Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.
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Methodenartikel
Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Erzeugung von humanen Kardiomyozyten (CMs), kardialen Fibroblasten (CFs) und Endothelzellen (ECs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) bot eine einzigartige Gelegenheit, das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen kardiovaskulären Zelltypen zu untersuchen, das die Gewebeentwicklung und -krankheit antreibt. Im Bereich der Herzgewebemodelle verwenden mehrere ausgeklügelte dreidimensionale (3D) Ansätze induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs), um die physiologische Relevanz und die native Gewebeumgebung mit einer Kombination aus extrazellulären Matrizen und Vernetzern nachzuahmen. Diese Systeme sind jedoch ohne Mikrofabrikationskenntnisse komplex herzustellen und benötigen mehrere Wochen für die Selbstmontage. Am wichtigsten ist, dass vielen dieser Systeme Gefäßzellen und Herzfibroblasten fehlen, die über 60% der Nichtmyozyten im menschlichen Herzen ausmachen. Hier beschreiben wir die Ableitung aller drei Herzzelltypen aus iPS-Zellen zur Herstellung kardialer Mikrogewebe. Diese einfache Replik-Formgebungstechnik ermöglicht die kardiale Mikrobearbeitungskultur in Standard-Multi-Well-Zellkulturplatten für mehrere Wochen. Die Plattform ermöglicht eine benutzerdefinierte Kontrolle über Mikrogewebegrößen basierend auf der anfänglichen Seeding-Dichte und benötigt weniger als 3 Tage für die Selbstorganisation, um beobachtbare kardiale Mikrogewebekontraktionen zu erreichen. Darüber hinaus können die kardialen Mikrogewebe leicht verdaut werden, während eine hohe Zelllebensfähigkeit für die Einzelzellbefragung unter Verwendung von Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) erhalten bleibt. Wir stellen uns vor, dass dieses In-vitro-Modell von kardialen Mikrogeweben dazu beitragen wird, Validierungsstudien in der Arzneimittelentdeckung und Krankheitsmodellierung zu beschleunigen.
Einleitung
Die Wirkstoffforschung und Krankheitsmodellierung im Bereich der kardiovaskulären Forschung steht aufgrund des Mangels an klinisch relevanten Proben und unzureichender translationaler Werkzeuge vor mehreren Herausforderungen1. Hochkomplexe präklinische Modelle oder stark vereinfachte in vitro Einzelzellmodelle zeigen keine pathophysiologischen Bedingungen in reproduzierbarer Weise. Daher haben sich mehrere miniaturisierte Tissue-Engineering-Plattformen entwickelt, um die Lücke zu schließen, mit dem Ziel, ein Gleichgewicht zwischen einfacher Anwendung in hochdurchsatziger Weise und einer getreuen Rekapitulation der Gewebefunktion zu
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Protokoll
1. Medium, Reagenz, Zuchtplattenvorbereitung
- Zellwaschlösung für die Zellkultur: Verwenden Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calcium oder Magnesium.
- Kardiomyozyten-Differenzierungsmedien
- Bereiten Sie das Differenzierungsmedium Nr. 1 vor, indem Sie 10 ml Ergänzung (50x B27 plus Insulin) zu 500 ml Kardiomyozyten-Basalmedium (RPMI 1640) hinzufügen.
- Bereiten Sie das Differenzierungsmedium Nr. 2 vor, indem Sie 10 ml Ergänzung (50x B27 minus Insulin) zu 500 ml Kardiomyozyten-Basalmedium (RPMI 1640) hinzufügen.
- Bereiten Sie das Reinigungsmedium Nr. 3 vor, indem Sie er....
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Ergebnisse
Immunstaining und Durchflusszytometrie Charakterisierung von iPSC-abgeleiteten CMs, ECs und CFs
Um kardiale Mikrogewebe zu erzeugen, die aus iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs bestehen, werden alle drei Zelltypen einzeln differenziert und charakterisiert. Die In-vitro-Differenzierung von iPS-Zellen zu iPSC-CMs hat sich in den letzten Jahren verbessert. Die Ausbeute und Reinheit von iPSC-CMs unterscheiden sich jedoch von Linie zu Linie. Das aktuelle Protokoll liefert über 75% reine iPSC-CMs, die .......
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Diskussion
Um kardiale Mikrogewebe aus vordifferenzierten iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs zu erzeugen, ist es unerlässlich, eine hochreine Kultur zur besseren Kontrolle der Zellzahlen nach kontaktinhibierter Zellverdichtung innerhalb der kardialen Mikrogewebe zu erhalten. Kürzlich haben Giacomelli et. al.18 haben die Herstellung von kardialen Mikrogeweben unter Verwendung von iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs demonstriert. Kardiale Mikrogewebe, die mit der beschriebenen Methode erzeugt werden, bestehen aus ~5........
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Offenlegungen
J.C.W. ist Mitbegründer von Khloris Biosciences, hat aber keine konkurrierenden Interessen, da die hier vorgestellte Arbeit völlig unabhängig ist. Die anderen Autoren berichten von keinen Konflikten.
Danksagungen
Wir danken Dr. Amanda Chase für ihr hilfreiches Feedback zum Manuskript. Finanzielle Unterstützung wurde durch das Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) der University of California, T29FT0380 (D.T.) und 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) und 17MERIT33610009 (J.C.W.); und National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 und NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 12-Well-Platten | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D-Mikroformen | Mikrogewebe | 12-81 Format | |
| 6-Well-Platten | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Spüllösung | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualifizierte Matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antikörper | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) | MicroBeads Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antikörper | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Mikrokügelchen | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnologie | sc-81707 | |
| Totzell-Apoptose Kit mit Annexin V FITC und PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, hoher Glukosegehalt (4,5 g/L) ohne Glutaminmedium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 Basalmedium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), kein Kalzium, kein Magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fötales Rind serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife serum-free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeBone Cell Technology | LS-1010 | |
| Glukosefreies RPMI Medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Ziegenserum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sortierkolonnen | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stammlösung | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Spülpuffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Wissenschaftlich | rot | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-konjugierter Antikörper | R& D Systems | IC2105G |
Referenzen
- Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a....
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Nachdrucke und Genehmigungen
