Methodenartikel

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

DOI:

10.3791/61890

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22. Dezember 2020

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1Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, Goettingen, Germany, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research), Partner Site Goettingen, Germany, 3Cairn Research Ltd, Faversham, United Kingdom, 4Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Goettingen, Germany

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir die optische Erfassung und Charakterisierung von Aktionspotentialen aus induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen Hochgeschwindigkeits-Photometriesystem.

Zusammenfassung

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Herkömmliche intrazelluläre Mikroelektrodentechniken zur Quantifizierung der Kardiomyozyten-Elektrophysiologie sind extrem komplex, arbeitsintensiv und werden typischerweise bei niedrigem Durchsatz durchgeführt. Die schnelle und kontinuierliche Expansion der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) stellt einen neuen Standard in der kardiovaskulären Forschung dar, und alternative Methoden sind jetzt notwendig, um den Durchsatz elektrophysiologischer Daten auf Einzelzellebene zu erhöhen. VF2.1Cl ist ein kürzlich abgeleiteter spannungsempfindlicher Farbstoff, der eine schnelle einkanalige, hohe Reaktion auf Schwankungen des Membranpotentials bietet. Es verfügt über eine Kinetik, die der anderer vorhandener Spannungsindikatoren überlegen ist, und stellt funktionale Daten zur Verfügung, die denen herkömmlicher Mikroelektrodentechniken entsprechen. Hier demonstrieren wir eine vereinfachte, nicht-invasive Charakterisierung des Aktionspotentials in extern beschleunigten menschlichen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen und äußerst erschwinglichen Photometriesystem.

Einleitung

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Die elektrophysiologische Modellierung von Kardiomyozyten und der Aufbau effizienter Plattformen für das kardiale Arzneimittelscreening sind essentiell für die Entwicklung therapeutischer Strategien für eine Vielzahl von Arrhythmusstörungen. Die rasche Expansion der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) hat vielversprechende Fortschritte in der Modellierung menschlicher Krankheiten und pharmakologischen Untersuchungen mit isolierten patientenbasierten Kardiomyozyten (iPSC-CM) ermöglicht. "Goldstandard" -Techniken zur elektrophysiologischen Charakterisierung dieser Zellen durch Patch-Clamp (Strom-Clamp) können die Morphologie und Dauer des Aktion....

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Protokoll

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1. Zelluläre Präparate

HINWEIS: Menschliche iPSCs, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden von gesunden Spendern abgeleitet und in Monoschichten unter Verwendung vollständig definierter niedermolekularer Modulations- von WNT-Signal- und Laktatreinigungstechniken wie zuvor beschrieben12,13,14unterschieden. iPSC-CMs wurden alle 2-3 Tage mit einem unten beschriebenen Kulturmedium gepflegt.

  1. Bereiten Sie ein Kulturmedium aus Basalmedium (RPMI 1640) und 2% Ergänzung (B27) vor. Bei 4 °C lagern. Bei Raumtemperatur (RT) verwenden.
    2. ....

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Ergebnisse

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Abbildung 3: Profile des optischen Aktionspotentials (AP) isolierter nativer Kardiomyozyten und humaner induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteter Kardiomyozyten (iPSC-CM). (A) Repräsentativer optischer AP eines einzelnen murinen Kardiomyozyten (Mitte) mit mittlerer ± SEM von APD50 und APD90 (n = 7, rechts). (B) Repräsentativer.......

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Diskussion

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Hier beschreiben wir ein grundlegendes Protokoll, um auf einfache Weise detaillierte AP-Profile von isolierten iPSC-CMs zu erfassen, die für die elektrophysiologische Modellierung und das kardiale Drogenscreening geeignet sind. Wir erkennen regelmäßige, robuste APs aus unseren spärlich gesäten iPSC-CMs, was sowohl auf Indikatorfunktionalität als auch auf methodische Genauigkeit hindeutet.

Aufgrund des breiten Spektrums kommerzieller Methoden für die iPSC-Reprogrammierung und der fehlenden Stan.......

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Offenlegungen

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Cairn Research Ltd unterstützte diese Veröffentlichung durch die Übernahme der Produktionskosten der Videodatei.

Danksagungen

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Die Autoren danken Cairn Research Ltd. für ihren freundlichen finanziellen Beitrag, der die Produktionskosten dieser Veröffentlichung gedeckt hat. Darüber hinaus danken wir Frau Ines Mueller und Frau Stefanie Kestel für die hervorragende technische Unterstützung.

Die Forschung der Autoren wird vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Vo 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 und im Rahmen der Exzellenzstrategie - EXC 2067/1- 390729940) und der Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) unterstützt.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
0,25 Trypsin EDTA Gibco 
B27 Beilage Gibco 
CaCl2Carl Roth HN04.2
D(+)-Glukose wasserfrei  BioChemicaITW ReagenzienA1422
Fötales Rinderserum Gibco 10270-106
FluoVolt Membran-Potential-Kit Invitrogen F10488
HEPESCarl Roth HN77.4
KClSigma-Aldrich6781.1
LamaninSigma-Aldrich114956-81-9
Matrigel BD354230
NaCl Sigma-Aldrich9265.2
Nifedipin Sigma-Aldrich21829-25-4
Penicillin/StreptomycinInvitrogen 15140
ROCK-Inhibitor Y27632Stemolekül04-0012-10
RPMI 1640 Medium Gibco 
Versene EDTA Gibco 15040033
Ausrüstung
495LP Dichroitischer Strahlteiler Chroma Technology
Axopatch 200B Verstärker Molecular Devices
Circle Deckgläser, Dicke 0Thermo ScientificCB00100RA020MNT0
Digidata 1550BMolecular Devices
Dual-OptoLED-Netzteil Cairn Research 
ET470/40x Anregungsfilter Chroma Technology
ET535/50mChroma Technology
Geätztes Neubauer HämazytometerHausser Scientific
Filterwürfel Cairn Research 
IX73 Inverses Mikroskop Olympus 
MonoLEDCairn Forschung 
Multiport-Adapter Cairn Research 
Myopacer Zellstimulator IonOptix
Optomask Verschluss Cairn Research 
Optoscan-SystemsteuerungCairn Research 
PH-1 Temperaturgesteuerte Plattform   Warner Instruments 
Photomultiplier-Detektor Cairn Research 
PMT Verstärker EinsatzCairn Research 
PMT Supply InsertCairn Research 
RC-26G Kammer mit offenem Bad Warner Instruments 
SA-OLY/2AL Tischadapter Olympus 
T565lpxr Dichroitischer Strahlteiler Chroma Technology
T660lpxr Dichroitischer StrahlteilerChroma Technology
TC-20 Zweikanal-Temperaturreglernpi Electronic
UPLFLN 40X ObjektivOlympus 
USB 3.0 Farbkamera Imaging Source
Software
Clampex 11.1Molecular Devices 
Clampfit 11.1Molekulare Bauelemente 
IC Capture 2.4 Bildquelle 
Prism 8Graphpad
252000561750404461870010

Referenzen

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  1. Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
  2. Liang, P., et al.

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Schlagwörter

Humane iPSC Kardiomyozytenspannungsabh ngige Farbstoff BildgebungPhotometriesystemFluoreszenzdetektionelektrophysiologische AnalyseZellkulturvorbereitungoptischer AufbauregisterAnwendung beim WirkstoffscreeningRepolarisationsparameter

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