Summary
نحن نقدم بروتوكولا عمليا وسريعا خطوة بخطوة لإزالة دماغ الفأر وتشريح المناطق المنفصلة من أنسجة المخ الطازجة. أصبح الحصول على مناطق الدماغ للتحليل الجزيئي أمرا روتينيا في العديد من مختبرات علم الأعصاب. يتم تجميد مناطق الدماغ هذه على الفور للحصول على بيانات نسخ عالية الجودة لتحليل مستوى النظام.
Abstract
الدماغ هو مركز القيادة للجهاز العصبي للثدييات وعضو ذو تعقيد هيكلي هائل. يتكون الدماغ المحمي داخل الجمجمة من غطاء خارجي للمادة الرمادية فوق نصفي الكرة الأرضية المعروفين باسم القشرة الدماغية. تحت هذه الطبقة توجد العديد من الهياكل المتخصصة الأخرى التي تعتبر ضرورية لظواهر متعددة مهمة للوجود. يتطلب الحصول على عينات من مناطق دماغية إجمالية محددة خطوات تشريح سريعة ودقيقة. ومن المفهوم أنه على المستوى المجهري، توجد العديد من المناطق دون الإقليمية ومن المحتمل أن تعبر الحدود الإقليمية التعسفية التي نفرضها لغرض هذا التشريح.
تستخدم نماذج الفئران بشكل روتيني لدراسة وظائف الدماغ البشري والأمراض. قد تقتصر التغيرات في أنماط التعبير الجيني على مناطق معينة في الدماغ تستهدف نمطا ظاهريا معينا اعتمادا على الحالة المريضة. وبالتالي ، من الأهمية بمكان دراسة تنظيم النسخ فيما يتعلق بتنظيمه الهيكلي المحدد جيدا. يتطلب الفهم الكامل للدماغ دراسة مناطق الدماغ المتميزة ، وتحديد الروابط ، وتحديد الاختلافات الرئيسية في أنشطة كل منطقة من مناطق الدماغ هذه. قد يمهد الفهم الأكثر شمولا لكل من هذه المناطق المتميزة الطريق لعلاجات جديدة ومحسنة في مجال علم الأعصاب. هنا ، نناقش منهجية خطوة بخطوة لتشريح دماغ الفأر إلى ستة عشر منطقة متميزة. في هذا الإجراء ، ركزنا على إزالة دماغ الفأر الذكر C57Bl / 6J (عمره 6-8 أسابيع) وتشريحه إلى مناطق متعددة باستخدام المعالم التشريحية العصبية لتحديد وأخذ عينات من مناطق الدماغ المنفصلة ذات الصلة وظيفيا والسلوكية. سيساعد هذا العمل في وضع أساس قوي في مجال علم الأعصاب ، مما يؤدي إلى نهج أكثر تركيزا في فهم أعمق لوظائف الدماغ.
Introduction
يتكون الدماغ ، إلى جانب الحبل الشوكي والشبكية ، من الجهاز العصبي المركزي الذي ينفذ السلوكيات المعقدة ، التي تسيطر عليها أنواع الخلايا المتخصصة والدقيقة والمتفاعلة في جميع أنحاء الجسم بأكمله1. الدماغ هو عضو معقد مع مليارات الخلايا العصبية المترابطة والخلايا الدبقية مع دوائر دقيقة تؤدي العديد من الوظائف. وهو هيكل ثنائي مع اثنين من الفصوص المتميزة والمكونات الخلوية المتنوعة2. يربط الحبل الشوكي الدماغ بالعالم الخارجي وهو محمي بالعظام والسحايا والسائل الدماغي الشوكي ويوجه الرسائل من وإلى الدماغ2،3،4. سطح الدماغ ، القشرة الدماغية ، غير متساو وله طيات مميزة ، تسمى gyri ، وأخاديد ، تسمى sulci ، التي تفصل الدماغ إلى مراكز وظيفية5. القشرة ناعمة في الثدييات ذات دماغ صغير 6,7. من المهم توصيف ودراسة بنية الدماغ البشري من أجل فهم الاضطرابات المتعلقة بمناطق الدماغ المختلفة ، وكذلك دوائره الوظيفية. توسعت أبحاث علم الأعصاب في السنوات الأخيرة ويتم استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية لدراسة بنية الدماغ ووظيفته. أدت التطورات في مجالات البيولوجيا الجزيئية وعلى مستوى الأنظمة إلى عصر جديد من استكشاف العلاقة المعقدة بين هياكل الدماغ وعمل الجزيئات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة وعلم الوراثة اللاجينية تتوسع بسرعة ، مما يمكننا من تطوير معرفتنا بالآليات الأساسية المشاركة في كيفية عمل الأنظمة. يمكن إجراء هذه التحليلات على أساس أكثر محلية ، للمساعدة في استهداف التحقيق وتطوير علاجات أكثر فعالية.
يتم تعريف دماغ الثدييات هيكليا في مناطق منفصلة يمكن تحديدها بوضوح. ومع ذلك ، فإن التعقيدات الوظيفية والجزيئية لهذه الهياكل المنفصلة ليست مفهومة بوضوح بعد. إن الطبيعة متعددة الأبعاد والمتعددة الطبقات لأنسجة المخ تجعل من الصعب دراسة هذا المشهد على المستوى الوظيفي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حقيقة أن وظائف متعددة يتم تنفيذها بواسطة نفس الهيكل والعكس بالعكس يزيد من تعقيد فهم الدماغ8. من الأهمية بمكان أن يستخدم النهج التجريبي الذي تم تنفيذه للتوصيف الهيكلي والوظيفي لمناطق الدماغ منهجيات بحث دقيقة لتحقيق الاتساق في أخذ العينات لربط البنية التشريحية العصبية بالوظيفة. تم شرح تعقيد الدماغ مؤخرا باستخدام تسلسل الخلية الواحدة 9,10 مثل التلفيف الصدغي للدماغ البشري الذي يتكون من 75 نوعا متميزا من الخلايا 11. من خلال مقارنة هذه البيانات بتلك الموجودة في منطقة مماثلة من دماغ الفأر ، لا تكشف الدراسة عن أوجه التشابه في بنيتها وأنواع خلاياها فحسب ، بل تعرض أيضا الاختلافات. لكشف الآليات المعقدة ، من المهم دراسة مناطق متنوعة من الدماغ بدقة كاملة. الهياكل والوظائف المحفوظة بين دماغ الإنسان والفأر تمكن من استخدام الفأر كبديل أولي لتوضيح وظيفة الدماغ البشري والنتائج السلوكية.
مع تقدم نهج بيولوجيا النظم ، أصبح الحصول على المعلومات من مناطق الدماغ المنفصلة في القوارض إجراء رئيسيا في أبحاث علم الأعصاب. في حين أن بعض البروتوكولات مثل التشريح المجهري لالتقاط الليزر12 يمكن أن تكون باهظة الثمن ، فإن البروتوكولات الميكانيكية غير مكلفة ويتم تنفيذها باستخدام الأدوات المتاحة بشكل شائع13,14. لقد استخدمنا مناطق دماغية متعددة للمقايسات النسخية15 وطورنا إجراء عمليا وسريعا لتشريح مناطق دماغ الفئران ذات الأهمية بطريقة خطوة بخطوة في وقت قصير. بمجرد تشريحها ، يمكن تخزين هذه العينات على الفور في ظروف باردة للحفاظ على الأحماض النووية والبروتينات في هذه الأنسجة. يمكن تنفيذ نهجنا بشكل أسرع مما يؤدي إلى كفاءة عالية ويسمح بفرص أقل لتدهور الأنسجة. هذا في نهاية المطاف ، يزيد من فرص توليد تجارب عالية الجودة وقابلة للتكرار باستخدام أنسجة المخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء مناولة الحيوانات والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية الأوروبية والوطنية والمؤسسية لرعاية الحيوانات. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في مركز الجيش الأمريكي لأبحاث الصحة البيئية الآن معهد والتر ريد العسكري للبحوث (WRAIR) وتم إجراؤها في منشأة معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبرات الدولية (AAALAC).
ملاحظة: سيتم تنفيذ الإجراء على الفئران الذكور التي تتراوح أعمارها بين ستة وثمانية أسابيع من سلالة C57BL/6j التي تم قتلها عن طريق خلع عنق الرحم16. لا يتم إجراء أي عمليات تروية في مختبرنا ولكن يمكن تعديل هذا البروتوكول حيث يمكن إجراء عمليات التروية لإزالة الدم من الأوعية الدموية. يتم سرد جميع اللوازم اللازمة للتشريح في جدول المواد. ينقسم التشريح إلى ثلاثة مكونات ، بما في ذلك إزالة الدماغ وإزالة الغدة النخامية وتشريح الدماغ. الغرض من جمع أنسجة المخ هو معالجتها للفحوصات النسخية بعد استخراج الحمض النووي الريبي. بمجرد تشريح منطقة الدماغ ، نقوم على الفور بنقل كل منطقة من مناطق الدماغ إلى قارورة تجميد مصنفة بالفعل ثم تخزين القارورة في النيتروجين السائل أو -80 درجة مئوية.
ملاحظة: المعرفة الشاملة بالتشريح العصبي ضرورية لتنفيذ هذا الإجراء. يجب دراسة وتعلم الأقسام الأفقية والطولية ، وكذلك الأقسام العرضية المعتادة. نظرا لأن أنسجة المخ تتحلل بسرعة كبيرة ، فلا يوجد وقت للتشاور مع الأطلس أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
1. إزالة دماغ الماوس
- قم بتثبيت الفك العلوي للرأس المقطوع الرأس باستخدام مرقئ (الشكل 2i) واستخدم وسادة شاش لتعكس فروة الرأس بشكل أكبر مما يخلق حقلا جافا على ظهر الجمجمة (الشكل 2ii).
- أدخل المقص المنحني الناعم في الثقبة العظمية لفصل السحايا الملتصقة. هنا ، أدخل المقص عند الفتحة الموجودة على قاعدة الجمجمة هو الثقبة العظمية ، حيث يمر الحبل الشوكي مع توجيه الشفرة عموديا (موضع الساعة 12) ، ولكن بالتوازي مع السطح الداخلي لعظم الصفيحة القاعدية (أي القرفصاء القذالي) وتدوير الشفرة خمسة وأربعين درجة إلى الجانب الأيسر ثم إلى الجانب الأيمن.
- استمر في تدوير المعصم لانتزاع عظم الصفيحة القاعدية الذي من شأنه أن يقص منتصف العظم المتبقي ويستمر في العظم القذالي والعظام داخل الجدارية متطفلة على العظام اليسرى واليمنى حتى تتم إزالتها. بطريقة مماثلة ، قم بإزالة العظم القذالي والعظم داخل الجداري لفضح المخيخ.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن إزالة البنية العظمية المجوفة المسماة الفقاعات الطبلية، الموجودة على الجزء الخلفي البطني من الجمجمة الذي يحيط بأجزاء من الأذن الوسطى والداخلية، ما لم يكن هناك تشريح للفصوص الخلفية والأمامية للغدة النخامية (الشكل 2iii). - قم بإزالة ملحقات العضلات إلى التلال الصدغية باستخدام شفرة مقصية حادة منحنية. ضع طرفا واحدا من المقص الحاد المنحني تحت خياطة لامبويد التي تخترق تقاطع الجيوب الأنفية العرضية والسهمية (الشكل 2iv).
- قم بتحريك المقص بشكل كبير على طول الخيط السهمي الأوسط حتى البريجما وقطعه بلطف شديد مع رفعه بعناية لأعلى لتجنب تمزق القشرة الدماغية. هذه خطوة حاسمة في الإجراء (الشكل 2v).
- في هذه الخطوة، يتم رفع العظام الجدارية وتدويرها وبالتالي كشط السطح الداخلي للعظم لتحديد وقطع المرفقات السحائية المتبقية. أمسك العظم الصدغي المتطفل ظاهريا ، بعيدا عن الدماغ. قم بإزالة العظم الأمامي من كل جانب باستخدام مقص منحني أو رونجور في المدار وقطع كرونونيا بزاوية قائمة إلى التلال المدارية ، ولكن ليس أبعد من خط الوسط (الشكل 27).
- اصنع قطعتين متوازيتين وعلى بعد حوالي 4 مم في المستوى السهمي (الشكل 28).
ملاحظة: لا تقطع كلا الجانبين بضربة واحدة. - إزالة شظايا العظم الجبهي لتجنب تمزيق سطح الدماغ (الشكل 29). في هذه المرحلة ، استخدم مقص دقيق لقطع الأم الجافية ، والتي يجب أن تكون متاحة بين المصابيح الشمية.
- عكس الجمجمة بلطف للسماح للجاذبية بالمساعدة في إزالة الدماغ ، مع الاستمرار في تحديد وقطع المرفقات السحائية المتبقية والأعصاب القحفية. سيتم إطلاق الدماغ عن طريق قطع أكبر عصب ثلاثي التوائم متصل بالدماغ ويكون مرئيا بوضوح يمتد من قاعدة الجلجثة (الشكل 2x).
ملاحظة: انقل الدماغ إلى محلول ملحي بارد (سترات الصوديوم الباردة الخالية من RNase (0.9٪) أو الفسيولوجية (0.9٪) المالحة) لمزيد من التشريح.
2. تشريح الغدة النخامية الأمامية والخلفية
ملاحظة: يتم تغطية الغدد النخامية بغشاء قوي للغاية يشبه الخيمة ، مع سلسلة من التلال التي تمتد أفقيا بين الأعصاب الثلاثية التوائم اليسرى واليمنى. هذه الهياكل ناعمة وحساسة للغاية ، وعلى هذا النحو ، يوصى بتشريح الفصوص الخلفية والأمامية للغدد النخامية بشكل منفصل على مراحل ، في الموقع ، مباشرة من الجمجمة. مباشرة بعد التشريح ، انقل الغدة النخامية المعنية إلى قارورة محددة مسبقا وخزن القارورة في النيتروجين السائل ويفضل أن يكون ذلك -80 درجة مئوية. تقع الغدة النخامية بالضبط فوق تقاطع العظام القذالية والأساسية. إذا كانت مرنة ، يتم تعطيل بنية الغدة النخامية.
- حافظ على الفقاعات السمعية سليمة للتأكد من أن تشريح الغدة النخامية سليم ويمكن التعرف عليه بسهولة (الشكل 29).
- تشريح الفص الخلفي من الغدة النخامية متبوعا بالفص الأمامي للغدة النخامية ، من بقية الجمجمة.
- قم بعمل قطع شبه سهمي صغير للغاية على كلا الجانبين في حافة الخيمة الغشائية وارفع الفص الخلفي للغدة النخامية بملقط دقيق للغاية ، مع الحرص على عدم تعطيل أنسجة الغدة النخامية الأمامية (الشكل 2x).
- قم بعمل قطع سهمي بين الهوامش الجانبية للفص الأمامي للغدة النخامية وأقرب عصب ثلاثي التوائم وارفع الفص الأمامي للغدة النخامية بعد ذلك (الشكل 2x).
3. تشريح دماغ الفأر
ملاحظة: مباشرة بعد إزالة الدماغ والغدة النخامية ، يتم إجراء مزيد من التشريح على كتلة من الفولاذ المقاوم للصدأ المبردة مسبقا (الشكل 3). بعد التشريح ، ونقل مناطق الدماغ إلى قوارير محددة مسبقا ونقل القوارير ويفضل أن يكون ذلك إلى النيتروجين السائل خلاف ذلك -80 درجة مئوية. من المحتمل أن تشمل الهياكل التي تنتجها الطريقة من أعلى إلى أسفل (بالترتيب الزمني) ما يلي: المخيخ (CB) ، جذع الدماغ / الدماغ الخلفي (pons و medulla oblongata) (HB) ، المصابيح الشمية (OB) كمصابيح شمية ملحقة ، قشرة الفص الجبهي الإنسي (MPFC) ، قشرة الفص الجبهي الجانبية (FCX) ، مخطط الجسم الأمامي والخلفي (ST) ، المخطط البطني (VS) الذي يتكون من النواة المتكئة (NAC) والدرنة الشمية (OT) ، الحاجز (SE) ، المنطقة قبل البصرية ، القشرة الكمثرية (PFM) ، تحت المهاد (HY) ، اللوزة الدماغية (AY) ، الحصين (HC) ، القشرة الحزامية الخلفية (CNG) ، القشرة الأنفية (ERC) ، الدماغ الأوسط (MB) مع المهاد وبقية القشرة الدماغية (ROC) (الجدول 1). سيتم مناقشة مناطق محددة حسب العزلة ، والعمل مع نصف كرة واحد .
- انتبه كثيرا في إزالة الدماغ من الجلجلة حيث قد يتم تدمير المعالم في حالة وجود أي تمزقات. في هذه الخطوة ، قم بإجراء جميع عمليات التشريح باستخدام حماية الوجه ، وعلى وجه التحديد ، قناع مجوهرات 7x ، وسيتم توفير الإضاءة بواسطة مصابيح جراحية موضوعة فوق كل كتف من أكتاف المفكك. سيتم إنجاز الكثير من التشريح باستخدام ملقط منحني صغير في الوضع الحاد (أي ملقط Graefe).
- ضع الدماغ على كتلة من الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 4i والشكل 4ii). حافظ على برودة الكتلة عن طريق إحاطتها بالثلج ومحلول ملحي بارد مثلج. رطب الأنسجة بشكل دوري بمحلول ملحي بارد للحفاظ على الهياكل.
- ضع الدماغ بحيث تكون القشرة الدماغية متجهة لأعلى. باستخدام ملقط منحني صغير ، عكس CB بلطف عن طريق تعريض السيقان المخيخية العليا والمتوسطة والسفلية وإزالة CB (الشكل 4iii والشكل 4iv).
- قم بإجراء قطع منتصف السهمي بدءا من الظهرية وبين OB ونصفي الكرة المخية (الشكل 4v) وتأكد من عدم التمدد أبعد من الوصلة الأمامية. في هذه المرحلة ، يمكن فصل vermis بسهولة عن الأجزاء الجانبية وسيتم الحصول على HB عن طريق قطع إكليلي على الهامش الأمامي للبونس.
- افصل النخاع عن طريق قطع إكليلي عند الهامش الخلفي للبونس.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، سيتم تحويل الدماغ الثنائي ، الجزء الخلفي من الدماغ الأمامي الذي يحتوي على المهاد والمهاد ، تحت المهاد ، والمهاد البطني والبطين الثالث ، إلى الجانب البطني لأعلى ، وسيتم إجراء قطع منتصف السهمي من الخيمة البصرية على السطح. سيكون تشريح نصفي الكرة المخية متبوعا بإزالة OB من أحد نصفي الكرة الأرضية في هذه الخطوة (الشكل 4v والشكل 4vi). - افصل نصفي الكرة المخية (الشكل 4v) قبل تشريح الدماغ بشكل أكبر (الشكل 4v). سيتم استخدام النهج الظهري من خلال تشريح حاد دقيق للحفاظ على معالم خط الوسط البارزة بشكل حاسم. تصور كل اتصال بين نصفي الكرة الأرضية قبل قطعها لأن هذا سيقلل من إمكانية الانحراف عن خط الوسط.
ملاحظة: في هذه الخطوة يمكن الحفاظ على أحد نصفي الكرة المخية (Hemibrain) ويمكن استخدام نصف الكرة الثاني لمزيد من التشريح - انزلق الشفرات المغلقة لملقط صغير منحني ، أسفل الجسم الثفني وانشره بلطف لسحب القشرة المخية الحديثة ثنائيا. الجسم الثفني هو شريط عريض من الألياف العصبية التي تنضم إلى نصفي الكرة الأرضية والتي سيتم تشريحها بصراحة عن طريق القرص مع الملقط ، دون إزعاج هياكل خط الوسط الموجودة تحتها.
ملاحظة: سيكون للوجوه الوسيطة لنصفي الكرة الأرضية العديد من المعالم المرئية مثل الهياكل النخاعية مثل جنس الجسم الثفني ، و fornices ، و commissure الأمامي. أيضا ، على الرغم من بضعة ملليمترات جانبية إلى خط الوسط ، قد يكون الجهاز الثديي و retroflexus اللفافة مرئية أيضا. - تقسيم الهياكل المتعددة التي تعبر خط الوسط. وسيشمل ذلك الجسم الثفني، والكوميسور الأمامي، والكوميسور البطني للفورنيكس، والكوميسور الخلفي، والكوميسور الظهري، والكوميسور فوق الثدي، والكوميسور الكوليكولوسي العلوي، والكوميسور الصدري البطني، والألياف المهادية المحيطة بالبطين.
- انتبه بشكل خاص في هذه الخطوة في خط الوسط أو بالقرب منه والتي قد تتعرض للخطر جزئيا بسبب طريقة النهج الظهري. جميع هياكل المتابعة معرضة للخطر إذا لم يتم تنفيذها بعناية.
- قم بإزالة OB (على شكل إسفين ولون أفتح) والمصابيح الشمية الملحقة متبوعة بمجموعة من MPFC (منطقة القشرة الحزامية 1 ، القشرة الحركية الأمامية وتحت الحليمية والإنسية والمدارية والثانوية [M2]) و FCX عن طريق قطع إكليلي مصنوع 1 مم أمامي من جنس الجسم الثفني (الشكل 47). قسم القسم الناتج على قطع شبه سهمي 1/3 من المسافة من الإنسي إلى السطح الجانبي ، مما ينتج MPFC إنسيابيا وبقية FCX أفقيا. القشرة الحزامية هي تناظرية الفأر من MPFC.
ملاحظة: ستحتوي شريحة الأنسجة هذه أيضا على كمية صغيرة من M2 (القشرة الحركية الثانوية) 17 ولا مفر منها. - قم بعمل قطع إكليلي على مستوى الكومسرور الأمامي مما يؤدي إلى رؤية الطرف الأمامي للجزء الأمامي في المقطع العرضي على الوجه السطحي للمقطع الإكليلي الناتج بينما سيتم الكشف عن الجزء المستعرض في الوجه الذيلي للقسم هذا معلم تأكيدي ل NAC18. يتكون VS من NAC و OT.
ملاحظة: هناك طرف أمامي بالإضافة إلى الجزء المستعرض في الكومشور الأمامي ويسمى الكومشور الأمامي ، pars الأمامي. - قطع جزئيا أفقيا من خلال الجزء المستعرض من الكوميسور الأمامي من خط الوسط أسفل القرن الأمامي للبطين الجانبي، لتحرير نواة الحاجز ظهريا و VS بطنيا. قم بإزالة الكمية الصغيرة من القشرة من السطح الجانبي حيث ستتم إزالة NAC و OT .
- افصل الجزء العلوي من ST عن القشرة العلوية عبر مشرط منحني مقطوع خارج الكبسولة الخارجية مباشرة مع الحرص على عدم تضمين الأنسجة المخططة في العينة القشرية مباشرة. عند هذه النقطة، ستكون نوى الحاجز /SE مرئية ويمكن أخذها بسهولة من هذه الشريحة (الشكل 48).
ملاحظة: يتم تعريف الحدود الأمامية والخلفية ل PFM بواسطة مستويات إكليلية وهمية تتماشى مع الكومسور الأمامي والأجسام الثديية على التوالي. يتم تعريف الحد الإنسي بواسطة الكبسولة الخارجية18. - على السطح الجانبي للقسم نصف الدموي المتبقي من الدماغ الثنائي ، قم بعمل قطع أفقي جزئي على طول التلم الأنفي الممتد سببيا ، ولكن فقط بقدر مستوى المستوى الإكليلي الوهمي مع أجسام الثدي. قم بعمل قطع إكليلي جزئي ، يمتد إنسيابيا 1 مم من السطح القشري الجانبي في مستوى الأجسام الثديية ل HY. هنا ، سيؤدي الشق شبه السهمي في مستوى claustrum إلى تحرير PFM (الشكل 4ix والشكل 4x).
ملاحظة: على السطح الإنسي للقسم الهيمي المتبقي من الدماغ الثنائي ، ستكون العديد من الميزات التشريحية مرئية بما في ذلك الأجسام الثديية ، و retroflexus اللفافة ، و stria medullaris. سيكون النمط نصف الدائري (الجانب المقعر الظهري) مرئيا ، مما يدل على الهامش بين المهاد و HY. سيتم التعرف على HY بسهولة على عرض القسم السهمي الأوسط وفقا للكيزم البصري الأمامي البطني والأمامي والأجسام الثديية جنبا إلى جنب مع اللفافة الرجعية الخلفية. تم عرض المعالم الأخيرة بشكل جيد في الأطلس17 وكذلك في سياق الدماغ الأمامي للفأر الأبيض19. - قم بعمل قطع إكليلي جزئي خلفي لأجسام الثدييات ، يمتد فقط بشكل جانبي حتى التلم تحت المهاد. في هذه المرحلة ، يؤدي قطع شبه سهمي على طول التلم تحت المهاد الآن إلى تحرير HY .
- يستلزم انقلاب البطين الجانبي للكشف عن اتصالات إضافية داخل الحوفية ومكونات الجهاز الحوفي المتبقية. عند عرض الوجه الإنسي للمقطع نصف الدموي المتبقي من الدماغ الثنائي ، سيكون الملقط المنحني هو الخيار الأفضل لأنه يسمح للفني بالتلاعب حول الأقسام الحساسة الأخرى من المنطقة المحيطة المستخدمة لقطع الفورنيكس ويتم إدخالها في البطين الجانبي وتوسيعها بلطف ، باستخدام تشريح حاد لفتح البطين وتدوير HC 90 درجة من المستوى الرأسي إلى المستوى الأفقي. قد يكون من الضروري استخدام الشفرة رقم 11 لتقسيم الضفيرة المشيمية / الضفيرة المشيمية لأن الطرف المدبب يمكن أن يساعد في الجروح الدقيقة.
- قم بتدوير CNG 90 درجة (ولكن في الاتجاه المعاكس من HC) لتكون في المستوى الأفقي. باستخدام الملقط ، قم بتدوير HC برفق 180 درجة أخرى إلى الخارج وأفقيا ، مما سيجعل السطح الداخلي ل ERC مرئيا ومواجها لأعلى.
- سيظهر إشعاع يشبه المروحة من الألياف النخاعية الناشئة عن ERC يتقارب لتشكيل الحزمة الزاوية ، بما في ذلك المسار المثقب وارتباطه ب HC. قم بتدوير المهاد و MB 180 درجة من الناحية الظهرية للكشف عن AY.
- إذا لزم الأمر ، ارفع الجهاز البصري للكشف عن التعلق ب stria terminalis لأنه سيحتوي على أشرطة من الألياف التي تمتد على طول الهامش الجانبي للسطح البطيني للمهاد إلى AY وسيجعل الخطوط العريضة ل AY واضحة.
ملاحظة: سيكون HC و fornix مرئيين بوضوح في مجملهما ، متداخلين في البطين الجانبي ، ويمكن رفعهما بسهولة. سيتم اصطفاف البطين الجانبي مع pia mater وستكون الأصول الشبيهة بالمروحة للمسار المثقب من خلال الجانب الفرعي الشفاف للغاية من ERC مرئية20. - سيكون للسطح الخارجي ل ERC الإنسي طبقة بارزة مرئية من الخلايا الهرمية الكبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، سيكون التقارب الكثيف للألياف الملطخة ب Golgi سمة بارزة في ERC الإنسي. في إجراء التشريح هذا ، بعد قطع البطين الجانبي ، ستكون هذه الألياف مرئية بسهولة على السطح الإنسي من خلال الأم pia ، التي تبطن الأسطح الداخلية للبطينين ، وتشكل بنية بارزة جدا تشبه المروحة.
- لاحظ أن الألياف تتجمع تحت الأرض ، وتنحدر وتغادر ERC البطني ، وتمتد إلى الخلف ثم تصعد عموديا لثقب HC. سيتم استخدام هذا الهيكل الشبيه بالمروحة في ERC لتحديد الهوامش لغرض التشريح. تحديد وإزالة بترتيب هياكل AY و ERC و CNG و HC .
ملاحظة: سيكون تحديد معلم جيد لتشريح AY مفتاحا للخطوة التالية وسيكون التقاطع على الهامش الخلفي حيث يلتقي stria terminalis ب AY نقطة جيدة. - في هذه المرحلة ، تشمل الهياكل المتبقية المهاد و MB. تأكد من تحديد المهاد عن طريق تصور النخاع الشرطي على سطحه الظهري الممتد في المستوى الوردي الذيلي في خط الوسط. افصل المهاد تماما عن الدماغ المتوسط عن طريق قطع ذيلي إكليلي إلى هابينولا وسطح إلى كوليكولي متفوق. يتم حفظ ROC في هذه الخطوة.
- في هذه المرحلة ، يتم جمع جميع مناطق الدماغ بالكامل ، وعلى الفور (كما يتم الحصول على كل منها) ، قم بتخزين العينات المجمدة حتى تتم معالجتها بشكل أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إن فهمنا لبنية الدماغ المعقدة ووظيفتها يتطور ويتحسن بسرعة. يحتوي الدماغ على مناطق متميزة متعددة ويمكن أن يساعدنا بناء خريطة جزيئية على فهم كيفية عمل الدماغ بشكل أفضل. في ورقة المنهج هذه، ناقشنا تشريح دماغ الفأر إلى مناطق متميزة متعددة (الجدول 1). في هذا البروتوكول ، يتم تحديد الهياكل بناء على المعالم الحرجة ويتم تحقيقها عن طريق الحفاظ على رطوبة الأنسجة بمحلول ملحي عن طريق الحفاظ على متانتها للتشريح الفوري. تغطي هذه الطريقة مناطق أكثر من التقارير الأخرى21 وهي مكملة لطرق التشريح باستخدام الأدمغة المجمدة22,23. يمكن الحفاظ على هذه الأنسجة التشريحية ومعالجتها لاحقا اعتمادا على متطلبات الدراسة. الطريقة التي نوقشت هنا هي الإزالة الفورية للدماغ من الجمجمة تليها تشريح يوفر ما يكفي من الأنسجة بطريقة سريعة للفحوصات النهائية بالنظر إلى حجم دماغ الفأر. قام فريقنا باستخراج الحمض النووي الريبي من أنسجة تشريح متعددة وفحصه لتحديد ملامح التعبير الجيني باستخدام المصفوفات الدقيقة لأنسجة المخ. AY و HC و MPFC و SEPTAL REGION و CORPUS STRIATUM و VS وقد تم نشر النتائج15. تم تخزين هذه الأدمغة التي تم حصادها عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر قبل استخراج الحمض النووي الريبي. يمكن اعتماد هذه الطريقة في مزيج من طرق أخرى لتنويع فائدة المصب لمناطق الدماغ. تركز طريقة التشريح هذه على متابعة المعالم بين المناطق المجاورة المتميزة تشريحيا بدلا من كونها تشريحا إكليليا أو سهميا بحتا. تم جمع مناطق الدماغ المتميزة جنبا إلى جنب مع بيانات الوزن في إطار نموذج الإجهاد الاجتماعي المكشوف للمعتدي من اضطراب ما بعد الصدمة16 وتركيزات الحمض النووي الريبي جنبا إلى جنب مع القراءات الطيفية الضوئية كما هو موضح في الشكل 5.
الشكل 1: تمثيل دماغ الفأر مع أنواع الأنسجة المتميزة التي تم جمعها. هذا الرقم هو تمثيل تجميلي للهياكل ولا يتم قياسه إلى أي قاعدة بيانات تم تعيينها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إزالة الدماغ من تجويف الجمجمة متبوعا بإزالة الغدة النخامية. إجراء تدريجي لإزالة الدماغ (i) لقط وعقد بعد إزالة الشعر (ii) تأمين المشبك مع Kimwipe للحفاظ على الشعر بعيدا عن الأنسجة (iii) قبل إزالة العضلات (iv) بعد إزالة العضلات (v) فصل méninges (vi) إزالة الكرة الأرضية / العين (vii) قطع على التلال المدارية (viii) إزالة العظام الجدارية والأمامية (ix) عرض الدماغ وإزالته (x) انفصال الدماغ (xi) عرض الغدة النخامية (xii) إزالة الغدة النخامية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: محطة إعداد التشريح. توضح هذه الصورة الإعداد لتشريح الدماغ بعد إزالة أنسجة الدماغ والغدة النخامية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تشريح الدماغ. إجراء تدريجي لإزالة الدماغ (i) المنظر العلوي للدماغ (ii) المنظر الظهري للدماغ (iii) إزالة المخيخ (iv) الفصل الدماغي (v) تشريح نصفي الكرة الأرضية (vi) إزالة المصباح الشمي (vii) MPFC و FCX والتشريح الشمي الملحق (viii) SE و VS و ST التشريح (ix) إزالة PFM (x) تشريح الجهاز الحوفي يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تظهر البيانات التي تم إنشاؤها بعد جمع العينات (أ) وزن أنسجة المخ و (ب) تركيز الحمض النووي الريبي و (ج) OD 260/280 من كل نسيج من أنسجة المخ. هنا يتم جمع البيانات من المجموعات الضابطة (n = 3-6) من لجنة دراسة كما ورد سابقا15,16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| # | الاختصارات | وصف منطقة الدماغ |
| 1 | سي بي | المخيخ |
| 2 | غبطه | جذع الدماغ / الدماغ الخلفي (بونس والنخاع المستطيل) |
| منفصلة في نصفي الكرة الأرضية | ||
| 3 | ايه بي | المصابيح الشمية والمصابيح الشمية الملحقة |
| 4 | إم بي إف سي | قشرة الفص الجبهي الإنسية |
| 5 | إف سي إكس | قشرة الفص الجبهي الجانبية |
| 6 | حد ذاته | منطقة الحاجز أو الحاجز |
| 7 | مقابل | يتضمن المخطط البطني النواة المتكئة (NAC) والدرنات الشمية (OT) |
| 8 | سانت | مخطط الجسم الأمامي والخلفي |
| 9 | اتش | منطقة ما تحت المهاد |
| 10 | بي إف إم | القشرة الكمعصية |
| 11 | مفوضيه | الحصين |
| 12 | الهلال الأحمر المصري | القشرة الداخلية |
| 13 | الغاز الطبيعي المضغوط | القشرة الحزامية الخلفية |
| 14 | اي | اللوزة الدماغية |
| 15 | ميغابايت | الدماغ المتوسط مع المهاد |
| 16 | رخ | ما تبقى من القشرة الدماغية |
الجدول 1: وصف المناطق المتميزة عن دماغ الفأر. يحتوي هذا الجدول على قائمة بجميع مناطق الدماغ التي تم جمعها مع اختصارها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
دماغ الثدييات هو عضو معقد يتكون من مجموعة من الخلايا المتميزة مورفولوجيا والفريدة وظيفيا مع توقيعات جزيئية متنوعة ومناطق متعددة تؤدي وظائف متخصصة ومنفصلة. يمكن أن يكون لإجراء التشريح المبلغ عنه هنا أهداف متعددة اعتمادا على متطلبات المختبر. في مختبرنا ، قمنا بتقييم النسخ في مناطق دماغية متعددة تم جمعها من الفئران المعرضة لاضطراب ما بعد الصدمة مثل الإجهاد16 . نود أن ندرس بشكل أكبر تأثير الخلفية الجينية للسلالة24 على مستويات التعبير في مناطق الدماغ المتعددة. يحتوي هذا البروتوكول على العديد من الخطوات الحاسمة التي يجب مراعاتها من أجل تكرار التجارب بنجاح. تلعب كل منطقة من المناطق الموضعية في الدماغ دورا متميزا في الحالة العصبية المرضية ولا توجد معرفة مفصلة بمنطقة الدماغ المناسبة للدراسة. لذلك من المهم إنشاء مجموعة البيانات المتعلقة بمنطقة الدماغ. وبالتالي ، لا يمكن الاستعلام عن البيانات فقط عن طريق اختيار منطقة الدماغ ولكن أيضا عن طريق فئة البيانات (على سبيل المثال ، Transcriptome ، البروتين ، الخلية (الخلوية) ، أو غيرها) مما يؤدي إلى معلومات أكثر دقة. في السابق ، تبين أن الأنسجة مثل البصيلة الشمية والقشرة الأمامية والمخطط والحصين في أنسجة دماغ الفئران الطازجة يتم تشريحها باستخدام المجهر25. يمكن تشريح الأقسام بالتناوب بينما يتم تجميد الدماغ14 متبوعا باستخراج الحمض النووي الريبي والبروتين ولكن هذه الطريقة تقتصر على مناطق الدماغ التي يمكن تحديدها من خلال معالم واضحة. تم إجراء إجمالي عمليات استخراج الحمض النووي الريبي بعد التشريح المجهري25 من مناطق الدماغ الرئيسية وكذلك باستخدام نهج الفحص المجهري غير الليزري لدراسات التعبير الجيني13. نركز هنا على تشريح دماغ الفئران الجديدة لفصل هياكل الدماغ المحددة التي كرست السيطرة على الوظائف الفسيولوجية والسلوكية. تشرح طريقتنا تشريح مناطق أكثر من التقارير المنشورة بالفعل ولكنها مكملة لطرق التشريح الأخرى المتاحة. يمكن أن يساعد هذا النهج في توفير تقييم شامل للأنسجة وارتباطها بالظروف المنهكة. توفر استراتيجية التشريح هذه خيارا قابلا للتطبيق لاستراتيجيات جمع العينات الحالية التي تفتح إمكانيات لاكتشافات جديدة.
باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، يتم تجميد أنسجة المخ في النيتروجين السائل قبل نقلها إلى -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. من المهم أن تبقى الأدوات والأنسجة باردة خلال الإجراء بأكمله للحفاظ على الأحماض النووية أو البروتينات. يتم تجانس هذه الأنسجة المجمدة لاحقا باستخدام إجراءات التشغيل القياسية في المختبر. بعض أنسجة المخ هذه صغيرة جدا ويجب توخي الحذر أثناء عملية التجانس والاستخراج لحماية الجزيئات المستهدفة من التدهور في درجات حرارة أعلى.
في هذه العملية ، من المهم تحديد معالم واضحة لتحديد مناطق الأنسجة المحددة. ويتحقق ذلك عن طريق الحفاظ على رطوبة الأنسجة بمحلول ملحي لمنعها من أن تصبح ناعمة بسرعة وتحتفظ بمتانتها لفترة من الوقت. قارنت دراساتنا السابقة تغيرات التعبير الجيني بين أنسجة الفئران المكشوفة الضابطة والمعتدية15 ولم تدرس أي تغييرات ناجمة عن المحلول الملحي المستخدم أثناء التشريح. في تجربتنا ، هذا مهم بشكل خاص أثناء الشق بدءا من ما تحت المهاد والتقليب 180 درجة لأنه يكشف ويجعل تظليل الفصل الإقليمي للمناطق الحوفية (AY ، HC ، ERC) واضحا وأكثر وضوحا. يقع الجهاز الحوفي في عمق الدماغ ويتضرر بسبب مجموعة متنوعة من المحفزات ، وبالتالي فهو مهم تشخيصيا وعلاجيا. هناك نظام حوفي يتكون من مناطق الدماغ ولكن لا يوجد اتفاق عالمي على هذه القائمة26. على الرغم من عدم دراستها ، نعتقد أن هناك تأثيرات ضئيلة أو معدومة لاستخدام المياه المالحة. وذلك لأن الإجراء بأكمله يستمر حوالي 20 دقيقة بعد الظروف الباردة خلال العملية بأكملها.
يتم تحديد المناطق داخل أنسجة المخ باستخدام المعالم المذكورة في أطالس الدماغ. باستخدام هذه التقنية ، يجب أن تكون المعالم واضحة ويجب أن يتم هذا الإجراء بالتتابع. يجب أن يتم التشريح بينما لا يزال الدماغ طازجا وقويا. (يجب أن يتم ذلك مع أول 15 إلى 20 دقيقة) - وإلا فإن المعالم لن تكون واضحة ولن تكون المناطق متميزة إذا بقي الدماغ لفترة أطول وأصبح أكثر ليونة.
كما هو موضح أعلاه ، داخل الدماغ توجد مناطق فرعية ، تحتوي على مناطق وظيفية متعددة تعمل بشكل مستقل أو بالتنسيق مع الشبكات الضامة الجوهرية. من المهم استرجاع هذه المناطق بدقة كبيرة من أجل دراسة أبعادها الواسعة. سيساعد ذلك على دمج هذه المفاهيم من خلال الجمع بين المناطق المتخصصة حيث يخدم كل منها عملية متميزة ذات إمكانات علاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونشكر السيدة سيشماليني سرينيفاسان والسيد ستيفن بتلر والسيدة باميلا سبيلمان على المساعدة التجريبية والسيدة دانا يوسف على تحرير المخطوطة. يتم الاعتراف بالدعم التمويلي من USAMRDC بامتنان. ساهمت مؤسسة جنيف في هذا العمل وتم دعمها بأموال من مديرية منطقة أبحاث الطب العسكري والتشغيلي الثالثة عبر مكتب أبحاث الجيش الأمريكي.
اخلاء المسؤوليه:
تمت مراجعة المواد من قبل معهد والتر ريد العسكري للبحوث. ولا يوجد اعتراض على عرضه و/أو نشره. الآراء أو التأكيدات الواردة هنا هي وجهات نظر خاصة للمؤلف ، ولا ينبغي تفسيرها على أنها رسمية ، أو على أنها تعكس وجهات نظر حقيقية لوزارة الجيش أو وزارة الدفاع. تم إجراء البحوث بموجب بروتوكول معتمد لاستخدام الحيوانات في منشأة معتمدة من AAALAC وفقا لقانون رعاية الحيوان والقوانين واللوائح الفيدرالية الأخرى المتعلقة بالحيوانات والتجارب التي تشمل الحيوانات وتلتزم بالمبادئ المنصوص عليها في دليل رعاية واستخدام المختبر ، منشور NRC ، طبعة 2011.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L.
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
- Spijker, S.
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E.
