellen mit 1 ml 10x Trypsin in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte für 10 min bei 37 °C.
  7. Brechen Sie die Zellschicht gründlich auf und führen Sie die Zellsuspension durch ein 70 μm Zellsieb in einem 50 ml konischen Röhrchen, das das gleiche Volumen an DMEM/F12-Medium enthält, das mit 5% FBS ergänzt wird.
  8. Bestimmen Sie die lebensfähige Zellzahl mit 0,4% Trypanblau mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
  9. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min, um ein Pellet zu erhalten.
  10. Für die erste Neubeschichtung wird das Zellpellet in einem geeigneten Volumen des Differenzierungsmediums und der Platte mit einer Zelldichte (6 x 104 Zellen/cm2) auf einer 0,2% mit Gelatine beschichteten Platte bis zu 90% Konfluenz resuspendiert.
  11. Teilen Sie die Platte auf und halten Sie die Herzfibroblasten in normalem DMEM/F12 mit 10% Serum auf gelatinebeschichteten Platten.

5. Gießen von kardialen Mikrogewebeformen und Zellaussaat

  1. Schmelzen Sie die Agarose in der Mikrowelle in einer 100 ml Glasflasche bis zum Kochen. Besprühen Sie die Agaroseflasche und legen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. Lassen Sie die Agarose ~3 min abkühlen.
  2. 700 μL geschmolzene Agarose werden in einer Silikon-Mikroform von 9 x 9 Array pipettiert. Vermeiden Sie es, beim Pipettieren Blasen zu erzeugen.
  3. Legen Sie die Form vorsichtig auf einen vorgekühlten Eisblock, um die Agarosegelation zu beschleunigen.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Agarose, sobald sie geliert ist, durchscheinend wird. Biegen Sie vorsichtig um die Kanten der Mikroform, um die Agarose-Replik zu lösen. Dann schälen Sie die Replik vorsichtig von allen Seiten, um die Agarose-Replik von der Silikon-Mikroform zu lösen.
  5. Die Agarose-Mikrogeschirrschale mit 81 kreisförmigen Aussparungen (800 μm Durchmesser; 800 μm Tiefe) wird in eine sterile 12-Well-Platte überführt.
  6. Geben Sie 2 ml PBS in die Agarose-Mikrogeschirrschale und untersuchen Sie unter dem Mikroskop auf eingeschlossene Blasen oder unregelmäßig geformte Vertiefungen.
  7. Tauchen Sie die Agaroseschale über Nacht in 2 ml 70% Ethanol, gefolgt von einer UV-Behandlung in der Biosicherheitskabine für 1 h.
  8. Vor Gebrauch das 70% ige Ethanol entfernen und zweimal mit destilliertem Wasser und einer abschließenden Wäsche mit 2 ml PBS waschen.
  9. Trypsinisieren, neutralisieren und zählen Sie iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs und legen Sie die Zellsuspensionen auf Eis.
  10. Entfernen Sie das PBS vorsichtig aus dem Brunnen und der Zellensaatkammer, ohne die Vertiefungen zu berühren.
  11. Mischen Sie in einem neuen Röhrchen iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs im Verhältnis 7:2:1, um eine endgültige Zelldichte von 106 Zellen/ml zu erreichen. Höhere Zelldichten führen zu größeren Mikrogeweben.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 2 x 106 Zellen/ml.
  12. Die 200 μL der Zellsuspension tropfenweise in die Aussaatkammer vorsichtig geben.
  13. Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in einem CO2-Inkubator für 2 h absetzen.
  14. Fügen Sie das Herstellungsmedium für Mikrogewebe hinzu, das die Agaroseform umgibt, um nur die Oberfläche der inneren Kammer abzudecken.
  15. Nach 24 h setzen sich die Zellen selbst zusammen und verdichten sich deutlich in den kreisförmigen Vertiefungen. Ersetzen Sie es alle 2 Tage zur Wartung durch frisches Medium.

6. Fixierung und Permeabilisierung von Zellen und kardialen Mikrogeweben zur Immunfärbung

  1. Für jeden einzelnen Zelltyp werden die Zellen separat auf Basalmembranmatrixmedium oder gelatinebeschichteten Kammerobjektträgern (ca. 2,5-3 x 105 Zellen/ml) kultiviert. Herzmikrogewebe können in einem konischen 15-ml-Röhrchen gesammelt werden, indem sie sanft aus den kreisförmigen Vertiefungen gespült werden.
  2. Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie die Zellen oder Mikrogewebe mit 1 ml PBS aus; anschließend mit dem Fixierpuffer, der 4,2% PFA enthält, für 20 min für die Kammerobjektträger und 1 h für Mikropartikel bei Raumtemperatur fixieren.
  3. Aspirieren Sie die PFA und geben Sie 1 ml permeabilisierende Lösung (0,25% Triton X-100 in PBS) für 5 bis 7 min für Kammerobjektträger und 20 min für Mikropartikel in 15 mL konischem Rohr hinzu.
    HINWEIS: Ab diesem Schritt können die Proben auf einer Schaukelplattform auf dem Tisch sanft geschaukelt werden.
  4. Die permeabilisierende Lösung absaugen und einmal mit 2 bis 3 ml PBS abspülen.
  5. Inkubieren Sie die Zellen mit 500-1.000 μL Blocklösung (2% bis 5% normales Ziegenserum oder Eselserum) für mindestens 1 h für die Kammerobjektträger und 3 bis 4 h für die Mikrogewebe.
  6. Inkubieren Sie die Zellen oder kardialen Mikrogewebe mit konjugierten Antikörpern, die in der Blocklösung hergestellt wurden, um die Probe ausreichend zu bedecken. Inkubieren Sie mit antiherziellem Troponin-T (cTnT2) (1:50), Anti-CD31 (1:75) und Anti-DDR2/Vimentin (1:50) für 1 h für die Kammerobjektträger und über Nacht bei 4 °C für kardiale Mikrobeschwerden.
  7. Waschen Sie die Kammerschieber dreimal mit 500 μL 0,1% Tween-20 für 5 min zwischen jeder Wäsche und einer abschließenden Wäsche mit PBS.
  8. Für die kardialen Mikrobeschwerden mit 2 ml 0,1% Tween-20 fünfmal mit 20 minuten Dauer zwischen jeder Wäsche waschen. Führen Sie einen letzten Waschschritt für weitere 20 Minuten durch.
  9. Inkubieren Sie die Zellen oder Mikrogewebe vor der konfokalen Mikroskopie mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1 μg/ml).
  10. Für kardiale Mikrogewebe vorsichtig auf eine 35-mm-Glasbodenschale geben und PBS hinzufügen, um Mikrogewebe einzutauchen.
  11. Für die 3D-Bildgebung gewinnen Sie mit einem 20-fachen oder 40-fachen Ölimmersionsobjektiv den Schwerpunkt der Mikrobearbeitung und passen Die Belichtungsparameter für jeden Fluorophor an.
  12. Um einen Z-Stack zu erhalten, stellen Sie die erste und letzte Koordinate im Live-Modus mit einer Gesamtabbildungstiefe von 100-200 μm mit einem Slice-Intervall von 5-10 μm ein.

7. Verdauung von kardialen Mikrogeweben und Vorbereitung von Zellen für die Durchflusszytometrie

  1. Um Mikrogewebe zu verdauen, spülen Sie die Mikrogewebe mit Medium # 1 vorsichtig aus den kreisförmigen Vertiefungen mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit breiter Bohrung in ein konisches 15-ml-Rohr.
  2. Lassen Sie die Mikrogewebe sich absetzen und das Medium vorsichtig absaugen und spülen Sie die Zellen oder Mikrogewebe mit 1 ml PBS aus und fügen Sie 200-300 μL Enzymaufschlusspuffer für 20 min bei 37 ° C hinzu. Nach 10 min die Mikrogewebe für 1 min vorsichtig mischen und für den Rest der Zeit bei 37 °C erneut inkubieren.
  3. Verwenden Sie nach der Inkubation eine normale 1 ml Pipettenspitze, um die Mikrogewebe kräftig zu mischen, um eine trübe Zellsuspension zu erhalten.
  4. Sobald die Mikrogewebe ausreichend in einzelne Zellen verdaut sind, neutralisieren Sie sofort die Zellsuspension mit 5 ml Medium, das 5% FBS enthält, und belasten Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen und zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspension bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
  5. Den Überstand aspirieren und 1 x 105-1 x 106 Zellen in 100 μL Annexinbindungspuffer mit FITC Annexin V und 100 μg/ml Propidiumiodid (PI) oder To-Pro3 Totzellausschlussfarbstoff für 10 min auf Eis resuspendieren.
  6. Nach der Inkubation werden 300 μL des Annexin-Bindungspuffers in die Zellsuspension gegeben und zur durchflusszytometrischen Analyse in ein FACS-Röhrchen mit rundem Boden überführt. Verwenden Sie die richtigen Laser und Emissionsfilter für die ausgewählten Fluorophore.
  7. Zur Quantifizierung von Zelloberflächenmarkern unter Verwendung fester Zellen ist die Fixierung und Permeabilisierung des Zellpellets wie in den Schritten 6.2 und 6.3 beschrieben durchzuführen.
  8. Nach der Permeabilisierung das Zellpellet ausspülen und die Zellen mit entsprechenden konjugierten Antikörpern für 1 h inkubieren. Das Zellpellet in 4 mL FACS-Puffer (2% FBS in PBS) waschen und bei 300 x g für 3 min zentrifugieren. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal.
  9. Resuspendieren Sie die Zellen in 200-300 μL FACS-Puffer für die Durchflusszytometrie-Analyse.
  10. Passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften mit einer nicht gebeizten Probe an und erwägen Sie die Verwendung einer Isotypsteuerung für jedes Fluorophor, um die Laserspannungen anzupassen. Sammeln Sie mindestens 20.000 Ereignisse für die Datenanalyse.

8. Durchführung von Kontraktionsanalysen von spontan schlagenden kardialen Mikrogeweben

  1. Nehmen Sie Videos von Herzmikrobeschwerden auf, um mindestens drei Schläge zu erfassen. Stellen Sie die Aufnahmeauflösung auf mindestens 1280 x 720 Pixel bei einer Bildrate >30 Bildern pro Sekunde ein und speichern Sie das Video in . AVI-Format.
  2. Führen Sie das MotionGUI-Skript11 in einer MATLAB-Umgebung aus, um die Benutzeroberfläche zu starten.
  3. Suchen Sie die . Speicherort der AVI-Datei in Ihrem Ordner, um das Video zu laden. Geben Sie dann die Bildrate, mit der das Video aufgenommen wurde, in das Eingabefeld ein.
  4. Im erweiterten Eingabebereich kann eine Pixelgröße basierend auf der Auflösung und der Aufnahmevergrößerung angegeben werden.
  5. Eine geeignete Makroblock-Pixelgröße kann angegeben werden (Standard 16) und eine detektierbare Pixelbewegung in Abhängigkeit von der Stärke der Mikrogewebekontraktion.
  6. Nachdem Sie die Parameter angepasst haben, klicken Sie auf Bewegungsvektoren abrufen , um die Analyse zu starten.
  7. Wählen Sie mit dem Optionsfeld AOI auswählen eine Region von Interesse aus, um Bereiche auszuschließen, die das einzelne Mikrogewebe in der kreisförmigen Aussparung umgeben.
  8. Verwenden Sie die Funktion Map Time Ave , um eine Heatmap der mittleren Kontraktion basierend auf der auf den X- und Y-Achsen erkannten Bewegung zu generieren.
  9. Verwenden Sie für Peak-Tracing-Daten die Funktion Get Contraction Data , um die Kontraktions- und Relaxationsspitzen automatisch zu messen.
  10. Wenden Sie bei einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis eine Spitzenhöhe und einen Entfernungsschwellenwert an, um die maximale Kontraktionsgeschwindigkeit (blauer Punkt) und die maximale Relaxationsgeschwindigkeit (rotes Dreieck) korrekt zu kommentieren.
  11. Nachdem Sie die richtigen Schwellenwerte festgelegt haben, wählen Sie Spitzen analysieren aus, um die Kontraktions- und Relaxationswerte mit Beatrate und Beat-Intervall zu erhalten.
  12. Erhalten Sie Messungen von mindestens 25 einzelnen Mikrogeweben für statistische Analysen.

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Ergebnisse

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Immunstaining und Durchflusszytometrie Charakterisierung von iPSC-abgeleiteten CMs, ECs und CFs
Um kardiale Mikrogewebe zu erzeugen, die aus iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs bestehen, werden alle drei Zelltypen einzeln differenziert und charakterisiert. Die In-vitro-Differenzierung von iPS-Zellen zu iPSC-CMs hat sich in den letzten Jahren verbessert. Die Ausbeute und Reinheit von iPSC-CMs unterscheiden sich jedoch von Linie zu Linie. Das aktuelle Protokoll liefert über 75% reine iPSC-CMs, die ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um kardiale Mikrogewebe aus vordifferenzierten iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs zu erzeugen, ist es unerlässlich, eine hochreine Kultur zur besseren Kontrolle der Zellzahlen nach kontaktinhibierter Zellverdichtung innerhalb der kardialen Mikrogewebe zu erhalten. Kürzlich haben Giacomelli et. al.18 haben die Herstellung von kardialen Mikrogeweben unter Verwendung von iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs demonstriert. Kardiale Mikrogewebe, die mit der beschriebenen Methode erzeugt werden, bestehen aus ~5....

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. ist Mitbegründer von Khloris Biosciences, hat aber keine konkurrierenden Interessen, da die hier vorgestellte Arbeit völlig unabhängig ist. Die anderen Autoren berichten von keinen Konflikten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Amanda Chase für ihr hilfreiches Feedback zum Manuskript. Finanzielle Unterstützung wurde durch das Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) der University of California, T29FT0380 (D.T.) und 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) und 17MERIT33610009 (J.C.W.); und National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 und NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Well-PlattenFisher Scientific08-772-29
3D-MikroformenMikrogewebe12-81 Format
6-Well-PlattenFisher Scientific08-772-1B
AutoMACS SpüllösungThermo Fisher ScientificNC9104697
B27 Supplement minus InsulinLife TechnologiesA1895601
B27 Supplement plus InsulinLife Technologies17504-044
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Matrigel, hESC-qualifizierte MatrixBD Biosciences354277
Cardiac Troponin T AntikörperMiltenyi130-120-403
CD144 (VE-Cadherin)MicroBeads Miltenyi130-097-857
CD31 AntikörperMiltenyi130-110-670
CD31 MikrokügelchenMiltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biotechnologiesc-81707
Totzell-Apoptose Kit mit Annexin V FITC und PIThermo Fisher ScientificV13242
Dispase IMillipore Sigma4942086001
DMEM, hoher Glukosegehalt (4,5 g/L) ohne Glutaminmedium11960044
DMEM/F-12 BasalmediumGibco11320033
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), kein Kalzium, kein MagnesiumLife Technologies14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
Fötales Rind serumLife Technologies10437
FibroLife serum-free Fibroblast LifeFactors KitLifeBone Cell TechnologyLS-1010
Glukosefreies RPMI MediumLife Technologies11879-020
ZiegenserumLife Technologies16210-064
Human FGF-basicThermo Fisher Scientific13256029
Human VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberase TLMillipore Sigma5401020001
LS SortierkolonnenMiltenyi130-042-401
MACS BSA StammlösungMiltenyi130-091-376
MACS SpülpufferMiltenyi130-091-222
MidiMACS SeparatorMiltenyi130-042-302
RPMI mediumLife Technologies11835055
SB431542SelleckchemS1067
TO-PRO 3Thermo Fisher ScientificR37170
Triton X-100Millipore SigmaX100-100ML
TrypLE Select 10XThermo Fisher Wissenschaftlichrot
Vimentin Alexa Fluor® 488-konjugierter AntikörperR& D SystemsIC2105G

Referenzen

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