Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.

Zusammenfassung

Sandfliegen sind die natürlichen Vektoren für Leishmanien-Arten, Protozoen-Parasiten, die ein breites Spektrum von Symptomen produzieren, die von Hautläsionen bis hin zu viszeraler Pathologie reichen. Die Entschlüsselung der Art der Vektor-Parasiten-Wechselwirkungen ist von primärer Bedeutung für ein besseres Verständnis der Leishmanie-Übertragung auf ihre Wirte. Unter den Parametern, die die Sandfliegenvektorkompetenz steuern (d.h. ihre Fähigkeit, Krankheitserreger zu transportieren und zu übertragen), spielten parameter, die diesen Insekten innewohnen, eine Schlüsselrolle. Die Insektenimmunantwort zum Beispiel beeinflusst die Sandfliegenvektorkompetenz auf Leishmania. Die Untersuchung solcher Parameter wurde durch das Fehlen von Methoden zur Veränderung der Genexpression eingeschränkt, die für die Verwendung in diesen Nichtmodellorganismen angepasst wurden. Eine Gendownregulation durch kleine störende RNA (siRNA) ist möglich, aber neben der technischen Herausforderung führt das Silencing nur zu einem partiellen Funktionsverlust, der nicht von Generation zu Generation übertragen werden kann. Die gezielte Mutagenese durch CRISPR/Cas9-Technologie wurde kürzlich an die Phlebotomus papatasi Sandfliege angepasst. Diese Technik führt zur Erzeugung übertragbarer Mutationen in einem speziell ausgewählten Ort, der es ermöglicht, die genesweisend zu untersuchen. Das CRISPR/Cas9-System basiert auf der Induktion gezielter Doppelstrang-DNA-Breaks, die später entweder durch Non-Homologous End Joining (NHEJ) oder durch Homology Driven Repair (HDR) repariert werden. NHEJ besteht aus einem einfachen Abschluss der Pause und führt häufig zu kleinen Einfüge-/Löschereignissen. Im Gegensatz dazu verwendet HDR das Vorhandensein eines Spender-DNA-Moleküls, das Homologie mit der Ziel-DNA teilt, als Vorlage für die Reparatur. Hier präsentieren wir eine Sandfliegen-Embryo-Mikroinjektionsmethode zur gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 mit NHEJ, der bisher einzigen Genommodifikationstechnik, die an Sandfliegenvektoren angepasst ist.

Einleitung

Vektorübertragene Krankheiten stellen in ständiger Weiterentwicklung eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Hunderte von Vektorarten, die sich über sehr unterschiedliche phylogene Familien (z. B. Mücken, Zecken, Flöhe) verteilen, sind für die Übertragung einer großen Anzahl von mikrobiellen Krankheitserregern verantwortlich, was nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation zu mehr als 700.000 Todesfällen pro Mensch pro Jahr führt. Unter den Vektorinsekten bilden Phlebotomin-Sandfliegen (Diptera, Psychodidae) eine große Gruppe, mit 80 bewährten Vektorarten, die unterschiedliche phänotypische Merkmale und vektorielle Fähigkeiten aufweisen, die in versc....

Protokoll

Die Verwendung von Mäusen als Blutquelle für die Sandfliegenfütterung erfolgte in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health (NIH). Das Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee des NIAID, NIH (Protokollnummer LPD 68E) genehmigt. Wirbellose fallen nicht unter die NIH-Richtlinien.

1. Nadelpräparation (Abbildung 1)

1. Ziehen Sie Nadeln und Abschrägung, wie in Meuti und Harrell¹⁹beschrieben. Kurz, ziehen Sie Nadeln auf einem zweistufigen Glas Mikropipette Puller, mit Borosilikat ....

Ergebnisse

Das hier beschriebene CRISPR/Cas9-Mikroinjektionsprotokoll zur Erzeugung von Sandfliegenmutanten wurde in einer früheren Publikation⁴eingerichtet. Dieser Ansatz führte zu einer hocheffizienten Mutagenese, da 11 von 540 Personen das Verfahren überlebten, von denen 9 mutiert waren. Beim Entwerfen von Leitfäden für die CRISPR/Cas9-Mutation besteht ein wichtiger erster Schritt darin, die Region um das zielgerichtete Gebiet zu sequenzieren. Die Vorlage für die Sequenzierung sollte von dem Stamm stammen.......

Diskussion

Wir präsentieren hier eine kürzlich entwickelte Embryo-Mikroinjektionsmethode für gezielte Mutagenese von CRISPR/Cas9 in Phlebotomus papatasi Sandfliegen. Embryo-Mikroinjektion zur insektengenetischen Veränderung wurde Mitte der 1980er Jahre²¹ in Drosophila entwickelt und wird heute routinemäßig in einer Vielzahl von Insekten eingesetzt. Andere Methoden zur Lieferung von genetischen Veränderungsmaterialien wurden für den Einsatz in Insekten entwickelt, wie ReMOT^.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Schwarzes Filterpapier 4,25 cm PK100 VWR		28342-012	Schneiden Sie in Rechtecke mit den Maßen 46 x 22 mm. Diese werden zwischen dem Objektträger und dem Deckglas platziert und dienen während der Injektion als feuchte Basisschicht für die Embryonen.
Deckgläser	Fisher Scientific	12-543A
Präpariermikroskop	Jede Marke		Zum Ausrichten von Embryonen
Objektträger Fisher	Scientific	12-550-A3	Basisschicht des Mikroinjektions-Setups Abbildung 2A
Insektenkäfig	nach Maß oder verschiedene kommerzielle Optionen		Polycarbonat-Käfig für erwachsene Tiere, die Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton und Petr Volf. “ Laborbesiedlung und Massenaufzucht von Phlebotomin-Sandmücken (Diptera, Psychodidae)." Parasit 24. Abgerufen am 6. August 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Larvenfutter	nach Maß stellte		. Laborbesiedlung und Massenaufzucht von Phlebotomin-Sandmücken (Diptera, Psychodidae)." Parasit 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Microcaps 100 ml	Drummond	1-000-1000	Wird zum Nachfüllen von Mikroinjektionsnadeln
verwendet Mundsauger	John W. Hock Company	Modell 612	Mundsauger mit HEPA-Filter
Olympus SZX12	Olympus Life Sciences		Mikroinjektionsmikroskop
Ovipots	Nalge Unternehmen		Die Eiablagen werden aus 125-ml- oder 500-ml-Plolypropylen-Gläsern hergestellt, die durch Bohren von 2,5 cm Löchern in den Boden modifiziert und mit 1 cm Pariser Gips gefüllt werden. Rechtsanwalt, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton und Petr Volf. “ Laborbesiedlung und Massenaufzucht von Phlebotomin-Sandmücken (Diptera, Psychodidae)." Parasit 24. Abgerufen am 6. August 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Pinsel 6-0	Any Art Supply Company	n/a	Wird zum Ausrichten von Embryonen
Propionsäure	Sigma-Aldrich	402907	Antimykotikum
Standardglas Kapillaren	World Precision Instruments	1B100-3	Wird zur Herstellung von Mikroinjektionsnadeln
verwendet Trio-MPC100 Controller und MP845 Manipulator	Sutter Instruments		Mikroinjektionscontroller und Mikromanipulator

eine Mischung aus Kaninchenfutter und Kaninchenkot Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton und Petr Volf her verwendet