Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Bildgebung und Analyse der Krebszellinvasion im 3D-Sphäroid-Modell

Während der Krebsprogression können Krebszellen einen motilen und invasiven Phänotyp erwerben, der es ihnen ermöglicht, der Tumormasse zu entkommen und in das umgebende Gewebe einzudringen¹. Schließlich können diese invasiven Krebszellen in sekundären Organen erreichen und wachsen, ein Prozess namens Krebsmetastasierung¹. Metastasen verursachen mehr als 90% der krebsbedingten Todesfälle². Ein Grund dafür ist, dass, während lokalisierte Tumoren klinisch überschaubar sind, keine effizienten Methoden zur Eliminierung invasiver Krebszellen existieren, sobald eine metastasierende Ausbreitung stattgefunden hat. Daher stellt das Auftreten invasiver Krebszellen und der Übergang von einer lokalisierten zu einer invasiven Krankheit eine große klinische Herausforderung dar. Die Bestimmung, wie Krebszellen ein invasives Verhalten initiieren und aufrecht erhalten, kann zur Entwicklung neuartiger potenter Therapien führen.

Das 3D-Sphäroidmodell ist eine ideale Plattform, um das motile Verhalten von Krebszellen unter kontrollierten, aber physiologisch relevanten Bedingungen zu untersuchen³. Tatsächlich werden in diesem Test Sphäroide von Krebszellen in die extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet, zum Beispiel Kollagen I, das einen vereinfachten Tumor imitiert. Dann wird die Bildgebung verwendet, um die Invasion von Krebszellen aus dem Sphäroid in die Kollagenmatrix zu visualisieren. Mehrere Herausforderungen schränken dieses Verfahren jedoch ein.

Die erste Herausforderung tritt bei der Einbettungsstufe auf, wo sich die flüssige Kollagenmatrix über die Telleroberfläche ausbreiten kann, wodurch das Sphäroid den Boden der Schale berührt. Folglich breiten sich Zellen aus dem Sphäroid auf der zweidimensionalen (2D) Oberfläche aus und brechen die dreidimensionale (3D) Sphäroidmorphologie. Die Erhöhung des Kollagenvolumens ist eine effiziente, aber kostspielige Lösung. Um zu verhindern, dass sich Zellen auf der 2D-Oberfläche ausbreiten und gleichzeitig ein minimales Kollagenvolumen beibehält, haben wir ein Sphäroid-Bildgebungsgerät (SID) entwickelt, indem wir einen 1 mm dicken 3-Loch-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Einsatz auf eine Glasbodenschale begrenzt haben.

Die zweite Herausforderung des Sphäroid-Assays ist die Kennzeichnung von Krebszellen in Sphäroiden, die durch das schlechte Eindringen von Antikörpern und fluoreszierenden Farbstoffen begrenzt wird, ein Effekt, der mit der Sphäroidgröße zunimmt. Während die ideale Lösung für die Kennzeichnung von Zellen die Etablierung von Zelllinien ist, die fluoreszierende Proteine stabil ausdrücken, ist diese Option meist auf verewigte Zelllinien beschränkt und durch die Verfügbarkeit von fluoreszierenden Proteinchimären begrenzt. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung von festen Sphäroiden sowie die effiziente Verwendung eines zytoplasmatischen Farbstoffs zur Kennzeichnung von Zellen unmittelbar vor dem Einbetten des Sphäroids.

Die dritte Herausforderung des Sphäroid-Assays ist das Fehlen einfacher Fidschi-Makros für die halbautomatische Quantifizierung der Zellinvasion im Laufe der Zeit. Um dieser Herausforderung zu begegnen, beschreiben wir eine einfache Methode, um den Sphäroidbereich im Laufe der Zeit zu analysieren. Wir veranschaulichen die Vorteile dieses Protokolls anhand der Zelllinien 4T1 und 67NR als Beispiele.

1. Herstellung eines Spheroid Imaging Device (SID) zur Optimierung der Sphäroideinbettung (Dauer 1 Tag)

1. Erstellen Sie den Abstandsraum mit einem 3D-Drucker(Abbildung 1A, B und Zusatzdatei 1).
2. Ein 10:1 (Wt/Wt)-Verhältnis von Basispolymer:Verkreuzer in einem Kunststoffbecher [z.B. 20 g Ethylbenzol-Basispolymer und 2 g Silikonharzverlinker zur Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)] wiegen.
3. Mischen Sie die PDMS-Lösung im Kunststoffbecher mit einer Einwegpipette gründlich.
4. Legen Sie den Kunststoffbecher in eine Vakuumkammer, um die Luftblasen aus der Mischung zu entfernen. Lösen Sie schnell den Vakuumdruck, um die kleine Menge an Luft, die an der Oberfläche des Gemischs eingeschlossen ist, zu entfernen und die verbleibenden Luftblasen abzuleiten.
5. Inkubieren Sie den 3D-gedruckten Abstandsraum bei 100 °C für 5 min, um seine Flexibilität zu erhöhen.
6. Reinigen Sie die beiden Glasplatten, die verwendet werden, um die PDMS-Form gründlich zu konstruieren, indem Sie sie mit 100% Isopropanol abwischen. Wenn die Glasplatten zuvor verwendet wurden, um PDMS zu gießen, achten Sie darauf, alle verbleibenden alten PDMS zu entfernen, indem Sie die Glasplatten vorsichtig mit einer Rasierklinge kratzen und sie mit 100% Isopropanol abwischen.
7. Konstruieren Sie die Form, indem Sie den 3D-gedruckten Abstandsraum bündig zwischen die beiden sauberen Glasplatten platzieren.
8. Versiegeln Sie die Form mit großen Binderclips an den Außenkanten der Glasplatten. Platzieren Sie zwei Binderclips am unteren rand und einen auf der oberen Ecke.
9. Prüfen Sie den oberen Teil der Form, um sicherzustellen, dass der Abstandsabstand mit den Glasplatten bündig ist. Dadurch wird sichergestellt, dass keine Verformungen vorhanden sind und ein gleichmäßiges Blatt PDMS erstellt wird.
   HINWEIS: Wenn das resultierende Blatt nicht gleichmäßig dick ist, müssen die Clips leicht angepasst werden.
10. Schneiden Sie die Spitze einer Einweg-Pipette (ca. 2 cm von der Spitze) und fügen Sie die PDMS-Mischung mit einer langsamen und konstanten Rate in die obere linke Ecke der Form. Gießen Sie die Mischung langsam, um die Schaffung von großen Lufttaschen zu verhindern.
11. Legen Sie die Form in eine Vakuumkammer, um Luftblasen zu entfernen, die sich während des Gießens gebildet haben.
12. Heilen Sie das PDMS, indem Sie die Form bei 100 °C für 1 h inkubieren.
13. Holen Sie die Form aus dem Inkubator und lassen Sie es abkühlen, um zu berühren.
14. Entfernen Sie die Binderclips und Glasplatten aus dem Abstandsraum, der das ausgehärtete PDMS enthält.
15. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Dichtung zu durchschneiden, die auf allen vier Seiten der Form zwischen dem Abstandshalter und der Glasplatte erstellt wurde. Mit allen vier Seiten geschnitten, beginnen Sie, die Form auseinander zu ziehen, um die PDMS-Platte im Abstandsraum zu offenbaren.
16. Das neue PDMS-Blatt vorsichtig mit einer Pinzette vom Abstandsraum abziehen.
17. Auf einer Schneidmatte PDMS-Scheiben mit einem Durchmesser von 17,5 mm aus dem Blech herausstanzen und dann drei gleichmäßig verteilte Löcher mit 5,5 mm Durchmesser mit biopsieverschiedenen Stempeln unterschiedlicher Größe ausstanzen. Hier werden diese 3-Loch-PDMS-Festplatten als "Inserts" bezeichnet (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Ungleichmäßige Schnitte, die in das PDMS vorgenommen werden, oder eine fehlerhafte Bindung über Plasmabehandlung können zu zukünftigen Leckagen führen.
18. Reinigen Sie jeden Einsatz, indem Sie staubpartikel vorsichtig mit Klebeband entfernen.
19. Stecken Sie die Einsätze auf ein Stück doppelseitiges Klebeband und wickeln Sie das Band um den Deckel einer 10 cm Petrischale.
20. Legen Sie den Deckel der Petrischale in die Plasmamaschine, zusammen mit den offenen 35 mm Glasbodenschalen.
21. Aktivieren Sie die Oberfläche der Einsätze und des Glases über Plasmabehandlung für 1 min bei 300 mTorr. Ein handgehaltener Plasmastab kann verwendet werden.
22. Mit einer Pinzette schnell die Oberseite, d.h. behandelte Seite, eines Einsatzes (Abbildung 1D) an den Glasteil einer Glasbodenschale (Abbildung 1E) zu befestigen. Wiederholen Sie dies für alle Gerichte.
23. Verwenden Sie Zeigerfinger und Daumen, um einen gleichmäßigen Druck anzuwenden, während Sie die Glasbodenschale drehen. Dadurch wird eine stabile Befestigung des Einsatzes an der Glasbodenschale gewährleistet.
24. Inkubieren Sie die SIDs (Abbildung 1F) bei 60 °C für 20 min, um die Haftung zwischen Glas und PDMS zu stärken.
25. Führen Sie eine zweite Runde der Plasmabehandlung auf den SIDs mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 1.21 oder mit dem Handstab durch. Dadurch haftet die freie PDMS-Oberfläche an dem Poly-L-Lysin in der Beschichtungslösung (siehe 1.26).
26. Die folgenden Lösungen frisch vorbereiten.
    1. Beschichtungslösung: 1x PBS mit 0,01% (vol/vol) Poly-L-Lysin [z.B. 10 l 0,1% (vol/vol) Poly-L-Lysin zu 90 l von 1x PBS hinzufügen].
    2. Vernetzungslösung: Destilliertes Wasser mit 1x (vol/vol) Glutaraldehyd [z.B. 10 l 10x Glutaraldehyd zu 90 l destilliertem Wasser hinzufügen].
    3. Lagerungslösung: 1x PBS mit 10x (vol/vol) Penicillin-Streptomycin [z.B. 1 ml 100x Penicillin-Streptomycin zu 9 ml von 1x PBS hinzufügen].
27. Fügen Sie 35 l Beschichtungslösung pro Loch hinzu und brüten Sie 1 h bei Raumtemperatur.
28. Das Poly-L-Lysin ansaugen und den gesamten SID 3 Mal mit destilliertem Wasser abspülen.
29. Fügen Sie 35 L Vernetzlösung pro Lochinkubat für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.
30. Die Vernetzungslösung ansaugen und den gesamten SID dreimal mit destilliertem Wasser abspülen.
31. Fügen Sie 70% Ethanol in jede SID und legen Sie unter ultraviolettem (UV) Licht für 30 min.
32. Unter der Haube Ethanol ansaugen und den SID dreimal mit destilliertem Wasser abspülen.
33. Fügen Sie 2,5 ml Speicherlösung pro SID hinzu.
    HINWEIS: In diesem Stadium können die SIDs eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden. Es wurde beobachtet, dass die Bindungsfestigkeit zwischen PDMS und Glas im Laufe der Zeit abnimmt. Über eine Woche hinaus wird Benutzern empfohlen, die SIDs vor der Verwendung auf mögliche Leckagen zu testen. Um dies zu tun, aspirieren Sie die Speicherlösung und fügen Sie 35 l 1x PBS in jede Bohrung. Nach Gebrauch können PDMS-Einsätze von den Glasbodenschalen abgezogen werden. Um eine optimale Reinigung der Glasbodenschalen zu erreichen, sollten mehrere Wässen mit Isopropanol und Salzsäure verwendet werden, um PDMS-Rückstände zu entfernen.

2. Sphäroidbildung und Einbettung in Kollagen (Dauer 4 Tage)

HINWEIS: Verwenden Sie für die Live-Bildgebung von Sphäroiden längs oder in Zeitraffervideos eine Zelllinie, die ein zytoplasmatisches und/oder nukleares fluoreszierendes Protein ausdrückt. Wenn eine solche Zelllinie verfügbar ist, führen Sie die in diesem Abschnitt beschriebenen Schritte aus. Alternativ wird in Abschnitt 3 ein Protokoll vorgeschlagen, um Krebszellen in Sphäroiden mit einem zytoplasmatischen Farbstoff zu kennzeichnen.

1. Form sphäroide von 4T1 und/oder 67NR Zellen mit der Hängendrop-Technik, wie zuvor beschrieben^4,5,6,7, mit 3.000 Zellen/40 L Tröpfchen und einer 3-Tägigen Inkubationszeit. Fügen Sie das Rind atelocollagen I Lösung zuletzt und halten Sie alle Lösungen auf Eis, zu jeder Zeit.
2. Identifizieren Sie die korrekt geformten Sphäroide mit einem Hellfeldmikroskop.
3. Füllen Sie ein 15 ml kegelförmiges Rohr mit 8 ml vorgewärmten kompletten Medium.
4. Sphäroide mit einer P1000 Pipette sammeln und in das 15 ml konische Rohr übertragen. Befeuchten Sie die Pipettenspitze, indem Sie ein komplettes Medium ein- und auspfeifen, um zu verhindern, dass Sphäroide an den Innenwänden der Pipettenspitze kleben und den Sphäroidverlust begrenzen.
5. Lassen Sie Sphäroide auf den Boden des Rohres sinken und waschen Sie die Sphäroide vorsichtig, indem Sie das Medium austauschen. Wiederholen Sie dies zweimal.
6. Bereiten Sie eine 5 mg/ml Kollagen-I-Lösung gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor (alternatives Gelationsverfahren, siehe beispielhafte Berechnung unten). Ersetzen Sie das destillierte Wasser durch ein komplettes Medium. Bei der Berechnung des Zu verwendenden Mediumvolumens ist zu berücksichtigen, dass Sphäroide in 20 l des vollständigen Mediums zugesetzt werden [z. B., für eine SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 l von 5 mg/ml Kollagen I wird benötigt (vorbereiten 20 % extra für Pipettierverlust beim Umgang mit viskosen Flüssigkeiten zu berücksichtigen); 22 l des kompletten Mediums + 10,8 l von 10x PBS + 1,2 l von 1 M NaOH + 54 l von 10 mg/m CollageLn I Stock].
7. Sammeln Sie alle Sphäroide in 20 L Medium, mit einer P200 Pipette, und fügen Sie sie der Kollagen I Lösung in Schritt 2.6 vorbereitet.
8. Mischen Sie die Lösung langsam, indem Sie nach oben und unten pfeifen, um Heterogenität in der Kollagen-I-Konzentration zu vermeiden und die Blasenbildung zu begrenzen. Halten Sie die Lösung auf Eis.
9. Entfernen Sie die Speicherlösung aus der SID(s) und waschen Sie sie 3 Mal mit 3 ml 1x PBS. Nach der letzten Wäsche, lassen Sie die SID(s) trocken, so dass nicht die Kollagen I Lösung verdünnen.
10. Starten Sie einen Timer und geben Sie 30 l der Kollagen-I-Lösung, die ein Sphäroid enthält, in eines der drei Löcher der SID. Stellen Sie visuell sicher, dass ein einzelnes Sphäroid in den 30 l enthalten ist.
11. Wiederholen Sie Schritt 2.10 zweimal, um alle 3 Löcher einer SID zu füllen.
12. Verwenden Sie eine Pipette-Spitze von 10 L, um das Sphäroid neu zu zentrieren, wenn es sich in der Nähe des PDMS-Rahmens befindet. Wenn zwei oder drei Sphäroide in einer der Löcher abgegeben werden, kann dieselbe Pipettenspitze verwendet werden, um die Sphäroide voneinander zu trennen. Stoppen Sie den Timer.
    HINWEIS: Das häufige Umkehren des SID auf dem Kopf und auf dem Kopf, während der gesamten Periode der Kollagen I Polymerisation und Erstarrung, stellt sicher, dass das Sphäroid in der vertikalen Mitte der ECM-Schicht positioniert ist, und verhindert ein Eindringen von Zellen in 2D. Die Häufigkeit des Invertierens (Flipping) sollte maximiert werden. Da die Kippfrequenz durch das in 2.10-2.12 gemessene Sphäroid "Dosierzeit" gesteuert wird, sollte die Dosierzeit minimiert werden. In unserem Labor beträgt die Abgabezeit durchschnittlich 2 min.
13. Um das Sphäroid in der Kollagenschicht vertikal zu zentrieren, drehen Sie die SID auf den Kopf und brüten bei 37 °C für die Dosierzeit.
14. Drehen Sie die SID nach oben und inkubieren Sie bei 37 °C für die Dosierzeit.
    HINWEIS: Die Zeitspanne, die die Sphäroide in der umgedrehten Ausrichtung verbringen, sollte der Zeit entsprechen, die in der Upside-up-Ausrichtung verbracht wird.
15. Wiederholen Sie die Schritte 2.13 und 2.14 für 30 min, bis das Kollagen I polymerisiert.
16. Fügen Sie 2,5 ml komplettes Medium/SID hinzu, und erfassen Sie bei Bedarf ein Bild der Sphäroide für den anfangs zeitpunkt.
17. Wiederholen Sie die Schritte 2.10-2.16, wenn mehrere SIDs verwendet werden.

3. Fluoreszenzkennzeichnung von Sphäroiden

1. Live-Bildgebung (Dauer 6-7 Tage)
   HINWEIS: Wenn eine Zelllinie verfügbar ist, die ein zytoplasmatisches und/oder nukleares fluoreszierendes Protein exdrückt, führen Sie die in Abschnitt 2 beschriebenen Schritte aus. Alternativ wird für die zytoplasmatische Etikettierung das folgende Protokoll vorgeschlagen.
   1. Befolgen Sie die Schritte 2.1-2.5 des protokolls, das in Abschnitt 2 beschrieben wird.
   2. Verdünnen Sie den zytoplasmatischen Farbstoff auf 25 m in 200 L serumfreiem Medium.
      HINWEIS: Während in diesem Experiment ein roter zytoplasmatischer Farbstoff verwendet wird, sollte jede andere verfügbare Farbe geeignet sein. Krebszellen wurden in Sphäroiden mit Kernfarbstoffen beschriftet, die auf 20 'M in 200 'L serumfreiem Medium verdünnt wurden (siehe Tabelle der Materialien).
   3. Nach der Endwäsche sphärische Sphäroide in der zytoplasmischen oder nuklearen Farbstofflösung resuspendieren und bei Raumtemperatur 20 min vor Licht schützen.
      HINWEIS: Bei diesem Ansatz ist die Beschriftung der Zellen im Sphäroidzentrum nicht effizient. Um die Kennzeichnung aller Zellen zu erreichen, kann die Inkubation über Nacht verlängert werden, indem die Schale auf eine Wippe gesetzt wird. Alternativen werden in der Diskussion beschrieben.
   4. Sphäroide 3 mal in komplettem Medium waschen.
   5. Fahren Sie mit den Schritten 2.6-2.17 des Protokolls fort, das in Abschnitt 2 beschrieben wird.
   6. Bildsphäroide mittels Zeitraffer-Bildgebung alle 10 min für 24-72 h (Abbildung 2) oder über Längsbildgebung, täglich, für bis zu 7 Tage(Abbildung 3). Verwenden Sie ein laserscannendes Konfokalmikroskop, 10x Luftobjektiv (0,4 numerische Blende und 3,1 mm Arbeitsabstand), 1024 x 1024 Pixel, Belichtungszeit 8 s/Pixel, Loch 90 'm, 6 x 15'm z-Schritte und 3 Sichtfelder, die jeweils ein Sphäroid enthalten.
      HINWEIS: Verwenden Sie für die Zeitraffer-Bildgebung minimale Laserleistung und statten das Mikroskop mit einer Umgebungskammer mit Temperatur-, Feuchtigkeits- und Gassteuerung aus. Die eingebetteten Sphäroide bei 37 °C für > 8 h oder über Nacht vor der Bildgebung besanieren, um die Zeit auf dem Mikroskop zu minimieren.
2. Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden (Dauer 2 Tage)
   HINWEIS: Das hier beschriebene Verfahren wird von den zuvor veröffentlichten Protokollen^8,9angepasst und optimiert. Diese Methode kann nach dem in den Abschnitten 2 und 3.1 beschriebenen Protokoll verwendet werden.
   1. Die folgenden Lösungen frisch vorbereiten.
      1. Befestigungslösung: 1x PBS mit 4% PFA (vol/vol) [z.B. 5 ml von 16% (vol/vol) PFA zu 15 ml von 1x PBS hinzufügen].
      2. Befestigungs- und Permeabilisierungslösung: 1x PBS mit 4% PFA (vol/vol) und 0,5% Triton X-100 (vol/vol) [z.B. 50 l Triton X-100 bis 10 ml Befestigungslösung hinzufügen].
      3. Blockierlösung: 1x PBS mit 1% FBS (vol/vol) und 1% BSA (wt/vol) [z.B. 100 mg BSA in 10 ml 1x PBS auflösen, dann 100 l FBS hinzufügen].
      4. Waschlösung: 1x PBS mit 0,05% Tween 20 (vol/vol) [z.B. 25 l Tween 20 bis 50 ml 1x PBS hinzufügen].
   2. Entfernen Sie das Kulturmedium aus der SID(s) und waschen Sie es einmal mit warmen 1x PBS.
   3. Fügen Sie 2 ml Befestigungs- und Permeabilisierungslösung pro SID hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 5 min.
   4. Entfernen Sie die Befestigungs- und Permeabilisierungslösung und fügen Sie 2 ml Befestigungslösung pro SID hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 20 min.
   5. Waschen Sie 3 mal mit der Waschlösung.
   6. Fügen Sie 2 ml Blockierlösung pro SID hinzu und brüten bei 4 °C für 24 h mit leichtem Schütteln.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt können Proben bei 4 °C über das Wochenende inkubiert werden. Bitte beachten Sie, dass eine längere Sperrzeit das Immunfluoreszenz-Etikettierungsverfahren beeinträchtigen kann.
   7. Verdünnung primärer Antikörper in der Blockierlösung.
   8. Fügen Sie 150 L Blockierlösung mit primären Antikörpern/Well in eine 48-Well-Platte ein.
   9. Mit feiner Pinzette, entfernen Sie vorsichtig den Stecker von Kollagen I enthält ein Sphäroid und in einen Brunnen übertragen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn mehrere Sphäroide beschriftet sind. Wischen Sie alle Flüssigkeiten, die bei der Arbeit mit verschiedenen Antikörpern auf der Pinzette verbleiben könnten, um eine Kontamination zu verhindern.
   10. Über Nacht bei 4 °C mit leichtem Schütteln inkubieren.
   11. Fügen Sie 300 L Waschlösung zu leeren und vollen Brunnen.
   12. Übertragen Sie vorsichtig den Kollagenstecker, den ich mit einem Sphäroid in einen "Waschbrunnen" habe.
   13. Waschen Sie 3 mal mit Waschlösung für 2 h, bei Raumtemperatur und mit leichtem Schütteln.
       HINWEIS: Das Übertragen der Kollagenstecker, die ich mit einem Sphäroid enthält, anstatt die Lösungen zu aspimitieren, kann helfen, Probenverluste und Probenschäden zu reduzieren.
   14. Verdünnung von sekundären Antikörpern, 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und/oder Phalloidin in Blockierlösung.
   15. Fügen Sie 150 L Blockierlösung mit sekundären Antikörpern, DAPI und/oder Phalloidin pro Brunnen hinzu.
   16. Mit einer Pinzette den Kollagenstecker mit den Sphäroiden vorsichtig in den Brunnen übertragen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn mehrere Sphäroide beschriftet sind.
   17. Bei Raumtemperatur 1 h mit leichtem Schütteln bebrüten.
   18. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.11 und 3.2.12.
   19. Waschen Sie 3 mal mit Waschlösung für 30 min, bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln.
   20. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge einen 3-Loch-PDMS-Einsatz in drei Teile, so dass jedes Teil eine Bohrung enthält.
   21. Legen Sie zwei PDMS-Stücke auf ein Mikroskopschlitten.
   22. Fügen Sie einen Tropfen Montagelösung mit einer P200-Spitze mit dem Ende abgeschnitten. Verhindern Sie Blasenbildung.
   23. Übertragen Sie vorsichtig ein Kollagen, das ich in jedes Loch stecke.
       HINWEIS: Wenn das Sphäroid an der Oberseite des Kollagensteckers positioniert wurde, invertieren Sie den Kollagenstecker, sodass das Sphäroid näher am Glasdeckel landet.
   24. Legen Sie einen Coverslip auf die Oberseite und versiegeln Sie mit Klebeband.
   25. Lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur 10 min trocknen, vor Licht geschützt.
   26. Proben bei 4 °C lagern, bis zur Bildgebung vor Licht geschützt.

4. Bildverarbeitung zur Analyse der Krebsinvasion im Laufe der Zeit

HINWEIS: Das für dieses Makro erforderliche Format ist ein einkanaliges x,y,t-Bild, das als .tiff Datei gespeichert wird.

1. Wenn mehrere Z-Slices(z. B. x,y,z,t-Bild) erfasst wurden, öffnen Sie das Bild in Fidschi, und wählen Sie Bild | Stacks | Z-Projekt. Es wird empfohlen, die Option Max Intensity zu verwenden. Alternativ kann ein einzelnes Z-Slice verwendet werden, um das Makro auszuführen. Speichern Sie das Bild als .tiff Datei.
2. Erstellen Sie einen separaten Ordner "Verarbeitung" auf dem Desktop.
3. Wählen Sie Datei| Speichern als | Bildsequenz. Verwenden Sie das TIFF-Format, aktualisieren Sie die Ziffernnummer entsprechend der Anzahl der Frames, aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um die Slice-Beschriftung als Dateinamen zu verwenden, und wählen Sie Okaus. Wählen Sie den Ordner "Verarbeitung" aus, der in Schritt 2 erstellt wurde.
4. Öffnen Sie ein Bild aus dem Ordner "Verarbeitung". Es sollte ein xy-Bild sein, das einem einzelnen Zeitpunkt entspricht.
5. Bild | auswählen Anpassen | Auto-Schwellenwert. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Methode Alle ausprobieren und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für weiße Objekte auf schwarzem Hintergrund.
6. Es wird ein Montagebild angezeigt, das das Ergebnis für jede automatisierte Schwellenwertmethode anzeigt.
7. Identifizieren Sie die beste automatisierte Schwellenwertmethode, z. B. RenyIEntropie.
8. Um die Auswahl für die automatisierte Schwellenwertmethode zu bestätigen, öffnen Sie ein anderes Bild aus dem Ordner "Verarbeitung", und testen Sie die gewählte Schwellenwertmethode mit Image | Anpassen | Auto-Schwellenwert.
9. Schließen Sie alle Bilder.
10. Laden Sie das SpheroidAreaTime-Makro (Ergänzende Datei 2) herunter.
11. Öffnen Sie das Fidschi-Makro per Drag-and-Drop.
12. Aktualisieren Sie in Zeile 58 die automatisierte Schwellenwertmethode nach Bedarf.
13. Aktualisieren Sie in Zeile 62 den Größenbereich entsprechend den Zellenabmessungen.
14. Wählen Sie Ausführenaus .
15. Wählen Sie den Ordner "Verarbeitung" aus, und geben Sie "Verarbeitung" als übergeordneten Ordner ein, und wählen Sie dann Okaus.
16. Sobald der Lauf beendet ist, speichern Sie die Tabelle "Zusammenfassung". Die erste Spalte gibt den Namen des Bildes an. die dritte Spalte zeigt den Sphäroidbereich an; Die sechste, siebte und achte Spalte geben die Parameter für eine Ellipse an, die auf das Sphäroid montiert ist.
17. Der Ordner "Verarbeitung" enthält nun ein verarbeitetes Bild für jeden Zeitpunkt, wobei die Erweiterung _SpheroidArea.
    HINWEIS: Wenn das Sphäroidzentrum abgeseut ist, füllen Sie es mit den Auswahlwerkzeugen für alle Zeitpunkte mit Weiß aus, und fahren Sie dann mit Schritt 3 fort. Ebenso kann der Raum um das Sphäroid mit Schwarz gefüllt werden, um das Bild zu "reinigen". Wenn das Bild sauber ist, kommentieren Sie die Zeile 61, um den Lauf zu beschleunigen.

Aufgrund seiner Biokompatibilität wird PDMS häufig für die Mikrofertigung von Grenzbrunnen, Briefmarken und Formen verwendet, was Mikromusterundung und mikrofluidische Geräte revolutionierte. In der hier beschriebenen Methode wird es verwendet, um SIDs zu erstellen, anpassbare Brunnen, die Sphäroid-Einbettung und Bildgebungsverfahren optimieren. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Komponenten, die bei der Herstellung der SIDs verwendet werden. Um die PDMS-Form zu gießen, wird ein 1-mm dicker Abstandsabstand 3D gedruckt (Abbildung 1A,B), zwischen den beiden Glasplatten platziert, mit großen Clips versiegelt. Das Gießen und Backen von PDMS im Raum zwischen den Platten bildet ein 1 mm dickes Blatt PDMS. Der SID-Schaltplan (Abbildung 1C) zeigt die Abmessungen des optimalen Geräts an, jedoch kommt es aufgrund des manuellen Lochens von Löchern mit Biopsiesstanzen zu geringfügigen Abweichungen in den Lochabständen (Abbildung 1D). Abbildung 1D,F zeigt saubere kreisförmige Schnitte mit gleichmäßig verteilten Löchern innerhalb des PDMS-Einsatzes an.

Die Verwendung der SIDs erleichtert eine effiziente Einbettung und damit die Aufzeichnung der Invasion von Krebszellen in Kollagen I mit Zeitraffer (Abbildung 2, Video 1) oder Längsbild ( Abbildung3) Bildgebung. Trotz der Verwendung der gleichen Inversionsfrequenzen für alle SIDs während der Kollagen-I-Polymerisation, sphäroide Positionen innerhalb des Kollagen-Steckers werden leicht variieren. Daher ist es wichtig, ein Ziel mit einem langen Arbeitsabstand (>1 mm) zu verwenden. Andernfalls kann es schwierig sein, sphäroide zu fokussieren und zu bilden, die sich in der Nähe der Oberseite des Kollagensteckers befinden. Im Gegensatz dazu haben Sphäroide, die sich in der Nähe des Bodens des Kollagensteckers befinden, Zellen, die sich auf die Glasoberfläche bewegen und auf dem Glas wandern, anstatt in die Kollagen-I-Matrix einzudringen. Videos solcher Sphäroide müssen verworfen werden. Die Dicke des Kollagensteckers, hier ca. 800 m, wird durch das in jedem Loch der SID abgegebene Volumen gesteuert und an Invasionsabstände angepasst, die Sphäroide in diesem Protokoll aufweisen. Die Dicke des Kollagensteckers kann gesenkt werden, indem in jedem Loch der SID ein geringeres Kollagenvolumen I bei Verwendung kleinerer oder weniger invasiver Sphäroide verwendet wird.

Für eine ordnungsgemäße Analyse der Invasion mit dem Fidschi-Makro ist es entscheidend, dass Krebszellen im Laufe der Bildgebungssitzung ordnungsgemäß gekennzeichnet werden. Wie in Schritt 4.17. erwähnt, ermöglicht der Bildverarbeitungsschritt eine Bildkorrektur, wenn die Beschriftung suboptimal ist. Während wir die Längsbildgebung im Laufe von 6 Tagen veranschaulichen(Abbildung 3), die die stabile Expression von zytoplasmatischem und/oder kernkraftfluoreszierendem Protein erfordert, könnte eine ähnliche Längsbildgebung über einen kürzeren Zeitpunkt mit der Etikettierung mit Farbstoffen durchgeführt werden.

Nach live-Bildgebung präsentieren wir einige Ergebnisse des Immunlabeling-Verfahrens für das Epithel-Cadherin (E-Cadherin), Cortactin und F-Actin (Abbildung 4). In diesen Beispielen haben wir die Zelllinien 4T1 und 67NR verwendet. Abbildung 5 zeigt eine schrittweise Darstellung des Bildverarbeitungsverfahrens mithilfe des Fidschi-Makros, um die Fläche des Sphäroids im Zeitverlauf zu messen.

Abbildung 1: Herstellung der SIDs. (A) Die obere Ansicht ist eine schematische Darstellung des Spacers. (B) 3D gedruckter Abstandsraum. (C) Die schaltplantische Darstellung der SID in der obersten Ansicht. Ein 3-Loch PDMS Einsätze (D) ist an eine Glasbodenschale gebunden (E), wodurch die endgültige SID (F) erstellt wird. Die Abmessungen sind in Millimetern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Live-Bildgebung von Sphäroiden. Repräsentative 20 h und 40 h Zeitpunkte von Video 1, maximale Projektion eines 4T1 Sphäroids. 4T1-Zellen wurden mit einem zytoplasmatischen Farbstoff beschriftet. Maßstabsleiste, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Längsbildgebung von Sphäroiden. Repräsentative Mikrographien (maximale Projektion) eines gemischten 4T1/67NR Sphäroids, das täglich abgebildet wird. 4T1- und 67NR-Zellen drücken das zytoplasmatische mScarlet- bzw. das grüne fluoreszierende Protein (GFP) stabil aus. Maßstabsleiste, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Immunfluoreszenz-Bildgebung von Sphäroiden. Repräsentative Mikrographien (maximale Projektion) eines 4T1-Sphäroids, das 2 Tage nach der Einbettung in Kollagen I fixiert wurde. E-Cadherin (Cyan, A), Cortactin (gelb, B) und F-Actin (Magenta, A und B) wurden beschriftet. Maßstabsleiste, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Bildverarbeitungsanalyse. Schritt-für-Schritt-Illustration des Bildverarbeitungsverfahrens mit dem Fidschi-Makro (A), um die Fläche des Sphäroids im Zeitverlauf zu messen (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Repräsentatives Video eines 4T1-Sphäroids, das alle 10 min für 46 h und 10 min abgebildet wird. 4T1-Zellen wurden mit einem zytoplasmatischen Farbstoff beschriftet. Skala Bar, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: 3D-Modell des Abstands (STL-Datei). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: SpheroidAreaTime Makro. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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