Methodenartikel

Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

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DOI:

10.3791/61895

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30. April 2021

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1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Im Zeitalter der Immuntherapie und des genomischen Profilings von Einzelzellen erfordert die Krebsbiologie neuartige In-vitro- und Computerwerkzeuge, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen. Wir beschreiben Protokolle zur Nutzung von mikrofluidischen Kokulturen des Tumor-Immunsystems in 2D- und 3D-Umgebungen, die mit einer dynamischen, multiparametrischen Überwachung zellulärer Funktionen kompatibel sind.

Zusammenfassung

Komplexe Krankheitsmodelle erfordern modernste Werkzeuge, die in der Lage sind, physiologisch und pathologisch relevante, umsetzbare Erkenntnisse zu liefern und ansonsten unsichtbare Prozesse aufzudecken. Fortschrittliche Zellassays, die die In-vivo-Landschaft genau nachahmen, etablieren sich als neuartige Methoden zur Visualisierung und Messung des bidirektionalen Tumor-Wirt-Zusammenspiels, das das Fortschreiten von Krebs beeinflusst. Hier beschreiben wir zwei vielseitige Protokolle zur Nachbildung hochgradig kontrollierbarer 2D- und 3D-Kokulturen in Mikrogeräten, die die Komplexität der Tumormikroumgebung (TME) nachahmen, unter natürlicher und therapieinduzierter Immunüberwachung. In Abschnitt 1 wird eine experimentelle Umgebung bereitgestellt, um das Übersprechen zwischen adhärenten Tumorzellen und schwebenden Immunpopulationen durch Hellfeld-Zeitraffermikroskopie zu überwachen. Als Anwendungsszenario analysieren wir die Auswirkungen von Krebstherapien, wie z.B. den sogenannten immunogenen Krebszelltod-Induktoren, auf die Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen. In Abschnitt 2 werden 3D-Tumor-Immun-Mikroumgebungen in einem kompetitiven Layout zusammengestellt. Die differentielle Immuninfiltration wird durch Fluoreszenz-Snapshots bis zu 72 h überwacht, um therapeutische Kombinationsstrategien zu bewerten. In beiden Situationen werden Bildverarbeitungsschritte veranschaulicht, um eine Vielzahl von Immunzellparametern zu extrahieren (z. B. Immunzellmigration und -interaktion, Reaktion auf Therapeutika). Diese einfachen und leistungsfähigen Methoden können weiter zugeschnitten werden, um die Komplexität der TME zu simulieren, die die Heterogenität und Plastizität von Krebs-, Stroma- und Immunzell-Subtypen sowie ihre wechselseitigen Wechselwirkungen als Treiber der Krebsevolution umfasst. Die Übereinstimmung dieser sich schnell entwickelnden Technologien mit der High-Content-Bildgebung lebender Zellen kann zur Generierung großer informativer Datensätze führen, was neue Herausforderungen mit sich bringt. In der Tat weist das Dreieck "Co-Kulturen/Mikroskopie/fortgeschrittene Datenanalyse" den Weg zu einer präzisen Problemparametrisierung, die maßgeschneiderte therapeutische Protokolle unterstützen kann. Wir gehen davon aus, dass die zukünftige Integration von Krebsimmun-On-a-Chip mit künstlicher Intelligenz für die Hochdurchsatzverarbeitung einen großen Schritt nach vorne bei der Nutzung der Fähigkeiten als prädiktive und präklinische Werkzeuge für die Präzisions- und personalisierte Onkologie bewirken wird.

Einleitung

Die Entwicklung verschiedener Zweige der Medizin als experimentelle Disziplinen hing von der Fähigkeit ab, Zellpopulationen und Organfunktionen unter kontrollierten Bedingungen zu manipulieren1. Diese Fähigkeit hat ihre Wurzeln in der Verfügbarkeit messbarer Modelle, die in der Lage sind, Prozesse in unserem Körper zu rekapitulieren.

Im Zeitalter der Immuntherapie und des Einzelzell-Genom-Profilings 2 muss die Krebsbiologie die Vorteile neuer In-vitro- und Computermodelle nutzen, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen 2,3.

Die Tumormikroumgebung4 (TME) ist ein komplexes Gewebe, in dem Krebszellen kontinuierlich mit den anderen zellulären (Immun-, Stroma- und Endothelzellen) und nichtzellulären (extrazelluläre Matrix, EZM) Komponenten interagieren und sich dynamisch weiterentwickeln. Die Dynamik dieser komplexen Landschaft bestimmt, ob Immunzellen als Freund oder Feind bösartiger Zellen fungieren, und beeinflusst so sowohl das Fortschreiten der Krankheit als auch das Ansprechen auf die Therapie stark. Heutzutage laufen große Anstrengungen von Onkoimmunologen, Bioinformatikern und Experten für Systembiologie zusammen, um die klinische Bedeutung der Krebsheterogenität 5,6 entweder räumlich (d. h. in verschiedenen Tumorregionen) und zeitlich (d. h. in unterschiedlichen Tumorprogressionsstadien)5,6 zu untersuchen und den Phänotyp und die Funktion von Krebs- und Immunzellen auf Einzelzellebene zu charakterisieren. Als Beispiel für diese Synergie werden heute routinemäßig fortschrittliche Computer-Vision-Techniken für die räumliche Kartierung von Immuninfiltrat in histologischen Proben eingesetzt 7,8.

Neben experimentellen Modellen, die Tierversuche und traditionelle In-vitro-Methoden überbrücken, ermöglichen Fortschritte in der Mikrofluidik und Co-Kultivierungstechniken den Zugang zu verschiedenen Klassen von mikrotechnischen Zellmodellen wie Organoiden, mikrophysiologischen Systemen 9,10,11 (MPS) und Organs-on-Chip12,13,14 (OOC). Sie haben die gemeinsame Eigenschaft, das "große Ganze" der zellulären Ökosysteme zu vergrößern und das In-vitro-Potenzial zur Kontrolle von Mikroumgebungsfaktoren zu erweitern, während gleichzeitig High-Content-Mikroskopie15 und Bildverarbeitungsansätze genutzt werden.

Heutzutage haben hochmoderne MPS- und OOC-Systeme begonnen, immunologische Aspekte einzubeziehen und verschiedene Subtypen von Immunzellen in bestehende Gewebe- und Co-Kulturen einzubauen, um eine Vielzahl von Prozessen wie entzündliche Erkrankungen, Wundheilung, Schleimhautimmunität und Reaktion auf Toxine oder tägliche Nahrungsmittel zu erforschen und zu messen16. Die TME-on-a-Chip-Modelle 10,11,12,13,14,15,16,17, die auch in die perfusierbaren Mikrogefäße 18,19,20,21 integriert sind, wurden entwickelt, um zelltypabhängige Wechselwirkungen, physikalische und chemische Störungen sowie die zytotoxische Aktivität von infiltrierende Lymphozyten22 sowie klinisch relevante immunmodulatorische Wirkstoffe23.

Hier bieten wir vielseitige Protokolle an, die von Ladezellen in Chips bis hin zu Bildverarbeitungswerkzeugen reichen, um fortschrittliche mikrofluidische Tumor-Immun-Co-Kulturen in 2D- (Abschnitt 1) und 3D- (Abschnitt 2) Umgebungen16 zu nutzen, die mit der dynamischen, multiparametrischen24-Überwachung und Visualisierung zellulärer Funktionen kompatibel sind. Dies wird unter Beibehaltung der Benutzerfreundlichkeit und Flexibilität sowohl bei der Probenverwaltung als auch bei der Datenanalyse erreicht, wobei die Vorteile der Fidschi-Freeware-Software und ihrer Toolboxengenutzt werden 25,26.

Die in Abschnitt 1 beschriebene mikrofluidische Vorrichtung ist für die Durchführung von 2D-Kokulturen von adhärenten Krebs- und schwebenden Immunzellen ausgelegt. Diese Plattform wurde für die in vitro Messung des Verhaltens von Immunzellen in Gegenwart genetischer Mutationen27 und/oder Immundefekte28 validiert. Hier veranschaulichen wir Schritte zur Verfolgung von Immunzellen in Zeitraffer-Hellfeldbildern, indem wir eine halbautomatische Methode nutzen, die auf Trackmate (einem in Fidschi-Software implementierten Plugin) basiert. Dieses Verfahren ermöglicht die Extraktion kinematischer Deskriptoren der Immunmigration 29 und der Reaktion (d. h. der Interaktionszeiten) auf Krebszellen, die mit immunogenen Zelltod-Induktoren behandelt wurden oder nicht27.

Wichtig ist, dass diese Parameter, die aus Zeitreihenbildern extrahiert werden, mit fortschrittlichen mathematischen Maschinen verarbeitet werden können. Als Beispiel für die Potenzialität dieses Ansatzes haben unsere Gruppen kürzlich eine Analyse veröffentlicht, die auf mathematischen Methoden aus stochastischen Prozessen und statistischer Mechanik basiert, um zelluläre Netzwerkeigenschaften zu modellieren und eine parametrisierte Beschreibung des Verhaltens von Immunzellen zu liefern (d.h. verzerrter oder unkorrelierter Random Walk, hochgradig oder nicht koordinierte Bewegung30,31).

Die 3D-Einstellung, die im zweiten Abschnitt vorgestellt wird, basiert auf einem Co-Kultur-Protokoll, um komplexere immunkompetente TMEs, die in zwei Gelregionen mit unterschiedlichen Kombinationen von Zelltypen und Medikamenten eingebettet sind, wettbewerbsfähig nachzubilden. Hier werden Bildverarbeitungsschritte beschrieben, um zu verschiedenen Zeitpunkten die Infiltration von gefärbten Immunzellen in humanen A375M-Melanomzellen, die in Matrigel kultiviert werden, zu messen, um Antitumorwirkstoffkombinationen zu bewerten32. Die A375M-Linie, eine von A375P abgeleitete Zelllinie, die durch einen stark metastasierten Phänotyp gekennzeichnet ist, wurde ausgewählt, um ihre Metastasierungsfähigkeit in Gegenwart von Immunzellen zu bewerten32.

Die beschriebenen Modelle können vollständig mit verschiedenen Zellquellen (murine und humane immortalisierte oder primäre Zelllinien, Organoide, Xenotransplantate usw.) kompatibel sein. In neueren Studien unseres Labors wurde durch die Kombination von High-Content-Videomikroskopie mit Bildanalyse das kompetitive 3D-Layout angewendet, um Folgendes zu untersuchen: i) eine antitumorale (antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität, ADCC) Immunantwort und die Rolle von Fibroblasten bei der Resistenz gegen die Trastuzumab-Therapie in HER2+ Brustkrebs-On-Chip-Modellenzu untersuchen 33; ii) die Wirkung myeloischer Zellen (d.h. krebsassoziierter Makrophagen) bei Mechanismen der Tumorevasion und Rekrutierung von T-Zellen34; iii) die Wirksamkeit von immuntherapeutischen Regimen, die speziell auf Interferon-α-konditionierten dendritischen Zellen (IFN-DCs) basieren, die mit medikamentös behandelten Darmkrebszellen in Kollagenmatrizen kultiviert werden, und zur Bewertung der effizienten Bewegung und der nachfolgenden Phagozytoseereignisse35; iv) die chemotaktische Migration von aus dem Knochenmark stammenden Eosinophilen zu IL-33-behandelten oder unbehandelten Melanomzellen36.

Diese fortschrittlichen Modelle könnten als Beobachtungsfenster dienen, um die Rolle der Immunkontexture bei Krebsmetastasen und Resistenzmechanismen zu verstehen, aber es sind Anstrengungen erforderlich, um die Ergebnisse in die Kliniken zu übertragen und die Lücke zur Grundlagenforschung zu schließen37.

Die Nutzung der Leistungsfähigkeit der automatisierten High-Content-Mikroskopie in Verbindung mit der Verwendung physiologisch relevanterer Mikrosysteme eröffnet neue potenzielle Herausforderungen für die Handhabung, Verarbeitung und Interpretation von Hunderten und sogar Tausenden von Gigabyte multiparametrischer Daten, die aus einer einzigen experimentellen Kampagne generiert werden können. Dies impliziert eine direkte Verbindung von OOC-Experimenten mit KI-basierten Algorithmen der künstlichen Intelligenz 38,39,40,41,42 (KI) sowohl für die fortgeschrittene automatisierte Analyse als auch für die Generierung von Merkmalen, die wiederum in silico-Modelle des Krebs-Immun-Zusammenspiels43 einfließen können, mit aufregenden neuen Anwendungen am Horizont, wie z. B.der Entwicklung von prädiktiven Wirkstoff-Screening-Assays 44.

Ein ständig wachsender Fluss von Anstrengungen konzentriert sich auf die Entwicklung von Krankheitsmodellen zusammen mit der Optimierung von Strategien zur Implementierung der groß angelegten Störungsbildschirme mit Einzelzell-Multi-Omics-Auslesungen. Dies wird zweifellos dazu beitragen, einen systematischen Onko-Immunologie-on-a-Chip-Ansatz zu entwickeln und hoffentlich auch klinisch umzusetzen, begleitet von einem angemessenen Grad an Methodenstandardisierung, um neue Einblicke in Immunerkrankungen und Krebsverbreitungsmechanismen zu gewinnen.

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Protokoll

1. Chip-Design für adhärente und schwimmende Zellen 2D-Co-Kulturen

HINWEIS: Das 2D-Co-Kultur-Layout (Abbildung 1A-C) zeichnet sich durch drei Kammern (100 μm hoch) aus, die durch zwei Sätze von Mikrokanal-Arrays (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H) miteinander verbunden sind. Die Zwischenkammer bildet zwei geschlossene Sackgassenkompartimente, die das Überlaufen schwebender Immunzellen in die Tumorstelle während des Ladeschritts 2.5 blockieren. Dieser Gerätetyp eignet sich für zweidimensionale Echtzeitmessungen der Motilität einzelner Zellen (entweder adhärent oder schwimmend) und der Zell-Zell-Interaktionen 16,27,28,30,31. Eine typische Zellmigrationsstudie (die von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen durchgeführt wird) kombiniert Lebendzellmikroskopie mit Bildverarbeitungsalgorithmen45, um die aufgenommenen Bildsequenzen in numerische Merkmale zu übersetzen25. Basierend auf den Migrationsmustern können mehrere biophysikalische Indikatoren abgeschätzt werden, wie z. B. die Verdrängung und Geschwindigkeit von Zellen sowie die Dauer der Interaktionen zwischen Immunzellen und Zielzellen24.

  1. Präparation von Krebs- und PBMC-Zellen
    1. Krebszellkultur
      HINWEIS: MDA-MB-231 dreifach negative [Östrogenrezeptor (ER)-, Progesteronrezeptor (PR)- und humaner epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2)-] menschliche Brustadenokarzinomzellen werden routinemäßig in einem 1640-Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) gezüchtet, das mit 10% (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 IE ml −1 Penicillin G Natriumsalz und 100 μg ml −1 Streptomycinsulfat (Wachstumsmedium) ergänzt wird. unter Standardkulturbedingungen (37 °C und 5 % CO2).
      1. Um das Zellkulturwachstum zu optimieren, werden MDA-MB-231-Zellen in 75 cm2 Flaschen mit einer Dichte von 1 × 106 Zellen mL-1 in 12 bis 15 ml Wachstumsmedium geplattet.
      2. Wenn die Zellen die 75-80% der Konfluenz erreichen, verwerfen Sie das Wachstumsmedium, waschen Sie die Zellen mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um FBS vollständig zu entfernen, und lösen Sie sie dann mit vorgewärmtem Trypsin (1 bis 2 min bei 37 ° C).
      3. Fügen Sie Wachstumsmedium hinzu, um die enzymatische Aktivität von Trypsin zu inaktivieren und abgelöste Zellen zu sammeln. Waschen Sie die Zellen zweimal für 5 min bei 1.100 x g bei Raumtemperatur (RT).
      4. Zählen Sie die Zellen in einem Zellzählobjektträger mit Hilfe des Trypanblau-Farbstoffausschlusstests und säen Sie sie dann entweder für die Erhaltungskultur (für nicht mehr als 6 Durchgänge nach dem Auftauen) oder für experimentelle Verfahren nach.
      5. Für mikrofluidische Experimente werden 1 × 106 Zellen in 6-Well-Platten in 3 ml Wachstumsmedium gesät und entweder mit 25 μM Doxorubicin (DOXO) oder einem gleichen Volumen DOXO-Lösungsmittel (PBS) als Kontrolle behandelt.
      6. Vier bis 6 Stunden danach werden DOXO-behandelte Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS für 5 min bei 1.100 x g RT gewaschen.
      7. Zählen Sie DOXO-behandelte und PBS-behandelte Kontrollzellen wie oben (siehe Schritt 1.1.1.5) und stellen Sie die Kokultur mit mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in mikrofluidischen Geräten ein.
    2. PBMC-Isolation
      1. Sammeln Sie venöses Vollblut (ca. 10 ml) von gesunden Probanden in heparinisierten Fläschchen und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie das Röhrchen 2 bis 4 mal47 umdrehen.
      2. Verdünnen Sie das Blut 1:1 mit PBS und schichten Sie es über 10 ml des Dichtegradientenmediums Lymphoprep in einem 50-ml-Röhrchen.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Schichtung sehr sanft und langsam durchführen, damit Blut und Lymphoprep zwei verschiedene Schichten bilden können.
      3. Zentrifugenröhrchen für 30 Minuten bei 400 x g bei 4 °C in einem ausschwenkbaren Eimer ohne Bremsen. Es bilden sich vier verschiedene Schichten: (i) Plasma an der Spitze, (ii) eine weiße und trübe Schicht mit PBMCs, (iii) Lymphoprep und (iv) ein Pellet aus Erythrozyten und Granulozyten.
      4. PBMCs vorsichtig mit einer 2-ml-Pipette absaugen und sofort in warmem Wachstumsmedium resuspendieren (wie in Schritt 1.1.1 verwendet) und zweimal 5 min bei 1.100 x g RT waschen.
      5. Zähle pelletierte PBMCs wie oben (siehe Schritt 1.1.1.5) und verwende sie entweder für experimentelle Verfahren oder friere sie für die Langzeitlagerung ein.
  2. Beschichtung der Zellen in 2D-Chips
    HINWEIS: PBMCs werden in diesem Protokoll nicht gefärbt. Um spezifische Phänotypen auf dem Chip zu charakterisieren, können Immunzell-Subpopulationen durch immunmagnetische Bead-Selektion isoliert, mit fluoreszierenden Zell-Trackern gefärbt, mit der unmarkierten verbleibenden Fraktion neu gemischt und so mit Zielkrebszellen konfrontiert werden, wie in den On-Chip-Experimenten berichtet, die in Vacchelli et al.27 und in Racioppi et al.34 beschrieben wurden.
    1. Bevor Sie mit Co-Kultur-Experimenten beginnen und die Zugabe von Reagenzien erleichtern, aktivieren Sie die gelagerten Chips durch eine Sauerstoffplasmabehandlung für einige Sekunden. Füllen Sie die Reservoirs sofort mit deionisiertem Wasser oder PBS, um die PDMS-Oberflächen (Polydimethylsiloxan) bis zu den Beschichtungsschritten hydrophil zu halten.
      HINWEIS: PDMS ist von Natur aus hydrophob, was zu Funktionsschwierigkeiten und zum Einschließen von Luftblasen in Mikrokanälen führen kann. Siehe Schritt 7 in der ergänzenden Datei mit Details zur Aktivierung von Sauerstoffplasma.
    2. 20 Minuten unter einem UV-Schrank sterilisieren, 2-3 mal mit frischem PBS waschen und dann 1 h mit Nährmedien inkubieren. Bewahren Sie die Chips im Inkubator auf, bis die Beschichtungsschritte ausgeführt werden.
    3. Entnehmen Sie überschüssige Medien aus allen sechs Behältern. Achten Sie darauf, dass Medien nicht aus den Hauptkulturkammern aufgesaugt werden.
    4. Tragen Sie langsam 1 × 105 Krebszellen auf, die in 10-20 μl Wachstumsmedium im oberen linken Reservoir und dann in der unteren Vertiefung resuspendiert sind (Abbildung 1A, Reservoirs 1 und 2). Warten Sie 5 Minuten, bis die Zellen in der Tumorkammer haften bleiben. Einige Zellen setzen sich in den Reservoirs ab und heften sich an.
      HINWEIS: Führen Sie die Zellsuspension neben den Kanalöffnungen ein. Dieses Verfahren wird auf MDA-MB-231-Krebszellen angewendet, andere Linien erfordern eine Optimierung der Zelldichte. Um die Anhaftung von Krebszellen zu verbessern, kann eine Beschichtungsfunktionalisierung von Oberflächen (z.B. Poly-L-Lysin, Fibronektin) durchgeführt werden. Bitte beachten Sie die zuvor veröffentlichten Protokolle für die Beschichtungsschritte16, 48, 49, 50.
    5. Auf der rechten Seite werden 1 × 106 PBMCs vorsichtig in 50 μl Wachstumsmedium in die Vertiefungen 3 und 4 resuspendiert (siehe Abbildung 1A, Reservoirs 3 und 4).
      HINWEIS: Nach dem Fließen verteilt sich PBMC in der Zwischenkammer und bildet eine "Front", die den Ausgangspunkt des Experiments darstellt.
    6. Füllen Sie alle sechs Behälter mit bis zu 100-150 μl Wachstumsmedium. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen in den Kulturkompartimenten korrekt verteilt haben, wie in Abbildung 1D-E dargestellt. Das endgültige Volumen kann mit der Größe der Reservoirs variieren. Stellen Sie die Volumina so ein, dass sie in allen Vertiefungen gleich sind.
    7. Legen Sie die Chips für ca. 1 h zurück in den Inkubator, um das System vor der Zeitrafferaufnahme zu stabilisieren. Fügen Sie alle 3 Tage frisches Medium hinzu, da es zu Verdunstungsverlusten kommen kann.
      HINWEIS: Das System ist sowohl mit der Lebend-/Totzellanalyse als auch mit der dynamischen Multiplex-Zytokinsekretionsprofilierung aus konditionierten Medien kompatibel. Für Chemokinanalysen können bis zu 200-250 μl Aliquote von Überständen zugänglich sein, indem Medien aus den beiden Reservoirs jedes Kompartiments gesammelt werden. Klassische ELISA- und Luminex-Zytokin-Profiling-Assays benötigen etwa 50 μl Überstände. Bitte sehen Sie sich 51,52 Beispiele für Studien anderer Labore an, die Zytokinprofile an OOC-Modellen durchführen.
  3. Zeitrafferaufnahme von unmarkierten Krebs- und Immunzellen
    HINWEIS: In der Regel sind 3 Chips auf einem einzigen Objektträger angeordnet (siehe Abbildung 1A für den 2D-Chip und Abbildung 4B für den 3D-Chip). Durch die Verwendung von Tischhaltern, die 4 Objektträger zuweisen, können Co-Kulturen durch automatisierte High-Content-Mikroskopie überwacht werden, um große Chargen von Versuchsbedingungen zu analysieren. Die Chips können problemlos auf Objektträgern mit einer Dicke von 1 mm oder 170 Mikrometern (Kunststoff- oder Glasdeckgläser, optische 6-Well-Boden-Multiwells) montiert werden, um eine hochauflösende konfokale Bildgebung zu ermöglichen.
    1. Aufnahme von Hellfeld-Bildserien von unmarkierten Zellen mittels eines Videomikroskopie-Aufbaus, der mit einem Inkubationssystem ausgestattet ist.
      HINWEIS: Hier wurden Zeitreihendatensätze (Zeitfenster: 48 h, Bildrate: 2 min) mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, das mit einem 4-fach-Objektiv und CMOS-Pixeln von 1,3 Mio. Pixeln ausgestattet war und für den Einbau in einen Standard-Zellkultur-Inkubator optimiert war.
    2. Erwärmen Sie das Mikroskop mindestens 2 Stunden lang, um sich auf 37 °C und 5 % CO2 zu äquilibrieren, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen.
    3. Wählen Sie das Beobachtungsfenster aus, indem Sie das Mikrokanal-Array zwischen dem Tumor und dem zentralen Kompartiment zentrieren. Dies ermöglicht es, die Dynamik der Immuninfiltration und die Wechselwirkungen innerhalb der Region, in der Krebszellen ausgesät werden, sichtbar zu machen.
    4. Passen Sie die Beleuchtungsintensität und den Fokus von Krebs- und Immunzellen an.
    5. Um die Zeitrafferaufnahme zu starten, optimieren Sie die Bildrate und die Zeitdauer je nach Experiment und untersuchtem Zelltyp.
      HINWEIS: Die Bildgebungsbedingungen müssen optimiert werden, um eine übermäßige Belichtung zu vermeiden und gleichzeitig ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) aufrechtzuerhalten. Da Immunzellen sehr beweglich sind, muss die Aufnahmebildrate ausreichend hoch sein, um dem interessierenden dynamischen Prozess zu folgen und eine einfache Verfolgungzu ermöglichen 53. Es sollte ein Kompromiss zwischen dem Tracking-Algorithmus, der Kompatibilität mit der Größe des resultierenden Datensatzes und der Lebensfähigkeit, Dichte und Motilität der beobachteten Zellen gefunden werden.
    6. Verwenden Sie am Ende des Zeitraffers die Funktion Bildsequenz importieren und speichern unter der ImageJ-Software, um den Frame-Datensatz in eine unkomprimierte Videodatei mit 25 fps zu konvertieren.
      HINWEIS: Die generierte Videodatei ist jetzt bereit für die Zellen-Tracking-Analyse. Hier wurden RGB-Bilder (1280x1024 Pixel) mit einer räumlichen Auflösung von 1,33 μm/Pixel aufgenommen. Ein Film mit einer Dauer von 24 Stunden (3,5 GB Stapel) mit einem einzigen Sichtfeld (FOV) besteht aus 720 Bildern für jede Bedingung.
  4. Datenanalyse: Halbautomatische Extraktion unmarkierter Immunspuren durch Trackmate
    HINWEIS: Hier wird die Analyse der Immunmotilität in unbeschrifteten 2D-Zeitrafferbildern mit TrackMate durchgeführt54, eine Open-Source-Toolbox, die im Fiji/ImageJ-Softwarepaket (https://imagej.nih.gov/ij/) verfügbar ist. Es stehen mehrere Algorithmen zur Verfügung, um ein automatisiertes Einzelpartikel-Tracking durchzuführen55(SPT) von fleckenförmigen Strukturen. Sie wurden effizient auf fluoreszierende Bilder angewendet, bei denen Objekte auf einem dunklen Hintergrund mit hohem SNR hell sind (d. h. fluoreszierende Flecken mit geringer Auflösung, markierte Verkehrsvesikel, Kerne)1,25,56,57,58. SPT basiert hauptsächlich auf zwei aufeinanderfolgenden Schritten. Zunächst werden Objekte mit identifizierten Positionen in mehreren Frames lokalisiert (Segmentierung), wie in schematisiertAbbildung 2. In der zweiten Stufe (Partikelverknüpfung) werden detektierte Punkte über aufeinanderfolgende Bilder verknüpft, um die Bewegung abzuschätzen und ihre Flugbahnen in Form einer Spur (Abbildung 3). Numerische Merkmale können aus jedem extrahierten X-, Y- und Z-Koordinatenarray im Laufe der Zeit berechnet werden. Ausführliche Dokumentation finden Sie in54sowie online (http://imagej.net/TrackMate), nach dem Tutorial Erste Schritte mit TrackMate. Die Genauigkeit des Prozesses kann sofort überprüft werden, indem eine intuitive grafische Benutzeroberfläche (assistentenähnliche GUI) verwendet wird, die es dem Benutzer ermöglicht, die Einstellungen bei jedem Schritt neu anzupassen. Im folgenden Teil wird kurz beschrieben, wie Trackmate für Bildverarbeitungs- und Quantifizierungsschritte verwendet wird, die auf Bilder im sichtbaren Licht angewendet werden:
    2. Aufbau des Kalibrierungsstapels (Abbildung 2A).
      1. Überprüfen Sie die Dimensionalität und weisen Sie die Bildeigenschaften zu, indem Sie Bild> Eigenschaften auswählen. Füllen Sie die Felder "Längeneinheit", "Pixelabmessungen" und "Rahmenintervall" aus.
        HINWEIS: Verwenden Sie zur Durchführung der Kalibrierung die bekannte Länge der Mikrokanäle (500 μm, Abbildung 1C) und dividieren Sie sie durch die entsprechende gemessene Länge in Pixeln. Stellen Sie bei 2D-Zeitreihen sicher, dass Sie das Z/T-Feld mit der Eingabe von 1 als Z-Slice und der richtigen Anzahl von Filmbildern austauschen. Wenn dies nicht der Fall ist, werden die quantitativen Ausgaben und Parameter von Trackmate in Pixeleinheiten und Zeitrahmen angegeben.
    3. Vorverarbeitung von Bildern.
      1. Um die korrekte Unterscheidung von Immunzellen vor einem verrauschten Hintergrund zu verbessern, sollten Hellfeldbilder vorverarbeitet werden, um Artefakte zu kompensieren. Stellen Sie sicher, dass die Datensätze aus 8-Bit-TIFF-Bildern bestehen (Helligkeitsbereich: 0-255).
        HINWEIS: Ungleichmäßige Beleuchtung, niedriges SNR und Kontamination durch kleine Schmutzpartikel in Bildern im sichtbaren Licht können den Erfolg eines Zellverfolgungsprozesses beeinträchtigen. Hier werden Zeitreihendatensätze durch Hintergrundsubtraktion, Helligkeits-/Kontrastanpassungsfunktion und durch lokale Bildsubtraktion einer Gaußschen Unschärfe von Originalbildern vorverarbeitet. In ImageJ stehen weitere Analyse-Toolkits für die Verarbeitung und Segmentierung von Phasenkontrast- oder Hellfeldbildern zur Verfügung, einschließlich der empirischen Gradientenschwelle (EGT)59.
    4. Erstes Kalibrierpanel (Abbildung 2A)
      1. Starten Sie bei ausgewähltem Bildstapel Trackmate (Plugins>Tracking).  Überarbeiten/bestätigen Sie die Dimensionalität und das zeitliche Fenster der Daten (d. h. Pixelbreite und Bildintervall).
        HINWEIS: TrackMate liest automatisch das Feld für die Bildeigenschaften ein, um die endgültigen Tracking-Ergebnisse in kalibrierten physikalischen Einheiten (d. h. μm und Minuten) anzuzeigen.
      2. Definieren Sie einen Bereich von Interesse, um die Extraktion von Immunspuren zu berechnen, indem Sie Werte manuell einfügen oder einen geschlossenen Bereich über das aktive Bild zeichnen und dann auf die Schaltfläche Quelle aktualisieren klicken. Um globale Immunmigrationspfade zu extrahieren, wählen Sie rechteckige Regionen auf der rechten Seite der Mikrokanäle (zentrale Kammer, Abbildung 1E) bzw. auf der linken Seite (Tumorkammer, Abbildung 1D). Um die Wechselwirkungen zwischen Krebs und Immun-Hotspots zu analysieren, zeichnen Sie kreisförmige Unterregionen mithilfe von ROI-Werkzeugen (gehen Sie zu Bearbeiten → Auswahl → Spezifizieren).
        HINWEIS: Wenn Sie diese Toolbox zum ersten Mal auf einer neuen biologischen Anwendung ausführen, verbringen Sie die notwendige Zeit, um die Einstellungen für die Rekonstruktion der Spuren zu optimieren.
        HINWEIS: Führen Sie eine manuelle Verfolgung der Zelltrajektorien (ca. 50-100 Zellen) durch, um empirisch die richtige Konfiguration zu finden und als Benchmark die Zuverlässigkeit der automatischen Extraktion von Bewegungen zu validieren. Arbeiten Sie außerdem zunächst auf einer kleineren Fläche, um die Genauigkeit der ausgewählten Parameter leicht zu überprüfen.
    5. Schritt zur Erkennung von Immunflecken (Abbildung 2B)
      1. Wählen Sie den Standard-Laplace-of-Gauß-Detektor (LoG) aus. Der LoG-Detektor arbeitet daran, helle, klecksartige, rundliche Objekte zu finden und einen Laplace-of-Gauß-Filter auf das Bild anzuwenden, das auf mittlere Punktgrößen (5 bis 20 Pixel Durchmesser) abgestimmt ist.
      2. Geben Sie im Feld Geschätzter Blobdurchmesser (hier 10-13 μm) einen Wert ein, der etwas größer als die erwartete Punktgröße ist. Erhöhen Sie den Schwellenwert (hier 1-3 μm), bis zusätzliche störende Hintergrundflecken reduziert werden, möglicherweise ohne die Objektmerkmale zu entfernen. Erkennungen unterhalb des Schwellenwerts (basierend auf einer Qualitätsmetrik) werden aus der nachfolgenden Analyse verworfen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für den Medianfilter und die Subpixel-Lokalisierung, um die Qualität der Punkterkennung zu verbessern.
      3. Verwenden Sie die Schaltfläche Vorschau, um identifizierte Immunzellen, die den Bildern von magentafarbenen Kreisen überlagert sind, anzuzeigen und schnell zu untersuchen.
        HINWEIS: Fehler bei der Erkennung haben erhebliche Auswirkungen auf den Verknüpfungsprozess. Andere unerwünschte Erkennungen können in den folgenden Menüs durch benutzerdefinierte Filter korrigiert werden (z. B. nach Spot-Intensität, -Größe oder -Position).
    6. Wenn Sie mit der Auswahl zufrieden sind, klicken Sie auf Weiter.
      HINWEIS: Diese Einstellungen können je nach Versuchsaufbau und Bildgebungsmodalitäten (z. B. Sichtfeld, Objektivvergrößerung, Hellfeld- oder Fluoreszenzbilder), Zelltyp (adhärente oder schwimmende Zellen), langsamer oder schneller Motilität, Art des zellulären Verhaltens (interagierend oder nicht) und niedriger/mittlerer/hoher Dichte im Beobachtungsbereich variieren.
    7. Fahren Sie fort und überspringen Sie das Menü Initial Thresholding. Wählen Sie das Hyperstack Displayer-Fenster aus.
    8. Legen Sie Filter im Spot-Bereich fest (Abbildung 2C).
      1. Wählen Sie: Einheitliche Farbe. Filter, wie in Abbildung 2C dargestellt, können hinzugefügt werden, um beschriftete Punkte mit Feature-Werten, die in einem Histogramm angezeigt werden, über oder unter einem reversiblen Schwellenwert beizubehalten.
    9. Tracker-Auswahlphase (Abbildung 3A). Wählen Sie den Simple LAP-Tracker als Partikelverknüpfungsalgorithmus, der nach drei auszufüllenden Feldern fragt (in diesem Fall "Linking max distance": 30-50 μm, "Gap-closing max distance": 25-50 μm, "Gap-closing max frame gap": 4-6). Dieser Detektor verwaltet lückenschließende Ereignisse, wobei die Berechnung der Kostenbindung ausschließlich auf der jeweiligen Entfernung basiert.
      HINWEIS: Der maximal zulässige Verknüpfungsabstand begrenzt den räumlichen Suchbereich für Kandidaten-Matching-Spots, der der maximal zulässigen Verschiebung zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildern entspricht (Abbildung 3D).
      1. Geben Sie größere Werte für die maximale Verschiebung an, wenn die Fragmentierung von Spuren stark beweglicher Partikel festgestellt wird.
        HINWEIS: Zwei Verbindungen werden nicht verbunden, wenn die Bewegung von Bild zu Bild größer als der angegebene maximale Entfernungswert ist. Wenn Segmente zwei verschiedene Zellen schlecht überbrücken, verringern Sie den Wert der maximalen Verschiebung.
      2. Versuchen Sie, fehlende Stellen wieder zu verbinden, indem Sie die Werte für "den maximalen Abstand zum Schließen des Spalts" und den "maximalen Rahmenabstand" variieren.
        HINWEIS: Diese Parameter befassen sich mit Lückenschließungsereignissen in nicht benachbarten Frames. Bei einigen Bildern kann es zu einem Verschwinden von Flecken kommen (z. B. unscharfe Partikel, Zellen, die im Sichtfeld weggelassen werden, Segmentierungsfehler in einem verrauschten Bild).
        HINWEIS: Um Aufteilungs- oder Zusammenführungsereignisse zu handhaben, entscheiden Sie sich für den LAP-Linker als Detektor, der Strafen für die Verknüpfungskostenmatrix einführt.
    10. Klicken Sie auf Weiter, um die Tracking-Berechnung auszuführen. Klicken Sie auf Weiter.
    11. Bereich "Filtern von Spuren" (Abbildung 3B). Ändern Sie die Farbe der Immunpfade, indem Sie im Dropdown-Menü "Track-ID" oder andere Track-Funktionen auswählen. Wählen Sie an dieser Stelle optional aus, ob Sie interaktive Filter funktional festlegen möchten, um die Qualität des Ergebnisses zu verbessern und das Verfahren erneut zu überprüfen.
      HINWEIS: Störende Flecken entstehen durch Rauschen im Bild und Verlust der Funktionsqualität. Dadurch werden kurze Segmente erzeugt, während die interessierenden Zellen über viele Frames hinweg verfolgt werden können.
      1. Um kurze Pfade zu entfernen, versuchen Sie, basierend auf der Anzahl der darin enthaltenen Punkte herauszufiltern. Darüber hinaus können Sie Spuren mit einer Kombination von Optionen wie Spurverschiebung, Spurdauer oder Minimal/Mittelwert/MaximaleGeschwindigkeit sortieren, um falsche oder unerwünschte Spuren (mit weniger Frames in Bezug auf die Gesamtdauer des Zeitraffers oder mit verschmutzten oder sich nicht bewegenden Partikeln) von der weiteren Nachbearbeitung auszuschließen.
        HINWEIS: Die Auswahl der Filter kann je nach Anwendung und biologischem System variieren.
    12. Untersuchen Sie alle Spuren in der Benutzeroberfläche "Anzeigeoptionen", scrollen Sie durch die Zeit, und überprüfen Sie, wie genau die Spuren mit den Zellmigrationspfaden übereinstimmen. Das Dropdown-Menü bietet Farbcodes für Punkte und Pfade zur einfachen Visualisierung und Filterung nach verschiedenen Modalitäten (z. B. kinetische Parameter, Intensität, zeitliche oder räumliche Position).
      HINWEIS: Erhöhen Sie für die Verfolgung von Kulturen mit hoher Dichte oder hochbeweglichen Zellen die Erfassungsbildrate, um die Zellverschiebung zu minimieren, die in aufeinanderfolgenden Zeitintervallen zurückgelegt wird.
    13. Manuelle Korrektur von Segmentierungs- und Verknüpfungsfehlern (Abbildung 3E).
      1. Um die Qualität der Ergebnisse weiter zu verbessern, bearbeiten Sie Flecken (Trümmerpartikel, stationäre Zellen) manuell und entfernen Sie fehlerhafte Spuren, die sich aus erkannten Tumorgrenzen ergeben, wenn Sie die ROIs der Tumor-Immun-Interaktion analysieren.
      2. Wählen Sie zunächst das TrackMate-Werkzeug in der ImageJ-Symbolleiste aus. Um einen vorhandenen Spot im gesamten Stack zu eliminieren, drücken Sie die Umschalttaste und erstellen Sie mit dem Mauszeiger eine ROI-Maske über dem Zielspot (bearbeitet in einem grünen Kreis) und drücken Sie dann die ENTF-Taste.
      3. Um einen neuen Spot hinzuzufügen (im Falle fehlender Tracks aufgrund des Verschwindens von Spots), drücken Sie die A-Taste und legen Sie die Maus auf die gezeigte Stelle. Wiederholen Sie den Berechnungsprozess zum Verknüpfen von Spuren nach diesem Schritt.
    14. Wenn Sie zufrieden sind, wählen Sie im Bedienfeld "Anzeigeoptionen" die Option "Analyse" aus, um drei Textdateien zu generieren (Abbildung 3C und 3F). Die Tabelle in "Spots in Tracks statistics" enthält die räumlichen und zeitlichen Koordinaten der Immunspots (X-Y-Z-Positionen der Zellen, die mit dem zugehörigen Frame und der Track-Nummer markiert sind). "Links in Track-Statistiken" und "Track-Statistiken" enthalten Informationen zu den Tracks: Track-Dauer, Anzahl der erkannten Lücken oder Spots, Track-Initial und Stop-Frame usw. Speichern und exportieren Sie für jeden Datensatz.
      HINWEIS: Wenn Sie innerhalb der Ergebnisfenster auf eine Zeile klicken, wird der entsprechende Spot, Link oder Track innerhalb des Zeitraffervideos zur visuellen Inspektion aktiviert. Wiederholen Sie die Filterschritte, um Spuren auszuwählen/zu entfernen. Alle zukünftig exportierten Daten werden aktualisiert. TIPP: Track-Initial- und Stop-Frame- und Track-Duration-Werte können verwendet werden, um die Kontaktzeiten zwischen Krebs- und Immunzellen bei der Verarbeitung von ROIs der Interaktion zu berechnen.
    15. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern, um eine resultierende XML-Datei zu generieren, die alle Parameterwerte, den Pfad zu den Bildern und die Punktpositionen in der Zeit enthält. Der Befehl ''Load TrackMate file'' (Plugins> Tracking) stellt die gesamte Prozesssitzung für jede Filmdatei einzeln wieder her.
    16. Wechseln Sie zum letzten Bereich der GUI mit dem Namen Aktion auswählen. Verwenden Sie in der Liste die Funktion "Capture-Overlay" > "Ausführen", um ein Video mit überlagerten Spuren zu erstellen. TIPP: Die Option "N-Punkte in Abhängigkeit von der Zeit darstellen" kann verwendet werden, um die räumliche Dichte von Immunzellen in einem ROI zu berechnen (Abbildung 6B, rechtes Bild).
    17. Post-Processing-Analyse und Migrationsstatistiken
      1. Analysieren Sie die rohen Positionsdaten direkt in Trackmate oder exportieren Sie Daten, um umfassende kinetische Parameter29 zu berechnen (d. h. Gesamttrajektorienlänge, euklidische Entfernung, Einschlussverhältnis, mittlere quadratische Verschiebung56, durchschnittliche oder momentane Spurgeschwindigkeit, Arrestkoeffizient, Verteilung der Migrationswinkel, Vorwärtsmigrationsindex, mittlere geradlinige Geschwindigkeit), um das Migrationsverhalten von Immunzellen zu klassifizieren (z. B. gerichtete oder diffusive Bewegung30, 31) und Reaktion auf Zielkrebszellen (z. B. behandelt vs. Kontrolle).
        HINWEIS: Zusätzliche nützliche Plugins wie das Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) bieten verschiedene Diagramme (z. B. Rose- oder Sektordiagramme, wie in Abbildung 6 dargestellt) und statistische Tests für die erweiterte Analyse und Visualisierung von experimentellen Migrations- und Chemotaxisdaten. Die Kombination von Zellverfolgungs- und Zellsegmentierungsalgorithmen24,25,45 kann Messungen morphologischer Metriken auf Einzelzellebene ermöglichen (d.h. Zelloberfläche, Haupt- und Nebenachsenlänge und Zellseitenverhältnis).

2. Immunkompetentes 3D-Krebs-On-Chip-Modell in einem kompetitiven Assay

HINWEIS: Das inAbbildung 4 dargestellte  3D-Chip-Design besteht aus 5 Hauptkompartimenten: einem zentralen für die Aufnahme von schwimmenden Immunzellen, zwei Seitenbereichen für die Einbettung von Tumorzellen in Hydrogelmatrizen (150-250 μm hoch) und Medienperfusionskammern. Immun- und Tumorkammern sind durch zwei Sätze schmaler Anordnungen von Mikrokanälen verbunden (200×12×10 μm3, L×W×H, Abbildung 4E). Regelmäßige trapezförmige gleichschenklige Mikrosäulen mit einem Abstand von 100 μm (etwa 25-30 Grenzflächen für jede Seitengelregion, Abbildung 4C) wirken als Barrieren für die Eingrenzung der Gellösung während der Injektion, wobei das Gleichgewicht zwischen Oberflächenspannung und Kapillarkräften60,61 ausgenutzt wird und Tumorregionen mit den beiden seitlichen zusätzlichen Medienkammern verbunden werden, um eine Gel-Flüssigkeits-Grenzfläche einzustellen (Abbildung 5). Die detaillierten Merkmale des 3D-Wettbewerbstests sind in Abbildung 4 dargestellt. Die bevorzugte Migration von Immunzellen zu den beiden Hydrogelkompartimenten, in denen sich Tumorzellen befinden, die unterschiedlich behandelt wurden, kann überwacht und quantifiziert werden. Das besondere kompetitive Layout kann angewendet werden, um eine Vielzahl verschiedener krebsbiologischer Phänotypen zu untersuchen (z. B. arzneimittelresistent vs. aggressiv, primär oder metastasiert, Responder vs. Non-Responder). Darüber hinaus können die in Gele eingebetteten Regionen leicht in verschiedene Zellpopulationen integriert werden, um heterogenere TMEs nachzubilden, einschließlich Stromakomponenten (Fibroblasten, Endothelzellen)23 oder um spezifisches immunsuppressives Milieu34 (z. B. Makrophagen) zu simulieren, um Mechanismen der Arzneimittelresistenz und Tumorevasion zu analysieren.
HINWEIS: Die nukleare und aktive Caspase-Färbung kann unter Verwendung kommerzieller Kits für Lebend-/Tot-Assays (z. B. Thermo Fisher Scientific, Incucyte-Reagenzien) implementiert werden, um mitotische oder apoptotische Todesereignisse zu bewerten, wie in Nguyen et al.33 berichtet.

  1. Herstellung der Matrixlösung mit Zellen und Beladung im Gerät
    HINWEIS: In der folgenden Versuchsumgebung enthalten die beiden Gelregionen Mischungen aus humanen A375M-Melanomzelllinien, die in Matrixlösung (z. B. Matrigel) gezüchtet und therapeutischen Wirkstoffen ausgesetzt sind, die als Monotherapie oder in Kombination verwendet werden. Dieses Setting ermöglichte es uns, die Wirksamkeit einer Kombination von zwei Medikamenten in Bezug auf einzelne Medikamente kompetitiv zu bewerten und ihre Fähigkeit, PBMCs anzuziehen, zu quantifizieren.
    1. Tauen Sie einen Vorrat an Matrixlösung (z. B. Matrigel) auf, indem Sie ihn einen Tag vor dem Experiment auf Eis in einen 4 °C warmen Kühlschrank stellen.
      HINWEIS: Setzen Sie das Produkt nicht mehreren Gefrier-Tau-Zyklen aus, da es "klumpt". Andere synthetische oder natürliche Hydrogel-Protokolle können für die Verwendung in dieser Umgebung geeignet sein. Bitte beachten Sie 33,34,35 für die Herstellung von Krebszellen in Kollagenmatrizen.
    2. Resuspendieren Sie menschliche A375-Melanomzellen, gefärbt mit lebendkompatiblem PKH67 Green Fluorescent Cell Linker in Matrixlösung (2 mg mL-1). Falls angegeben, werden 5-Aza-2'-Desoxycytidin (DAC; 2,5 μM), als DAC bezeichnet, und/oder IFN-α2b, als IFN bezeichnet, in den richtigen Dosen32 hinzugefügt.
      HINWEIS: Passen Sie das Los # auf dem Datenblatt der Matrixflasche an. Berechnen Sie basierend auf der Konzentration das Volumen des Mediums, das benötigt wird, um bis zu 2 mg ml-1 herzustellen Bitte passen Sie die optimale Proteinkonzentration und die Konzentration der Krebszellsuspension entsprechend Ihrer gewünschten Anwendung an.
    3. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Halten Sie das Mikrozentrifugenröhrchen während des Mischens auf Eis, um eine unerwünschte Polymerisation zu verhindern.
    4. Stellen Sie die Geräte nach der Sterilisation auf Eis (mit einem Eiskübel und Deckel), um eine Verfestigung der Matrixlösung während des gesamten Vorgangs der Zellbeladung zu vermeiden.
    5. Die beiden IFN- und DAC/IFN-Matrigel/Tumorzell-Mischungen (2-4 μl) werden langsam mit einer 10-μl-Mikropipette unter Verwendung von kalten Spitzen in den linken bzw. rechten Gelport injiziert (Abbildung 5A). Üben Sie leichten Druck aus, um die Matrixlösung von einer Seite zu drücken, bis sie die gegenüberliegende erreicht.
      HINWEIS: Das Volumen der Matrixlösung wurde so gewählt, dass ein Überlaufen in benachbarte Kanäle vermieden wird. Üben Sie keinen übermäßigen Pipettierdruck aus, um zu verhindern, dass die Lösung in das Medium und die zentralen Kanäle gelangt. Wenn während des Ladens der Gelweg entlang des Kanals blockiert ist, versuchen Sie, die Lösung aus dem anderen Einlass einzuführen, bis sich die Gelfronten treffen. Halten Sie beim Entfernen der Mikropipette aus den Einlässen den Kolben fest, da sonst der Unterdruck die Matrixlösung ansaugt.
    6. Stellen Sie das Gerät 30 Minuten lang in aufrechter Position bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator, damit die Matrixlösung geliert werden kann (Abbildung 5B). Behandeln Sie Chips mit eingebettetem nicht polymerisiertem Gel, um ein Austreten aus dem Gelkanal zu verhindern.
    7. In der Zwischenzeit werden PKH67-markierte PBMCs (1x106 Zellen) in 10 μl vollständigem DMEM (modifiziertes Eagle-Medium von Dulbecco) resuspendiert.
    8. Füllen Sie nach der Matrixgelierung die Medienkanäle mit (50-100 μl) dem gleichen Aliquot des Nährmediums in allen sechs Reservoirs, um ein Austrocknen des Gels in den Chips zu verhindern. Im Inkubator aufbewahren, bis die Aussaat der Immunzellsuspension erfolgt.
      HINWEIS: Überprüfen Sie unter dem Mikroskop die korrekte und homogene Verteilung der Tumorzellen im Gel und die Integrität der polymerisierten Gelbarrieren. Teilweise oder nicht gleichmäßig gelierte Bereiche oder Blasen in der Mischung führen zu einem vorzeitigen Fließen von PBMCs in Gelmedienkanälen am Startpunkt des Experiments aufgrund von Druckanfängsschwankungen.
    9. Saugen Sie das Medium aus den sechs Vertiefungen ab und positionieren Sie die Spitze in der Nähe des Einlasses eines Medienkanals, um die PBMC-Zellsuspension mit mäßigem Druck sanft zu injizieren. Die zeitliche Abfolge des Ladens ist in Abbildung 5C dargestellt:
      1. PBMCs in 10 μL Medium in die obere zentrale Vertiefung.
      2. 50-100 μl Medium in jede der vier Vertiefungen der seitlichen Kanäle.
      3. 40-90 μL Medium in die obere zentrale Vertiefung.
      4. 50-100 μl Medium in die untere zentrale Vertiefung.
    10. Stellen Sie unter dem Mikroskop sicher, dass die PBMCs-Verteilung nach dem Ladeschritt in der zentralen Kammer eingeschlossen bleibt. (Abbildung 7A).
      HINWEIS: Wenn es nicht optimal ist, passen Sie die Konzentration bei Bedarf an und wiederholen Sie die Aussaatschritte mit makellosen Spänen. Beziehen Sie sich bei der Berechnung des Volumens für die geplanten Versuchsbedingungen auf eine übermäßige Anzahl von Chips (15-20%), um mögliche Fehler und Anpassungen zu berücksichtigen. Volumina und Konzentrationen sollten je nach Anwendung optimiert werden.
    11. Platzieren Sie die zusammengebauten Geräte auf einer ebenen Fläche im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 für die anschließende Fluoreszenzbildgebung. Gehen Sie vorsichtig mit Chips um, nachdem Sie schwimmende Immunzellen geladen haben.
      HINWEIS: Kompensieren Sie Verdunstungsverluste von Volumen in Reservoirs, indem Sie die Medien alle 2-3 Tage austauschen. Für die Chemokinprofilierung können bis zu 100 μl aus jeder der beiden Vertiefungen von Kulturkompartimenten abgesaugt werden, siehe Schritt 2.7 in Schritt 1.
  2. Automatisierte Zählung von rekrutierten PBMCs in einkanaligen Fluoreszenzbildern in ImageJ
    HINWEIS: Klassische Methoden der Immunfluoreszenz für die konfokale hochauflösende Bildgebung können als Endpunktmessungen auf On-Chip-Operationen angewendet werden. Das grundlegende Färbeverfahren umfasst die Zell-on-Chip-Fixierung, Permeabilisierung, Blockierung, Antikörperbindung und Färbung von Kernen mit dazwischen liegenden Waschschritten. Unmarkierte Immunzellen, die in 3D-Gelregionen mit eingebetteten Krebsmikroumgebungen infiltriert werden, können zu gewünschten Zeitpunkten fixiert und für Expressionsmarker der Aktivierung/Erschöpfung/Reifung gefärbt werden (z. B. für CD8-Zellen, Überwachung von CD69-, CD95-, PD1- und TIM3-Markern). In Parlato et al.35wurde die Phagozytose von apoptotischen SW620-Zellen durch konfokale Mikroskopie unter Verwendung von Geräten untersucht, die auf 170 μm dicken Deckgläsern montiert waren. IFN-DCs wurden unter Zugabe von On-Chip-Anti-Human-HLA-DR-FITC-Ab-Aliquoten gefärbt.
    Um das Ausmaß infiltrierter fluoreszenzgefärbter lebender Immunzellen zu berechnen, die mit kompetitiven Signalen herausgefordert werden, wird ein allgemeiner Bildanalyse-Workflow wie folgt eingestellt (Abbildung 7D-G):
    1. Erfassen Sie zu bestimmten Zeitpunkten Endpunkte, Phasenkontrast und Rot/Grün-Kanäle Fluoreszenz-Mikrofotografien der linken und rechten Gelregionen, die Tumorzellen enthalten, die jeweils einzelnen oder Kombinationen von pharmakologischen Regimen ausgesetzt sind.
      HINWEIS: Hier wurden die Bilder von einem EVOS-FL Fluoreszenzmikroskop nach Zellbeladung (0 h), nach 48 h und nach 72 h Inkubation aufgenommen (Abbildung 7A-B). Eine 4-fache bis 10-fache Vergrößerung wurde verwendet, um die zentrale Kammer, die Mikrokanal-Arrays und die beiden nebeneinander liegenden Seitenkanäle mit A375 plus IFN und A375 plus DAC/IFN zu erfassen.
      1. Berücksichtigen Sie beim Ausführen von Erfassungsvorgängen die zu messenden Parameter und vermeiden Sie die Sättigung der zu zählenden Features. Optimale Segmentierungsergebnisse hängen von der Art der aufgenommenen Bilder ab, aufgrund der Variabilität in den biologischen Proben selbst, der Qualität der Färbung und der Mikroskopietechniken, die für benutzerorientierte Anwendungen verwendet werden.
    2. Laden Sie einkanalige Fluoreszenzdaten (in diesem Fall rot = PBMCs) in Fidschi, indem Sie sie in das Hauptfenster ziehen (Abbildung 7D). Duplizieren Sie das Bild, um zu vermeiden, dass die Rohdaten während der Auswahl der Vorverarbeitungsfilter bis zur endgültigen Segmentierung überschrieben werden.
      1. Wenn es sich bei dem Bild um ein Farbbild (RGB) handelt, drücken Sie Bild > Geben Sie 8 oder 16 Bit ein, um es in Graustufen zu konvertieren. Vergewissern Sie sich, dass die Option "> Optionen bearbeiten" > "Konvertierungen" beim Konvertieren auf "Skalieren" eingestellt ist.
    3. Vorverarbeitung von Rohdaten durch Bereinigung von Rauschen und Artefakten.
      1. Gehen Sie zum Menü "Hintergrund verarbeiten > subtrahieren", indem Sie den Rolling-Ball-Algorithmus anwenden, um einen ungleichmäßigen Rauschhintergrund mit großen räumlichen Intensitätsschwankungen zu korrigieren. Stellen Sie den Radius mindestens auf die Größe des größten Vordergrundpartikels ein. Wählen Sie das Feld Vorschau für das Trial-and-Error-Verfahren aus, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Zu kleine Werte können interessante Strukturen fälschlicherweise entfernen.
      2. Ziehen Sie im Befehl "Helligkeit und Kontrast" die Schieberegler "Minimum/Maximum", um den Intensitätsbereich im Histogramm zu ändern. Verschieben Sie den Schieberegler "Maximum" nach links, um die Helligkeit zu erhöhen, ohne dass es zu Auswaschfunktionen kommt. Verschieben Sie die Minimum-Folie nach rechts, um den Kontrast des Bildes zu erhöhen und zu vermeiden, dass weniger sichtbare Features im Hintergrund verschwinden. Klicken Sie auf Übernehmen, um die Änderungen zu korrigieren.
    4. Bildverbesserung.
      1. Gehen Sie zu > Filter verarbeiten und experimentieren Sie mit den Median-Gauß-Filtern für Bilder (Abbildung 7E).
        HINWEIS: Der Vorfilterradius sollte an die Bildrauschpixel angepasst werden. Der nichtlineare Medianfilter ersetzt den Pixelwert durch den Medianwert der Nachbarn, um das Salz-und-Pfeffer-Rauschen zu reduzieren. "Gaußscher Weichzeichner" wird verwendet, um ein digitales Bild zu glätten, indem Pixel durch einen gewichteten Durchschnitt der umgebenden Pixel ersetzt werden. Die Gewichte stammen aus der Gaußschen Wahrscheinlichkeitsverteilung, so dass die nächsten Pixel einflussreicher sind.
      2. Gehen Sie optional zu Verarbeiten > Mathematik > Gamma mit aktiviertem Kontrollkästchen Vorschau, um den Kontrast zu erhöhen.
        HINWEIS: Die im B&C-Bedienfeld eingestellten Intensitäten werden zwischen den beiden Min- und Max-Grenzwerten skaliert. Werte < 1,0 betonen die Unterschiede zwischen niedrigen Intensitäten, während Werte > 1,0 die Unterschiede zwischen hohen Intensitäten betonen. Die Gammakorrektur dient dazu, einen Anzeigebereich zu finden, der die dunkelsten Objekte anzeigt, ohne die hellsten zu sättigen.
    5. Erstellung einer binären Bildmaske.
      1. Gehen Sie zu Bild > passen Sie > Schwellenwert an. Die am einfachsten anzuwendende Methode zur Bestimmung von Schwellenwerten beruht auf der Histogrammanalyse der Intensitätsstufen, wie in Abbildung 7F gezeigt. Spielen Sie im Dropdown-Menü mit verschiedenen globalen Schwellenwertmethoden (in unserem Fall wird Otsu angewendet).
      2. Scrollen Sie manuell oder geben Sie einen bekannten Bereich von Pixelintensitäten in die Histogrammfelder ein, beobachten Sie die Änderung des roten Musters, das das Bild überlagert und dem tatsächlichen Zellbereich am ähnlichsten ist. Mit der Schaltfläche Zurücksetzen wird das Overlay entfernt. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf Übernehmen, um eine Binärversion des Bildes zu generieren. Aktivieren Sie Prozess- > binäre >Optionen, um zu steuern, wie Bilder mit Schwellenwerten angezeigt werden und wie Objekte vom Partikelanalysator identifiziert werden.
    6. Verwenden Sie den Menübefehl Process/Binary/Watershed Articles, um während des Schwellenwerts teilweise überlappend oder verschmolzen zu teilen. Watershed kann sie oft genau auseinander schneiden, indem eine 1 Pixel dicke Linie hinzugefügt wird. Führen Sie morphologische Vorgänge aus, z. B. Erweitern oder Erodieren, um Pixel aus unter- oder übersättigten Pixeln zu vergrößern oder zu entfernen.
      HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Menübefehle oder in MorphoLib J, einer integrierten Bibliothek zur Verarbeitung von Binärdaten, die auf mathematischer Morphologiebasiert.
    7. Beschreibung der quantitativen Bildmerkmale.
      1. Sobald Sie eine zufriedenstellende Objekterkennung erhalten haben, öffnen Sie den Partikelanalysator unter Analysieren > Partikel analysieren. Partikel können durch ihre Größe und Zirkularität, ausgedrückt in Pixeln oder in einer kalibrierten Maßeinheit, ausgeschlossen werden (überprüfen Sie die richtige Skala relativ zu den Mikroskopeinstellungen unter Bild > Eigenschaften). Um alles einzuschließen, belassen Sie den Standardwert 0-Unendlich und den Standardbereich der Zirkularität bei 0,00 - 1,00 (0 = gerade Linie, 1 = perfekter Kreis).
      2. Um kleine "Rausch"-Pixel oder Features zu filtern, die nicht von Interesse sind, legen Sie den minimalen und maximalen Bereich fest. Aktivieren Sie die Optionen "Löcher einschließen", "Anzeigen", "Umreißen" und "Ergebnisse anzeigen" im Fensterfeld. Mit der Option "An Kanten ausschließen" werden Partikel verworfen, die an den Rändern des Bildes erkannt wurden. Add to Manager fügt die erhaltene Auswahl dem ROI-Manager zur weiteren Analyse hinzu, wobei die Positionsinformationen des Partikels beibehalten werden.
        HINWEIS: Im "ROI-Manager" ist es möglich, die automatische Segmentierung der aufgezeichneten Ausgabe zu korrigieren (geteilte Zellen zusammenführen, zusammengeführte Zellen teilen). Wählen Sie mithilfe der Auswahlwerkzeuge in der Fidschi-Symbolleiste ROIs in beiden Gelregionen aus, in die Krebszellen eingebettet sind, um die Immuninfiltration abzuschätzen.
    8. Exportieren Sie die erhaltenen Werte in eine Tabelle, um eine statistische Analyse durchzuführen, wie in Abbildung 7G gezeigt. "Ergebnisse" listet eine Datentabelle relativ zu den nummerierten, umrissenen Partikeleigenschaften auf. "Zusammenfassen" öffnet ein Fenster mit dem Namen des Bildes, der Gesamtzahl und anderen Informationen für das gesamte Bild.
      1. Gehen Sie zu Analysieren > Legen Sie Messungen fest, um eine breite Palette von Parametern einzubeziehen.
    9. Zeichnen Sie optional ein Makro auf (indem Sie Plugins > Makros > Record auswählen), um den Verarbeitungsworkflow zu automatisieren und Zeit bei der Analyse großer Datensätze zu sparen.
      1. Verwenden Sie die gleiche Verarbeitungsroutine, um den grünen Fluoreszenzkanal in denselben Regionen zu analysieren, um morphologische Veränderungen von Tumorzellen in 3D-Regionen zu analysieren16

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Ergebnisse

Die Tumorimmuninfiltration ist ein Parameter der Anti-Tumor-Reaktion des Wirts. Tumore sind heterogen in Zusammensetzung, Dichte, Lage und Funktionszustand infiltrierender Leukozyten, deren Wechselwirkungen mit Krebszellen klinisch relevanten Informationen zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs und des Ansprechens auf die Therapie zugrunde liegen können. In diesem Sinne könnten mikrofluidische Technologien als komplementäre und privilegierte In-vitro-Werkzeuge eingesetzt werden, um die Immunkontextur von Tumoren zu erfors...

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Diskussion

Die beschriebenen Methoden versuchen, einen allgemeinen Ansatz zu entwickeln, um mit modulierbarem Komplexitätsgrad zwei wichtige Aspekte auf dem Gebiet der Onkoimmunologie zu rekapitulieren, die von der Übernahme relevanterer In-vitro-Modelle profitieren können. Die erste betrifft die Seite der Tumorzellpopulation, wo die Auseinandersetzung mit Einzelzellmerkmalen zu einer besseren Beschreibung der Heterogenität und der korrelierten biologischen und klinischen Bedeutung führen kann, einschließlich Therapieresistenz, Pro...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren. AS wird von der Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) und dem Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273) unterstützt. GS und FM werden von der Italienischen Vereinigung für Krebsforschung (AIRC) Nr. 21366 an G.S. unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellkulturmaterialien 
50 mL RöhrchenCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS430828Zentrifugenröhrchen
5-aza-2'-Desoxycytidin DACMillipore-Sigma; St. Louis, MOA3656DNA-Hypomethylierungsmittel
6-Well-PlattenCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS3506Kulturschalen
75 cm2 ZellkulturkolbenCorning, New York, NY430641UKulturflaschen
A365MAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAbr/> CVCL_B222humane Melanomzelllinie
DoxorubicinhydrochloridMillipore-Sigma; St. Louis, MOD1515Anthrazyklin-Antibiotikum 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEMEuroClone Spa, Mailand, ItalienECM0728LNährmedium für SK-MEL-28  Zellen
Dulbecco's Phosphate Buffer Kochsalzlösung w/o Calcium w/o MagnesiumEuroClone Spa, Mailand, ItalienECB4004LKochsalzlösung
Fetales RinderserumEuroClone Spa, Mailand, ItalienECS0180LZusatz für die Zellkultur
FicollGE-Heathcare17-1440-02Abtrennung von mononukleären Zellen aus menschlichem Blut.
HämozytometerNeubauerZellzähler
Heparinisierte FläschchenThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFläschchen für die venöse Blutentnahme
Interferon alpha-2bMillipore-Sigma; St. Louis, MOSRP4595rekombinantes humanes Zytokin
L-Glutamin 100XEuroClone Spa, Mailand, ItalienECB3000DZusatz für die Zellkultur
Flüssiger Stickstoff
Lympholyt-ZelltrennmediumCedarlane Labs, Burlington, KanadaTrennung von Lymphozyten durch Dichtegradientenzentrifugation
LymphoprepAxis-Shield PoC AS, Oslo, Norwegen
MatrigelCorning, New York, NY354230Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembranmatrix
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA  HTB-26humane Brustkrebszelllinie
Penicillin/Streptomycin 100X   EuroClone Spa, Mailand, ItalienECB3001DZusatz für Zellkultur-Pipettierhilfe
Drummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201Liquid Handling
PKH26 Rot fluoreszierender ZellverbinderMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH26GLrot fluoreszierender Zellfarbstoff
PKH67 Grün fluoreszierender ZellverbinderMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH67GLgrün fluoreszierender Zellfarbstoff
RPMI-1640EuroClone Spa, Mailand, ItalienECM2001Lvon MDA-MB-231-Zellen
(2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Corning-Millipore-Sigma; St. Louis, MOCLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490
Sterile Spitzen für das Liquid Handling (1-10 μ L, 10-20 μ L, 20-200 μ L, 1000 μ L)EuroClone Spa, Mailand, ItalienECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005Tipps für Mikropipetten
Timer
Trypan Blue LösungThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA15250061Zellfärbung zur Beurteilung der Zellviabilität
TrypsinEuroClone Spa, Mailand, ItalienECM0920DDissoziationsreagenz für adhärente Zellen
ZellkulturgeräteEVOS-FL
FluoreszenzmikroskopThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFluoreszenzmikroskop für lebende Zellen
Humifizierter Zellkultur-Inkubator Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA311 Forma Direct Heat COInkubator; TC 230Inkubation von Zellkulturen bei 37°; C, 5% CO2
Juli MikroskopNanoentek
Laborkühlschrank (4 &Grad; C)
(Klasse II)Steril VBH 72 MPLaminar-Flow-Haube
Optisches MikroskopZeiss
KühlzentrifugeBeckman Coulter
Thermostatbad
Mikrofabrikationsmaterialien 
3-Aminopropyl)triethoxysilan (Aptes)Sigma AldrichA3648Silanisierungsmittel für die Bindung von PDMS an Kunststoff-Deckglas
Chromquarzmasken / 4"x4", HRC / Kein AZ MB W& A,  Deutschlandoptische Masken für die Fotolithographie
Glasdeckglas, D 263 M Schott Glas,  (170 ± 5 µ m)Ebd., Deutschland10812
Wasserstoffperoxid-Lösung 30%Carlo Erba Reagenzien412081Reagenzien für Piranha-Lösung
MethylisobutylketonCarlo Erba Reagenzien461945PMMA E-Beam-Resist-Entwickler
Objektträger Mikroskop Objektträger (Packung mit 50 Objektträgern) 76,2 mm x 25,4 mm;Sail Brand7101Substrate zum Verkleben von Chips
Miltex Biopsie-Stanze mit Kolben, ID 1,0 mmTedpelladermale Biopsie-Stanzen für Chip-Reservoire
PMMA  950 kDaAllresist, DeutschlandAR-P. 679.04Positive elektronische Lacke zum Strukturieren optischer Masken
Unbehandelte Polymer-DeckgläserIbidi, Deutschland10813Substrate zum Verkleben von Chips
Prime CZ-Si Wafer,  4", (100), Bor-dotiertGambetti Xenologia Srl, Italien30255
Propan-2-olCarlo Erba Reagenzien415238
Propylenglykolmonomethyletheracetat (PGMEA)Sigma Aldrich484431-4LSU-8 Resists Entwickler
SU-8 3005Mikroresisttechnologie,DeutschlandC1.02.003-0001Negativ Photoresists
SU-8 3050Micro Resist Technology, DeutschlandC1.02.003-0005Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4,0 mm, 6,0 mm, 8,0 mmTedpella15111-40, 15111-60, 15111-80Hautbiopsie-Stanzen für Chip-Reservoire
Schwefelsäure 96%Carlo Erba Reagenzien410381 Reagenzien für Piranha-Lösung
SYLGARD 184 Silikon-Elastomer-KitDowsil, Dow Corning11-3184-01Silikonelastomer (PDMS)
Trimethylchlorsilan (TMCS)Sigma Aldrich92360-100MLSilanisierungsmittel für SU-8 gemusterte Master<
stark>Mikrofabrikationsanlagen
100 kV Elektronenstrahl-LitographieRaith-Vistec EBPG 5HR
Heizplatte
Optisches Litographie-SystemEV-420 Doppelgesichts-Kontaktmasken-Aligner
Reaktives IonenätzsystemOxford plasmalab 80 plus System
Vakuum-Exsikkator
< Nährmedium für serologische Pipetten FDM-Labor-Sicherheitswerkbank

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