Method Article

Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

DOI:

10.3791/61881

⸱

October 20th, 2020

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um das Zusammenspiel zwischen Wirt und Erreger während der Infektion durch Massenspektrometrie-basierte Proteomik zu profilieren. Dieses Protokoll verwendet die etikettenfreie Quantifizierung, um Veränderungen in der Proteinmenge sowohl von Wirten (z. B. Makrophagen) als auch von Erregern (z. B. Cryptococcus neoformans) in einem einzigen Experiment zu messen.

Abstract

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Die technologischen Errungenschaften der Massenspektrometrie (MS) eröffnen viele unentdeckte Wege zur Analyse des globalen Proteoms eines Organismus unter unterschiedlichen Bedingungen. Diese kraftvolle Strategie, die auf die Wechselwirkungen von mikrobiellen Krankheitserregern mit dem gewünschten Wirt angewendet wird, charakterisiert beide Perspektiven auf Infektionen umfassend. Hierin beschreibt der Workflow die etikettenfreie Quantifizierung (LFQ) des Infektoms von Cryptococcus neoformans, einem pilzfakultativen intrazellulären Erreger, der der Erreger der tödlichen Krankheit Kryptokokkose ist, in Gegenwart von verewigten Makrophagenzellen. Das Protokoll beschreibt die geeigneten Proteinvorbereitungstechniken für Krankheitserreger und Säugetierzellen in einem einzigen Experiment, was zu einer angemessenen Peptid-Einreichung für die Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS/MS-Analyse führt. Die hohe generische Natur des LFQ mit hohem Durchsatz ermöglicht eine breite Dynamik der Proteinidentifikation und -quantifizierung sowie die Übertragbarkeit auf jede Infektionseinstellung von Wirtspathogenen, wobei eine extreme Empfindlichkeit erhalten bleibt. Die Methode ist optimiert, um umfangreiche, unvoreingenommene Proteinreichtumsprofile eines Erregers unter infektionsimitleidenden Bedingungen zu katalogisieren. Insbesondere liefert die hier gezeigte Methode wesentliche Informationen zur Pathogenese von C. Neoformans, wie z. B. der für Virulenz notwendigen Proteinproduktion und identifiziert kritische Wirtsproteine, die auf eine mikrobielle Invasion reagieren.

Introduction

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Die Prävalenz invasiver Pilzinfektionen nimmt enorm zu und korreliert mit unannehmbar hohen Sterblichkeitsraten, die am häufigsten bei Personen mit immundefiziden Veranlagungen berichtet werden1. Cryptococcus neoformans ist ein berüchtigter opportunistischer Pilzerreger, der in der Lage ist, intrazelluläre sesäichliche Überleben innerhalb von Wirtsmakrophagenzellen zu überleben. Unzureichende antimykotische Intervention führt zu Pilzverbreitung und lebensbedrohliche Manifestationen von kryptokokkaler Meningitis und Meningoenzephalitis2,3. Die globale Zunahme des immungeschwächten Status hat eine parallele Zunahme der Verwendung von Antimykotika gefordert, in denen viele Pilzarten, einschließlich C. Neoformans, zunehmend Resistenzen gegen4,5,6entwickelt haben. Daher ist es unerlässlich, robuste und effiziente Technologien zu implementieren, um lebenswichtige biologische Fragen in Bezug auf die Reaktion auf die Wirtsabwehr und die mikrobielle Pathogenese zu beantworten.

Das neue Zeitalter des technologischen Fortschritts in der Massenspektrometrie (MS), einschließlich der Erzeugung leistungsfähiger computergestützter und bioinformatischer Pipelines, bildet die Grundlage für eine integrative Vision für eine groß angelegte Analyse der Wirtspathogenforschung7,8. Herkömmliche pathogenese-gesteuerte proteomische Analysen profilieren häufig die Sicht der Infektion entweder aus der Perspektive des Wirts oder des Krankheitserregers, einschließlich umfassender Methoden wie Proteinkorrelationsprofilierung, Affinitätschromatographie in Kombination mit Proteomik und Interkomik9. Untersuchungen zur Virulenz gefährlicher Krankheitserreger in einem Wirtssystem sind von immenser klinischer Bedeutung; Die Anwendung einer dualen Perspektivanalyse in einem einzigen Experiment galt jedoch früher als unerreichbar. Zum Beispiel wird die Perspektive des Erregers auf eine Infektion oft von reichlich reichlich vorhandenen Wirtsproteinen überwältigt, was zu einer verringerten Empfindlichkeit für den Nachweis von schwach vorhandenen Pilzproteinenführt 7. Darüber hinaus lädt die hohe Probenkomplexität viele Ziele ein, in einem einzigen experimentellen System zu untersuchen, und erweist sich als schwierig, Wirkmechanismen für ein bestimmtes Pathogenprotein aufzuklären.

Bottom-up-Proteomik ist eine beliebte MS-Technik, die eine überschaubare Probenvorbereitung ermöglicht, bei der Peptide durch sequenzspezifische enzymatische Verdauung erzeugt werden, gefolgt von Flüssigkeitschromatographie-Trennung, Identifizierung und Quantifizierung durch MS10,11. Hier stellen wir eine Methode vor, die eine datenabhängige Erfassungsstrategie demonstriert, die darauf ausgerichtet ist, eine unvoreingenommene Abdeckung eines infektionsbasierten Proteoms oder "Infektoms" zu erreichen. Insbesondere die etikettenfreie Quantifizierung (LFQ) verringert die Abhängigkeit von chemischen oder metabolischen Etiketten für eine robuste und genaue Identifizierung von Proteinstandsänderungen über mehrere Proteome hinweg, wodurch die Probenhandhabung und die Verarbeitungsschritte12,13reduziert werden. Diese universelle Anwendung fragt produzierte Proteine zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle unabhängig von der erwarteten Proteinproduktion ab; So können neue Erkenntnisse entdeckt werden, die für eine Infektion entscheidend sind.

Der hier beschriebene Workflow ist optimiert, um Veränderungen des Proteinspiegels von C. Neoformanen während der Infektions-Mimikking-Bedingungen mit Wirtsimmunzellen zu untersuchen (Abbildung 1). Anstatt sich auf die Isolierung und Trennung von Zelltypen zu verlassen, extrahiert dieser Ansatz das Wirts- und Erregerproteom zusammen und nutzt die bioinfordische Trennung mithilfe von zwei organismusspezifischen Datenbanken, um die artspezifische Proteinproduktion zu unterscheiden. Diese Methode bietet Vorteile für eine unbegrenzte Anzahl von Proben, die ohne die zusätzlichen kostspieligen Vorbereitungsschritte verarbeitet werden, die in isotopenbasierten Etikettierungsstudien oder Fraktionen erforderlich sind. Darüber hinaus unterstützt dieser Workflow optimierte Proteinextraktionsprotokolle, die auf eine Breite von Pilz- und Bakterienerregern übertragbar sind, die in der Lage sind, Wirtsimmunzellen anzusprechen und zu infizieren. Insgesamt skizziert dieses Protokoll die Schritte zur Durchführung einer unvoreingenommenen Proteinextraktion und Probenverarbeitung für hochauflösende MS, gefolgt von Daten und statistischen Analysen, die in der Lage sind, eine Fülle von Kenntnissen über Pilzproteine bereitzustellen, die für eine Infektion wichtig sind, kombiniert mit einer umfassenden Profilierung der Host-Abwehrreaktion.

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Protocol

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Eine verewigte Linie von Makrophagen, die von BALB/c-Mäusen abgeleitet wurden, wurde für das folgende Protokoll verwendet, das vom University of Guelph Animal Utilization Protocol 4193 genehmigt wurde. Insbesondere können andere Stämme von Mäusen oder andere Quellen von verewigten Zellen auf das skizzierte Protokoll mit ausreichenden Tests angewendet werden, um die detaillierten Parameter zu optimieren. Das folgende Protokoll navigiert durch die Schritte, die mit einer eingefrorenen Durchstechflasche mit Makrophagenzellen beginnen. Die Zellen werden in 10% FBS (fetales Rinderserum), 1% L-Glutamin und 5% Pen/Strep (Penicillin-Streptomycin)-Gemisch zu DMEM (Dulbecco es Modified Eagle Medium) und 20% DMSO (Dimethylsulfoxid) gelagert.

1. Kultivierung von C. neoformans

  1. Mit einem Glycerin-Bestand, Streifen Wildtyp C. Neoformans Stamm (H99) auf Hefe-Extrakt Pepton-Dextrose (YPD) Agar-Platte zu isolieren einzelne Kolonien.
  2. Über Nacht für 16 h bei 37 °C in einem statischen Inkubator inkubieren.
  3. Wählen Sie eine einzige Kolonie von Wildtyp C. Neoformans Stamm und Kultur in 5 ml YPD Brühe in einem lose gekapselten 10 ml Reagenzglas. Führen Sie in Quadruplicate.
  4. Über Nacht für 16 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubieren.
  5. Am nächsten Tag Subkultur jede Nachtkultur in einer 1:100 Verdünnung in 3 ml YPD Brühe.
  6. Messen Sie die optische Dichte (OD600nm) werte der Pilzkultur, um die Mid-Log-Phase zu bestimmen. Je nach Spektralphotometer erreicht der Wildtypstamm von C. neoforman die Mid-Log-Phase, die häufig nach einer Inkubation von 6 bis 8 h in YPD mit allgemeinen OD600nm-Werten von 1,0 bis 1,5 erreicht.
  7. Sobald die Zellen die Mid-Log-Phase erreicht haben, nehmen Sie eine 10-L-Aliquot-Pilzzellsuspension in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und verdünnen 1:100 in steriler 1x Phosphatgepufferter Salzsäure (PBS). Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.

2. Kultivieren von Makrophagenzellen

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsumgebung vor der Zellkulturarbeit sterilisiert wird.

  1. Vorbereitung des Zellkulturmediums
    1. Antibiotika-ergänzungsmittel: Fügen Sie 10% FBS (fetales Rinderserum), 1% L-Glutamin und 5% Pen/Strep (Penicillin-Streptomycin) Mischung zu DMEM (Dulbecco es Modified Eagle Medium). Durch ein 0,2-mm-Filtersystem durch ein 0,2 m großes Filtersystem filtern und bei 4 °C lagern.
    2. Antibiotikafreies Medium: Folgen Sie dem identischen Protokoll, lassen Sie aber die Pen/Strep-Mischung weg.
  2. Aussaat von Makrophagenzellen
    HINWEIS: Antibiotika-ergänzungsmittel (2.1.1.) sollte vor der Zellkulturarbeit auf 37 °C erwärmt werden.
    1. Durchstechflasche von Makrophagenzellen im 37 °C-Perlenbad schnell auftauen.
    2. Waschen Sie Zellen der Gefrierlösung durch Wiederaussetzung der Zellen in 1 ml antibiotikaergänztem Medium.
      HINWEIS: Es sind zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, um sicherzustellen, dass die Zellen aufgrund der harten Pipettierung nicht lysieren.
    3. Übertragen Sie resuspendierte Zellen in ein steriles 15 ml-Rohr.
    4. Pelletzellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    5. Entfernen Sie überstand vorsichtig mit einer serologischen Pipette oder einem Vakuumsauger.
    6. Pellet in 10 ml antibiotisch ergänztem Medium vorsichtig resuspendieren.
    7. Die Pipette resuspendierte Zellen sanft in eine 60 x 15 mm Zellkultur behandelte Schale.
    8. Inkubationsschale bei 37 °C mit 5%CO2 über Nacht.
  3. Erste Passage von Makrophagenzellen
    HINWEIS: Gefrorene Zellbestände enthalten in der Regel zwischen 5 und 10 Millionen Zellen pro Durchstechflasche (ca. 1 ml). Am darauffolgenden Tag werden Makrophagenzellen, die das Aussaatprotokoll überlebt haben, am Boden der Zellkulturschale haften und für die Passierung bereit sein.
    1. Warmes antibiotikaergänztes Medium (Schritt 2.1.1) bis 37 °C vor der Zellkulturarbeit. Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsumgebung vor der Zellkulturarbeit sterilisiert wird. Visualisieren Sie Zellen mit einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen haftbar und gesund sind.
    2. Entfernen Sie das Zellkulturmedium entweder mit einer serologischen Pipette oder einem Vakuumsauger aus der Schale.
    3. 5-7 ml sterile Raumtemperatur PBS (Phosphat-gepufferte Saline) vorsichtig in die 60 x 15 mm Schale geben.
    4. Neigen Sie die Schale vorsichtig, um die haftenden Zellen zu waschen.
    5. Entfernen Sie PBS mit einer serologischen Pipette oder einem Vakuumsauger.
    6. Fügen Sie 1 ml kalte PBS (bei 4 °C gespeichert) zu den Zellen, Kippschale, um PBS über alle Zellen zu verteilen, und lassen Sie bei Raumtemperatur für 1 min sitzen.
    7. Lösen Sie Zellen durch sanftes Tippen auf die Schale, Pipettieren von kaltem PBS gegen die Zellen oder durch Verwendung eines Zellschabers.
    8. Fügen Sie dem Gericht 9 ml antibiotikaergänztes Medium hinzu.
    9. In einer neuen 60 x 15 mm Schale 9 ml frisches antibiotikaergänztes Medium und 1 ml resuspendierte Zellen aus der Originalschale hinzufügen.
    10. Sobald die Anzahl der gewünschten Passaging-Platten gefüllt wurde, können resuspendierte Zellen aus der originalen Schale entsorgt werden.
    11. Inkubieren Sie das neue Gericht an den oben genannten Einstellungen (Schritt 2.2.8).
    12. Führen Sie nachfolgende Passaging durch, wenn Zellen einen Zusammenfluss von 70-80 % erreicht haben (ungefähr alle 2 Tage, abhängig von der verwendeten Zelllinie und dem verwendeten Medium).
      HINWEIS: Makrophagenzellen sollten mindestens fünfmal vor Infektionsexperimenten durchgedront werden. Je nach Zelllinie sollten Infektionsexperimente mit 25 bis 30 Passagen durchgeführt werden. Nach 25 bis 30 Passagen sollten Zellen eingefroren oder entsorgt werden. Abschnitt 2.4 oder 2.5 kann auf der Grundlage der Versuchspläne gewählt werden. Abschnitt 2.4 wird für die folgenden Abschnitte verwendet.
  4. Aussaat von Makrophagenzellen vor der Infektion
    1. Führen Sie die Passaging-Protokollschritte 2.3.1 bis 2.3.7 aus.
    2. Mit Hilfe eines Hämozytometers oder eines automatisierten Zellzählers bestimmen Sie die Zelldichte (Zellen/ml).
    3. Übertragen Sie 0,3 x 106 Makrophagenzellen in einen einzigen Brunnen einer 6-Well-Zellkulturplatte.
    4. Passen Sie das Gesamtvolumen von gut 1 ml mit antibiotikaergänztem Medium (Schritt 2.1.1) an.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 2.4.3 und 2.4.4, bis 8 Brunnen gefüllt wurden (4 Brunnen in zwei separaten Platten gefüllt).
    6. Füllen Sie optional die restlichen zwei Brunnen mit 1 ml Raumtemperatur-PBS, um den Feuchtigkeitsgehalt während der Inkubation aufrechtzuerhalten.
    7. Zellen unter in Schritt 2.2.8 genannten Inkubationsbedingungen für 2 d vor der Infektion wachsen lassen.
  5. Aussaat von Makrophagenzellen am Tag der Infektion
    1. Führen Sie die Passaging-Protokollschritte 2.3.1 bis 2.3.7 aus.
    2. Mit Hilfe eines Hämozytometers oder eines automatisierten Zellzählers bestimmen Sie die Zelldichte (Zellen/ml).
    3. Samen 1,2 x 106 Makrophagenzellen in einen einzigen Brunnen einer 6-Well-Zellkulturplatte.
    4. Passen Sie das Gesamtvolumen von gut 1 ml mit antibiotikaergänztem Medium (2.1.1) an.
    5. Wiederholen Sie 2.4.3 und 2.4.4, bis 8 Brunnen gefüllt wurden (4 Brunnen in zwei getrennten Platten gefüllt).
    6. Füllen Sie optional die restlichen zwei Brunnen mit 1 ml Raumtemperatur-PBS, um den Feuchtigkeitsgehalt während der Inkubation aufrechtzuerhalten.
    7. Inkubieren Sie Zellen unter bedingungen, die in Schritt 2.2.8 für 3 h erwähnt werden, damit Zellen an Brunnen haften können.

3. Infektion von Makrophagenzellen mit C. Neoformanen

HINWEIS: Bei Erreichen von 70-80% Zusammenfluss gibt es ca. 1,2 x 106 Makrophagenzellen pro Brunnen. Um die gewünschte Infektionsvielfalt (MOI) von 100:1 zu erreichen, werden für jede Reaktion 1,2 x 108 Pilzzellen benötigt. Kulturen müssen entsprechend in biologischem Viereck festgelegt werden.

DISCLAIMER: Ein MOI von 100:1 hat in unserer Forschungsgruppe wünschenswerte Ergebnisse erzielt und ist als Anregung für Leser gedacht. Ein niedrigeres MOI kann für infektiösere C. Neoformans-Stämme oder für weniger belastbare Makrophagen-Zelllinien erforderlich sein. Die Überprüfung der Infektion (Abschnitt 3.5) kann verwendet werden, um das ideale MOI für bestimmte C. neoformans – Makrophagenkombinationen – zu bestimmen.

  1. Zubereitung von Pilzzellen
    1. Folgen Sie Schritt 1 für das Wachstum von C. neoformans bis zur Mid-Log-Phase.
    2. Sammeln und Zentrifugieren von Zellen bei 1.500 x g für 10 min, sanft pellet mit steriler Raumtemperatur PBS waschen und für insgesamt drei Wäschen wiederholen.
    3. Resuspend Zellen in antibiotikafreien Zellkulturmedium (Schritt 2.1.2) zu einer Konzentration von 1,2 x 108 Zellen/ml zu erreichen.
  2. Vorbereitung von Makrophagenzellen
    1. Visualisieren Sie jeden Brunnen in der 6-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Zellen 70-80% Zusammenfluss erreicht haben. Alternativ können Zellen gemessen werden, um ca. 1,2 x 106 Makrophagenzellen pro Brunnen zu erreichen.
    2. Befolgen Sie die Schritte 2.3.1 bis 2.3.4.
  3. Kokultur von C. Neoformanen und Makrophagenzellen
    1. Fügen Sie 1 ml der resuspendierten C. neoformans-Zellen (Schritt 3.1.3) zu 4 Brunnen hinzu, die Makrophagenzellen enthalten, die in Abschnitt 3.2 hergestellt sind.
      HINWEIS: Die Anzahl der benötigten Platten muss vor Beginn des Experiments berechnet werden. 1 ml antibiotikafreies Medium (Schritt 2.1.2) zu leeren Brunnen hinzufügen.
    2. Zellen unter aufgeführten Bedingungen (Schritt 2.2.8) für 3 h inkubieren lassen.
    3. Entfernen Sie das Zellkulturmedium entweder mit einer serologischen Pipette oder einem Vakuumsauger von der Platte.
    4. Fügen Sie vorsichtig 1 ml sterile Raumtemperatur PBS hinzu.
    5. Neigen Sie die Platte vorsichtig, um unbefestigte oder nicht phagozytosierte extrazelluläre C. neoformans Zellen zu waschen.
    6. Entfernen Sie PBS mit einer serologischen Pipette oder Vakuum-Aspirator, wiederholen für insgesamt drei Waschungen. Wiederholen Sie 3.3.4 bis 3.3.5 zwei weitere Male.
  4. Nicht infizierte Makrophagen
    1. Ebenso verwenden Sie 4 Bohrungen einer 6-Well-Platte, um als Makrophagen-Only-Proben zu dienen. Fügen Sie 1 ml antibiotikafreies Medium (Schritt 2.1.2) zu diesen Brunnen hinzu.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.2 bis 3.3.6.
  5. Überprüfung der Infektion
    HINWEIS: Mit Hilfe eines Zytotoxizitäts-Assays kann Infektionskompetenz gemessen werden. Das folgende Protokoll wird die Anwendung eines Zytotoxizitätsprodukts zur Messung der LDH-Freisetzung (Lactatdehydrogenase) hervorheben. Andere Zytotoxizitätsprodukte können ebenfalls verwendet werden.
    1. Vorbereitung der C. neoformans Infektion von Makrophagenzellen
      1. Wiederholt die Schritte 1, 2 und 3 (bis zu 3.5). Der LDH-Test kann in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden, wenn gewünscht.
      2. Nach Schritt 3.3.6 1 ml antibiotikafreies Medium (2.1.2) in die 6-Well-Platte geben.
      3. Wiederholen Sie die Schritte 2.4.3 und 2.4.4, bis 3 Brunnen plus 3n Brunnen gefüllt wurden (wobei n die Anzahl der gemessenen Zeitpunkte ist).
      4. Inkubieren Sie Zellen unter Bedingungen, die in Schritt 2.2.8 aufgeführt sind.
      5. An ausgewählten Zeitpunkten (z. B. 1, 3, 6, 12 und 24 Stunden) sammeln Sie Überstand zur Messung der LDH-Freisetzung gemäß Herstelleranleitung
      6. Gleichzeitig werden nicht infizierte Makrophagenzellen auf den ermittelten Wert für die maximale Zytotoxizität lysiert.
      7. Berechnen Sie die Zytotoxizität wie folgt:
        Formel für die Zytotoxizität: %Zytotoxizität = Experimentelle LDH-Freisetzung / Maximale LDH-Freisetzung.

4. Probensammlung

  1. Co-Kultur und nicht infizierte Makrophagensammlung
    1. Fügen Sie 1 ml kalte PBS in die Zellen (von 3.3.6 und 3.4.2) und lassen Sie bei Raumtemperatur für 1 min sitzen.
    2. Lösen Sie Zellen von der Platte durch sanftes Tippen der Platte oder sanftes Pipettieren kaltER PBS gegen die Zellen.
      HINWEIS: Zellschaber sollte vermieden werden, da dies zu einer Lyse der Zellen führen könnte.
    3. Pipette resuspendierte Zellen in ein 15 ml Rohr.
    4. Zentrifugenzellen bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand.
    5. Prozesszellen (wie in Schritt 5 beschrieben) sofort oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C zur späteren Verarbeitung gelagert.

5. Zelluläres Proteom

HINWEIS: Eine ausreichende Lyse muss für den analysierten Zelltyp optimiert werden (d. h. die Menge der Zyklen und Amplituden hängt von der Zellpelletgröße und dem Leistungsprozentsatz des Sondenschallatorsmodells ab).

  1. Infizierte Makrophagenzelllyse
    1. Pelletzellen (Schritt 4.1.5) in 300 l von 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) aus einer frisch gelösten Protease-Hemmer-Cocktailtablette wieder aufsetzen.
      HINWEIS: Eine Protease-Hemmer-Cocktail-Tablette wird 10 ml eiskalt 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) vor Beginn des Experiments hinzugefügt.
    2. Sonde beschallt Zellen in einem Eisbad für 15 Zyklen von 30 s auf und 30 s aus, um die Zellen zu lyse.
    3. Zentrifugenzellen kurz für 30 s bei 400 x g, vorsichtig, kein Pellet zu bilden, nur um Flüssigkeit an den Seiten der Rohre zu entfernen, gefolgt von der Übertragung der Probe in ein 2 ml Lo-Bind Mikrozentrifugenrohr.
    4. Fügen Sie 1:10 Volumen von 20% SDS zu einer endgültigen Konzentration von 2% hinzu.
    5. 1:100 Volumen von 1 M Dithiothreitol (DTT) zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzufügen und die Probe gründlich durch Pipettieren mischen, gefolgt von der Inkubation auf einem thermischen Heizblock bei 95 °C für 10 min bei 800 U/min Rührung. Als nächstes auf Raumtemperatur abkühlen (Kühlung kann auf Eis erfolgen).
    6. Fügen Sie 1:10 Volumen von 0,55 M Iodoacetamid (IAA) hinzu, um eine Endkonzentration von 55 mM zu erhalten und die Probe gründlich durch Pipettieren zu mischen. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 20 min bebrüten.
    7. Fügen Sie 100% Aceton hinzu, um eine Endkonzentration von 80% Aceton zu erhalten und die Probe über Nacht bei -20°C aufbewahren, um Proteine auszufällen.
  2. Proteinverdauung
    1. Am nächsten Tag das Niederschlagpellet durch Zentrifugation für 10 min bei 10.000 x g und 4 °C sammeln. Überstand entsorgen und Pellet mit 500 l 80% Aceton waschen. Wiederholen Sie dies für insgesamt zwei Wähbe. Lufttrockenes Pellet bei Raumtemperatur nach Waschungen.
    2. Resolubilisieren Sie Proteinpellet in 100 l von 8 M Harnstoff/40 mM HEPES, um eine vollständige Löslichkeit, Wirbel oder Beschallung in einem Eiswasserbad für 15 Zyklen von 30 s auf und 30 s ab zu gewährleisten.
      ANMERKUNG: Die Anpassung des Harnstoff-/HEPES-Volumens wird anhand der Größe des gefällten Zellpellets bestimmt, wenn Veränderungen auftreten, müssen alle nachgeschalteten Volumina entsprechend angepasst werden.
    3. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit einem Proteintest (z.B. BCA-Protein-Assay) nach Herstelleranweisungen und passen Sie sich der Hintergrundmessung durch Blindnormalisierung mit 8 M Harnstoff/40 mM HEPES an.
    4. Fügen Sie 300 l 50 mM Ammoniumbicarbonat hinzu, um eine Endkonzentration von 2 M Harnstoff zu erhalten.
      ANMERKUNG: Möglichkeit, die Proteinkonzentration für nachgeschaltete Messungen zu normalisieren, vorgeschlagen, 100 g Protein zu verdauen und die verbleibende unverdaute Probe durch Blitzeinfrieren in flüssigem Stickstoff zu speichern und dann kurzfristig bei -20 °C oder längerfristig bei -80 °C zu lagern.
    5. 2:50 (v/w) Enzym-Protein-Verhältnis von Trypsin/Lys-C-Protease-Mischung auf Eis geben und vorsichtig auf Tube tippen, um sie zu mischen, über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Nach der Inkubation die Verdauung durch Zugabe von 1:10 Volumenstopplösung (20% Acetonitril, 6% Trifluoressigsäure) und Zentrifugenproben bei 10.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur beenden.
    7. Sammeln Überstand (besteht aus verdauten Peptiden) und entsorgen alle pelleted Schutt oder Niederschlag.
  3. Peptid-Entsalzung
    1. Aktivieren Sie eine C18 Stop And Go Extraction (STAGE) Spitze (bestehend aus 3 Schichten C18-Harz in einer 200-L-Pipettenspitze), indem Sie 100 l 100% Acetonitril und Zentrifuge bei 1.000 x g für 2 min hinzufügen.
    2. Ausgleich der C18 STAGE-Spitze durch Zugabe von 50 l Puffer B (80% (v/v) Acetonitril, 0,5% (v/v) Essigsäure) und Zentrifuge bei 1.000 x g für 2 min.
    3. Ausgleich der C18 STAGE-Spitze durch Zugabe von 200 l Puffer A (2% (v/v) Acetonitril, 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure, 0,5% (v/v) Essigsäure) und Zentrifuge bei 1.000 x g für 3-5 min.
    4. Fügen Sie die C18 STAGE-Spitze und Zentrifuge mit einer Zentrifuge von 50 g für 3-5 min oder bis die Probe durch die Spin-Säule gelangt ist, in die C18 STAGE-Spitze und Zentrifuge ein. Die verbleibende verdaute Probe in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -20°C lagern, bis sie benötigt wird.
    5. Waschen Sie die C18 STAGE-Spitze mit 200 l Puffer A und Zentrifuge bei 1.000 x g für 3-5 min.
    6. Fügen Sie der C18 STAGE-Spitze und Zentrifuge bei 500 x g für 2 min 50 l Puffer B hinzu. Sammeln Sie eluierte Peptide in 0,2 ml PCR-Röhren.
    7. Trocknen Sie die eluierten Peptide in einer Vakuumzentrifuge für 30-40 min bei maximaler Geschwindigkeit. Vollständig getrocknete Proben können bis zur Verarbeitung bei Raumtemperatur oder bei -20 °C gelagert werden.
      HINWEIS: Getrocknete und entsalzte Peptide sind geeignete Probeneinreichungen an Massenspektrometrieeinrichtungen zur Verarbeitung und können bei Umgebungstemperatur versandt werden.

6. Massenspektrometrie

  1. Rekonstituieren Sie Peptide in 10 l Puffer A und messen Sie die Konzentration, die notwendig ist, um Peptide von 1,5 bis 3 g in die MS-Säule zu injizieren. Die Menge der Probe hängt von der Instrumentierung ab.
  2. Verwenden Sie einen vorbestimmten Gradienten von Acetonitril (ca. 5-60%) in 0,5% Essigsäure über eine gewünschte Zeit (z.B. 2 h) zur Abtrennung von Peptiden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, gefolgt von Elektrospray-Ionisation in das Massenspektrometer.
  3. Erfassen Sie MS-Scans mit einem hochauflösenden Massenspektrometer im datenabhängigen Erfassungsmodus(m/z 300 bis 1650).
    HINWEIS: Der Gradientenprozentsatz und die Länge werden vom Experiment und vom Benutzer bestimmt. Präzise Einstellungen für Massenspektrometer hängen von Instrumentierung, Experiment und Benutzerpräferenz ab.

7. Datenanalyse

HINWEIS: MS-Daten können mit zahlreichen Bioinformatik-Pipelines verarbeitet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verarbeitung mit den öffentlich zugänglichen MaxQuant- und Perseus-Plattformen, empfehlen aber einzelnen Benutzern, bioinfordische Tools zu bewerten, die für die Analyse, Präferenz und Nutzung geeignet sind.

  1. Laden Sie unverarbeitete Datendateien (direkt vom MS-Instrument) mit der MaxQuant-Software. Identifizieren von Proteinen unter den modifizierten MaxQuant-Suchparametern; Mindestens zwei einzigartige Peptide, die für die Proteinidentifikation mit einem Ziel-Decoy-Ansatz für eine falsche Entdeckungsrate von 1% erforderlich sind, eine etikettenfreie Quantifizierung mit Übereinstimmung zwischen den Durchläufen implementieren, die aus der UniProt-Datenbank erhaltenen Organismen FASTA-Datei (d. h. Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus) integrieren, um vorhandene Peptide mit der Andromeda-Suchmaschine zu identifizieren und zu quantifizieren. Wenden Sie sich an die öffentlichen MaxQuant Online-Tools für detaillierte Tutorials (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Laden Sie die MaxQuant-Ausgabedatei ('Proteingruppen.txt') in Perseus hoch.
  3. Filtern Sie Zeilen, die potenzielle Falschpositiv- und Verunreinigungen enthalten und nur durch Standortpeptide geändert werden, mit den "Filterzeilen basierend auf einer kategorialen Spalte".
  4. Transformieren Sie Datenwerte auf der Skala von Log2.
  5. Erstellen Sie Datensatzgruppen, indem Sie den Zeilen eine kategoriale Anmerkung bereitstellen.
  6. Filtern Sie das Dataset nach gültigen Werten, um einen Cut-off für die Proteindetektion zu definieren.
    HINWEIS: Für eine strenge und robuste Analyse wird eine >50% Identifikationsrate vorgeschlagen. Wenn z. B. vier Replikationen verarbeitet wurden, wird eine Mindestanzahl von drei gültigen Werten ausgewählt.
  7. Wenn gewünscht, imputieren Sie Daten, indem Sie fehlende Werte aus der Normalverteilung ersetzen.
    HINWEIS: Unterstellte Werte werden basierend auf der Normalverteilung optimiert und bieten eine zufällige LFQ-Intensität, um 'NaN'-Platzhalter zu ersetzen, um typische Überflussmessungen zu simulieren. Diese Imputation bietet eine Plattform für nachgelagerte statistische Analysen, die quantifizierbare Daten erfordern.
  8. Fügen Sie den Proteinzeilen Anmerkungen hinzu (z. B. Proteinnamen, Gene Ontology-Begriffe).
    HINWEIS: Dieser generierte Perseus-Workflow ist nun ein robuster Rahmen für weitere bioinformatische Verarbeitung, statistische Analyse und Datenvisualisierung, konsultieren Sie öffentliche Perseus Online-Tools für detaillierte Tutorials (siehe Tabelle der Materialien).

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Results

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Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen, die sowohl vom Pilzpathogen C. neoformansals auch vom Wirt, Makrophagenzellen, in einem einzigen Experiment abgeleitet wurden. Nach der Kokultur werden die Zellen zusammen gesammelt und verarbeitet und auf der Grundlage von für jede Art spezifischen Peptidprofilen bioinformatisch getrennt. Dies ist ein kraftvoller Ansatz, um das Zusammenspiel der Wirts-Pathogen-Beziehung während der Infektion zu definieren. Die Anza...

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Discussion

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Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die Vorbereitung von Makrophagenzellen und die Entnahme von Co-Kulturproben für die Proteinverarbeitung mit minimaler Unterbrechung der Zellen. Es ist wichtig, Schritte des Waschens, Impfens und Entfernens von anhaftenden Makrophagenzellen sanft und sorgfältig durchzuführen, um unnötige Lyse von Zellen vor der Entnahme zu verhindern. Die Festlegung des richtigen MOI für das Experiment ist auch entscheidend, da die Impfung mit einem zu hohen MOI zu einem schnellen Tod von...

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Die Autoren danken Dr. Jonathan Krieger von Bioinformatics Solutions Inc. für den Betrieb des Massenspektrometers für repräsentative Experimente sowie Mitgliedern der Geddes-McAlister-Gruppe für ihre Unterstützung bei der experimentellen Einrichtung und dem Manuskript-Feedback. Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung, teilweise von der Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425) und der Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) für J.G.M., sowie dem NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mM Tris-HCl, pH 8,5Fisher ScientificBP152-1Bei 4°C halten; C
60 x 15 mm Schale, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific174888
6-Well-ZellkulturplatteThermoFisher Scientific140675
Acetonitril, MS-QualitätPierceTS-51101
EssigsäureSigma Aldrich1099510001
AcetonSigma Aldrich34850-1L
Ammonium Bikarbonat (ABC)ThermoFisher ScientificA643-500Bereiten Sie eine 50 mM ABC-Stammlösung vor, die bei Raumtemperatur bis zu einem Monat haltbar ist.
Bel-Art&Handel; HiFlow Vakuum-Aspirator-SammelsystemFisher Scientific13-717-300Nicht erforderlich, serologische Pipetten können zum Entfernen von Medien verwendet werden.
C18-Harz3M Empore3M2215
ZellschaberVWR10062-906Nicht unbedingt erforderlich, andere Methoden zur Freisetzung von Makrophagenzellen können verwendet werden.
Zentrifugal-VakuumkonzentratorEppendorf07-748-15
Complete Filtration UnitVWR10040-436
Konische Falkenröhrchen (15 mL)Fisher Scientific05-539-12
Countess II Automatisierter ZellzählerThermoFisher ScientificAMQAX1000Nicht erforderlich, alternativ kann ein Hämozytometer verwendet werden.
CytoTox 96 Nicht-radioaktiver ZytotoxizitätsassayPromegaG1780
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher ScientificR0861Bereiten Sie eine Schüttgutlösung von 1 M DTT vor, schockgefroren und gelagert bei -20 & Grad; C bis zum Gebrauch. Nach jedem Gebrauch entsorgen (nicht wiederholt einfrieren-auftauen).
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX SupplementThermoFisher Scientific10566016
Fetales Rinderserum (FBS)ThermoFisher Scientific12483020Hitzeinaktivierung durch Inkubation bei 60°; C für 30 Minuten. 50 ml Aliquots vorbereiten und schockfrosten. Auftauen vor der Medienvorbereitung
HämozytometerVWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375Bereiten Sie 40 mM HEPES/8 M Harnstoff in Schüttgutlösung vor, schockgefrostet, lagern bei -20°; C bis zum Gebrauch. Nach jedem Gebrauch entsorgen (nicht wiederholt einfrieren-auftauen).
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-SystemThermoFisher ScientificLC140Die Gradientenlänge richtet sich nach der Probenkomplexität, empfohlener Gradient von 120 min für Infektomproben.
Hochauflösendes MassenspektrometerThermoFisher Scientific726042
Iodacetamid (IAA)Sigma AldrichI61250,55 M Schüttgutlösung herstellen, schockgefrostet, lagern bei -20°; C bis zum Gebrauch. Nach jedem Gebrauch entsorgen (nicht wiederholt einfrieren-auftauen).
L-GlutaminThermoFisher Scientific25030081Kann aliquot und zur Lagerung eingefroren werden. Tauen Sie vor der Medienvorbereitung auf.
LoBind MikrozentrifugenröhrchenEppendorf13-698-794
MaxQuanthttps://maxquant.org/MaxQuant ist eine öffentliche Plattform, die Tutorials anbietet, wie z. B. die MaxQuant Summer School, in denen die computergestützten Analyseschritte großer MS-Datensätze beschrieben
werden MikrozentrifugeEppendorf13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10kVWRCA12001-692Kann aliquot und zur Lagerung eingefroren werden. Tauen Sie vor der Medienvorbereitung auf.
Peptid-TrennsäulenThermoFisher ScientificES803
Perseus Softwarehttp://maxquant.net/perseus/
Phosphatgepufferte KochsalzlösungVWRCA12001-676Nicht erforderlich. PBS kann auch hergestellt werden, aber vor der Verwendung muss eine Sterilfiltration durchgeführt werden.
Pierce BCA Protein AssayThermoFisher Scientific 23225
Pipette, serologische Einwegpipette (10 mL)Fisher Scientific13-678-11E
Pipette, serologische Einwegpipette (25 mL) BasixFisher Scientific14955235
SondensondeThermoFisher Scientific100-132-894
Proteasehemmer-CocktailtabletteRoche4693159001
NatriumdodecylsulfatThermoFisher Scientific2836420% (w/v)
Spektralphotometer (Nanotropfen)ThermoFisher ScientificND-2000
STAGE KippzentrifugeSonationSTC-V2
ThermoschüttlerVWRNO89232-908
TrifluoressigsäureThermoFisher Scientific85183
Trypsin/Lys-C Protease-Mix, MS-KlassePierceA40007Bei -20 °C halten.
UltraschallbadBransonicA89375-450Gelagert im Kühlraum (4C)
HarnstoffSigma AldrichU1250-1KGBereiten Sie 40 mM HEPES/8 M Harnstoff in Schüttgutlösung vor, schockgefroren, lagern bei -20 & Grad; C bis zum Gebrauch. Nach jedem Gebrauch entsorgen (nicht wiederholt einfrieren-auftauen).
Hefe-Extrakt Pepton Dextrose BrüheBD DifcoBM20

References

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