Summary
هنا ، نصف مقايسة حيوية باستخدام 3- (4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl) -2,5- ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) لاختبار الأوكسيم الحلقية المركبة مسبقا.
Abstract
تم الإبلاغ مؤخرا عن الدورات الحلقية الحلقية في الأدبيات لتكون أدوية محتملة لعلاج السرطان. إن توليف أنظمة الحلقات المتعامدة الجديدة هذه يمثل تحديا. تم مؤخرا نشر منهجية فعالة لتجميع هذه المركبات وصفت تخليق المرحلة الصلبة في أربع خطوات بدلا من الخطوات الخمس المبلغ عنها سابقا. ميزة هذا التوليف الأقصر هي القضاء على استخدام الكواشف السامة. تم العثور على راتنج مايكل المتجدد منخفض التحميل (REM) القائم على الرابط ليكون حاسما في التوليف حيث منعت الإصدارات عالية التحميل إضافة الكواشف التي تحتوي على فينيل ضخم وسلاسل جانبية عطرية. تم استخدام مقايسة القياس اللوني 3- (4′,5′-ثنائي ميثيل ثيازول-2′-يل)-2,5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) لفحص السمية الخلوية لتركيزات الميكرومولار لهذه الجزيئات الحلقية الحلقية الجديدة في المختبر. MTT متاح بسهولة تجاريا وينتج نتائج سريعة وموثوقة نسبيا ، مما يجعل هذا الاختبار مثاليا لهذه الدورات الحلقية هذه. تم اختبار هياكل الحلقة المتعامدة وكذلك furfurylamine (مقدمة في طريقة التوليف تحتوي على شكل حلقة مماثل مكون من 5 أعضاء).
Introduction
من المعروف أن تثبيط الجزيئات الصغيرة لتفاعل E3 ubiquitin-ligase الماوس مزدوج الدقيقة 2 متماثل (MDM2) مع p53 لاستعادة الحث بوساطة p53 لموت الخلايا المبرمجللخلايا السرطانية 1،2،3. MDM2 هو منظم سلبي لمسار p53 وغالبا ما يتم التعبير عنه بشكل مفرط في الخلايا السرطانية4،5،6،7،8،9. كشفت الدراسات البلورية والكيميائية الحيوية الحديثة أن الجزيئات الصغيرة التي تحتوي على إطار حلزوني يمكن أن تمنع بشكل فعال تفاعلات MDM2-p5310. يعتبر الإطار الحلقية الحلقية (الشكل 1 ، مظلل باللون الأزرق) فكرة مميزة حيث أدى اشتقاق نظام الحلقة المتعامدة الصلب هذا إلى اكتشاف عقاقير علاجية جديدة. يشكل الوصول إلى هذه البنية المثيرة للاهتمام تحديا عند استخدام تقنيات التخليق العضوي التقليدية. على الرغم من أن التأثيرات العلاجية للجزيئات الحلقية الحلقية في الأنظمة البيولوجية قد تم التحقيق فيها ، إلا أن تخليق هذه الجزيئات لا يزال عملية مرهقة. غالبا ما تكون المنتجات الجانبية غير المرغوب فيها ، التي تستخدم ظروفا قاسية ، والمعادن الانتقالية الخطرة مشكلة.
أدى الاستخدام المحتمل للشكل الحلقية الحلقية في تطوير الأدوية إلى تطوير بروتوكول يستخدم تخليق الطور الصلب لإنشاء مكتبة من الجزيئات مع الشكل بالإضافة إلى مجموعات وظيفية أخرى قابلة للتبديل11,12. يمكن تحقيق فصل المنتجات والمواد المتفاعلة بين الخطوات ببساطة عن طريق استخدام رابط REM متصل بحبة راتنجية ووعاء ترشيح صلب الطور. هذا من شأنه أن يقلل من الخطوات وربما يزيد الغلة. يمكن أن ينتج هذا النهج الاصطناعي مجموعة كبيرة من الأدوية المرشحة المحتملة. ومع ذلك ، فإن فعالية هذه الجزيئات في النظام البيولوجي تتطلب مزيدا من التحقيق.
لتحديد السمية الخلوية لهذه المركبات الحلقية الحلقية ، تم استخدام اختبار MTT13,14. تقيس هذه الطريقة صلاحية الخلية ويمكن استخدامها لتحديد السمية الخلوية بشكل غير مباشر. تمت إضافة تركيزات مختلفة من المثبطات إلى الخلايا المستزرعة في صفيحة 96 بئرا ، وتم قياس نسبة الخلايا الحية عن طريق التحليل اللوني لمدى اختزال MTT الأصفر بواسطة نازعة هيدروجين الميتوكوندريا إلى مركب الفورمازان الأرجواني (الشكل 2). غالبا ما يتم الإبلاغ عن النشاط كقيمة IC 50 - التركيز الذي يتم عنده تثبيط نمو الخلايا بنسبة50٪ بالنسبة إلى عنصر تحكم غير معالج. تصف هذه الورقة بروتوكول مقايسة MTT والنتائج الأولية لهذه الجزيئات الحلقية الحلقية الجديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: العديد من المواد الكيميائية والكواشف البيولوجية المستخدمة في هذا البروتوكول سامة ومسرطنة. راجع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. استخدم التروس الواقية الشخصية المناسبة (نظارات السلامة المعتمدة من إدارة السلامة والصحة المهنية ، والقفازات المناسبة ، ومعاطف المختبر ، والسراويل كاملة الطول ، والأحذية المغلقة) قبل بدء التجربة. بالإضافة إلى ذلك ، اعتماد ممارسات السلامة المناسبة عند إجراء التوليف والتعامل مع المواد الكيميائية السامة والكواشف (غطاء الدخان).
1. تخليق الطور الصلب للدورات الحلقية غير المتجانسة 6 و 7
ملاحظة: استند التوليف إلى العملالمنشور سابقا 11,12. يكشف البروتوكول المحدث أنه لم تكن هناك حاجة إلى فتحة الحلقة المحفزة بفلوريد رباعي بوتيلامونيوم للدورة غير المتجانسة ثلاثية الحلقات ، وبالتالي فإن التخلص منها يقصر الإجراء الاصطناعي.
- قم بإجراء إضافة مايكل من فورفوريلامين إلى رابط حركة العين السريعة (المدة: 25 دقيقة إعداد + 24 ساعة وقت رد الفعل).
- أضف 1 جم (1 مكافئ [مكافئ]) من راتنج حركة العين السريعة ، و 20 مل (20 مكافئا) من ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) ، و 2.4 مل من فورفوريلامين إلى وعاء تفاعل الطور الصلب سعة 25 مل. حرك وعاء التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة بعد بدء التفاعل.
ملاحظة: تأكد من الخلط الشامل حتى لا يجلس الراتنج في قاع الوعاء. - اغسل الراتنج باستخدام DMF 1x بعد اكتمال التفاعل. ثم اغسل 4x بالتناوب بين ثنائي كلورو الميثان (DCM) والميثانول. جفف الراتنج جيدا في وعاء التفاعل بعد الغسيل.
- أضف 1 جم (1 مكافئ [مكافئ]) من راتنج حركة العين السريعة ، و 20 مل (20 مكافئا) من ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) ، و 2.4 مل من فورفوريلامين إلى وعاء تفاعل الطور الصلب سعة 25 مل. حرك وعاء التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة بعد بدء التفاعل.
- قم بإجراء إضافة مايكل جنبا إلى جنب / إضافة حلقية ثنائية القطب 1،3 (المدة: 25 دقيقة إعداد + وقت رد فعل 48 ساعة).
- أضف إلى الراتنج الجاف 1.48 مل (5 مكافئ) من ثلاثي إيثيل أمين (TEA) ، و 0.637 جم (2 مكافئ) من نيترو أوليفين ، و 10 مل من التولوين الجاف إلى وعاء التفاعل.
- ثم أضف 1.085 مل (4 مكافئ) من كلوريد ثلاثي ميثيل سيليل (TMSCl) إلى وعاء التفاعل في غطاء دخان جيد التهوية.
ملاحظة: نظرا لأن هذا التفاعل ينتج غاز حمض الهيدروكلوريك ، فلا تقم بتغطية وعاء التفاعل حتى يتم إطلاق الغاز تحت غطاء الدخان. - قم بتغطية وعاء التفاعل بإحكام ، وقم بتحريكه في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة.
ملاحظة: تأكد من الخلط الشامل للراتنج مع الكواشف. - استخدم 5 مل من الميثانول لإخماد التفاعل.
- قم بتصريف الوعاء لإزالة المحلول ، ثم اغسل 4x ، بالتناوب بين DCM والميثانول. جفف الراتنج جيدا في وعاء التفاعل بعد الغسيل.
- قم بإجراء N-alkylation للدورة غير المتجانسة المرتبطة بالراتنج لتشكيل الأمين الرباعي (المدة: 10 دقائق إعداد + وقت رد فعل 24 ساعة).
- إلى الراتنج الجاف في وعاء التفاعل ، أضف 5 مل من DMF و 10 مكافئ من هاليد الألكيل ، وحركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: تأكد من الخلط الشامل للكواشف مع الراتنج. - اغسل الراتنج باستخدام DMF 1x بعد اكتمال التفاعل. ثم استخدم DCM والميثانول بالتناوب لغسل 4x. جفف الراتنج في وعاء التفاعل بعد الغسيل.
- إلى الراتنج الجاف في وعاء التفاعل ، أضف 5 مل من DMF و 10 مكافئ من هاليد الألكيل ، وحركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
- قم بإجراء التخلص β من الأمين الرباعي للانشقاق من دعامة البوليمر (المدة: 15 دقيقة إعداد + وقت رد فعل 24 ساعة).
- إلى الراتنج الجاف في وعاء التفاعل ، أضف 3 مل من DCM و 1.49 مل (5 مكافئ) من TEA لشق الدورة غير المتجانسة من دعامة البوليمر.
- حرك خليط التفاعل لمدة 24 ساعة لضمان الخلط الشامل للراتنج مع المحلول. اغسل 4x ، بالتناوب بين DCM والميثانول. اجمع الشطف من جميع الغسلات ، وركز عن طريق التبخر الدوار.
- سحن مع الميثانول لتنقية أوكسيم الحلقة. جفف الراتنج جيدا في وعاء التفاعل بعد غسله لإعادة استخدامه في التجارب المستقبلية.
2. مقايسة السمية الخلوية باستخدام MTT 14
- تحضير 20 مل من محلول MTT 5 ملغ / مل باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ، 0.9٪ كلوريد الصوديوم في الماء) كمادة مخففة. قم بالترشيح والتخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف 1: 1 لمحلول MTT من الخطوة 2.1 في وسط زراعة الخلايا الخالية من المصل (DMEM).
- قم بإعداد 1 مل لكل من محاليل المخزون في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل من 100 مللي متر و 10 مللي متر و 1 مللي متر و 100 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 1 ميكرومتر و 0.1 ميكرومتر و 0.01 ميكرومتر من مركبات الاختبار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. تحضير 200 ميكرولتر لكل جرعة من محاليل العمل لمركبات الاختبار عن طريق تخفيف تركيزات المخزون 1: 1000 في وسط خال من المصل في أنابيب 1.5 مل.
- في غطاء زراعة الأنسجة ، قم بزرع خلايا COS-7 (خلايا الكلى للقرد الأخضر الأفريقي ، Cercopithecus aethiops الكلى) في وسط كامل [DMEM مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS)] على ألواح مسطحة القاع والمعالجة بزراعة الأنسجة 96 بئرا بتركيز 4 × 103 خلايا / 200 ميكرولتر لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. تم اختيار خلايا COS-7 لأن (1) هذه الخلايا شائعة الاستخدام لفحوصات السمية الخلوية و (2) كانت متوفرة بالفعل في المؤسسة.
- احتضان خلايا COS-7 لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
- قم بشفط المادة الطافية من الآبار باستخدام ماصة باستور زجاجية متصلة بمضخة تفريغ. جرعة الخلايا في ثلاث نسخ مع مركبات الاختبار باستخدام حلول العمل المعدة في الخطوة 2.2 (انظر الجدول 1). احتضان الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.4.
- نضح الطافية من الآبار. أضف 200 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2 لمدة 4 ساعات.
- استنشاق الطاف بلطف من الآبار دون إزعاج بلورات الفورمازان الأرجواني. أضف 200 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر لإذابة بلورات الفورمازان الأرجواني. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- قم بقياس الامتصاص عند 590 نانومتر14 أو 600 نانومتر لكل بئر باستخدام قارئ لوحة 96 بئر. استخدم الآبار التي لا تحتوي على خلايا كخلفية وقم بحساب متوسط قيمة الامتصاص. اطرح متوسط قيمة خلفية الامتصاص من قيمة الامتصاص لكل بئر معالج. تطبيع البيانات كنسبة مئوية من متوسط قيمة الجرعة الصفرية (متوسط قيم الجرعة الصفرية الثلاثة). بيانات المؤامرة على المحور ص: خطي (٪ صلاحية الخلية النسبية) ؛ المحور السيني: سجل (تركيز). ارسم كل سلسلة كمنحنى فردي (على سبيل المثال ، يجب أن تحتوي البيانات الثلاثية على 3 منحنيات)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تصنيع الأوكسيم الحلقية 6 و 7 باستخدام بروتوكول معدل (الشكل 1). إضافة مايكل فورفوريلامين إلى رابط REM 1b يمنح راتنج مرتبط بالبوليمر 2. تمت مراقبة تقدم التفاعل بواسطة التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (IR) عن طريق الكشف عن اختفاء استر α،β غير المشبع عند 1722 سم -1 (الشكل 3). تم تشكيل الراتنج 4 المرتبط بالحلقية الحلقية من 2 عبر وسيط عابر 3. أنتج التحلل المائي للميثانول ل 4 3- [(3E) - (2S ، 4R) -2-فينيل-3-هيدروكسي إيمينو 4-هيدروكسي ميثيل بيروليدين -1-يل] - حمض البروبيونيك ميثيل استر 7 ، بينما الألكلة متبوعة بالتخلص من β (3E) - (2S ، 4R) -4-هيدروكسي ميثيل -1-ميثيل -2-فينيل-3-بيروليدين أوكسيم 6. تم تحديد هوية الأوكسيم الحلقية الحلقية من خلال التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي 1H و 13C والنقاء بواسطة التحليل الطيفي الكتلي بناء على نتائجنا السابقة11.
مقايسة MTT هي مقايسة لونية معروفة لتحديد صلاحية الخلية12. كما هو موضح في الشكل 2 ، تقوم مختزلات الميتوكوندريا الموجودة في الخلايا الحية بتحويل رباعي الأزوليوم الأصفر ل MTT إلى مادة فورمازان أرجوانية صلبة غير قابلة للذوبان. باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، يتم قياس تكوين الفورمازان عن طريق قياس الامتصاص عند 600 نانومتر. تم استخدام سيسبلاتين ، المعروف بتحفيز موت الخلايا بتركيزات عالية ، كعنصر تحكم إيجابي (الشكل 4). كما هو متوقع ، كلما زاد تركيز سيسبلاتين ، انخفضت صلاحية الخلية. بعد ذلك ، تم استخدام مقايسة MTT لاختبار المركبات الحلقية الحلقية 6 و 7 وفورفوريلامين. تم استخدام فورفوريلامين لتحديد تأثير حلقة الفوران وحدها مقارنة بالإطار الحلقي. كما هو موضح في الشكل 5 ، أظهر فورفوريلامين وأوكسيم حلقي 6 سمية خلوية مماثلة. ومع ذلك ، كانت سمية المركب الحلقية 7 أكبر بشكل ملحوظ من سمية فورفوريلامين و 6. سيتم تصنيع مكتبة من الأوكسيم الحلقية الحلقية للتحقيق الكامل في السمية الخلوية بالإضافة إلى التأثيرات الأخرى المضادة للسرطان لهذه الدورات غير المتجانسة.
الشكل 1: بناء المركبات الحلقية الحلقية باستخدام تخليق المرحلة الصلبة المحدثة. الإطار اللولبي المتعامد مظلل باللون الأزرق. لاحظ أن الخطوة (ج) ليست ضرورية ، والتي تتجنب استخدام الكاشف السام TBAF. ظروف التفاعل هي كما يلي: (أ) فورفوريلامين ، DMF ، (ب) β-نيتروستيرين ، TMSCl ، TEA ، تولوين ، (ج) TBAF ، (د) هاليد الألكيل ، DMF ، و (ه) TEA ، DCM. الاختصارات: TBAF = فلوريد رباعي بوتيلامونيوم. DMF = ثنائي ميثيل فورماميد ؛ TMSCl = كلوريد ثلاثي ميثيل سيليل ؛ الشاي = ثلاثي إيثيل أمين. DCM = ثنائي كلورو ميثان ؛ ISOC = إضافة حلقية داخل الجزيئات سيليوكسي أوليفين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: آلية فحص MTT. يتم تقليل ملح التترازوليوم الأصفر بشكل واضح من MTT عن طريق اختزال الميتوكوندريا في خلايا COS-7 الحية لتشكيل فورمازان أرجواني غير قابل للذوبان. اختصار: MTT = 3- (4′,5′-ثنائي ميثيل ثيازول-2′-يل)-2,5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مراقبة تقدم كل خطوة من خطوات تفاعل الطور الصلب بواسطة التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء. يشير تردد التمدد عند 1717 سم -1 إلى وجود إستر غير مشبع ، ويصور 1733 سم -1 استرا مشبعا ، وتشير الإشارة حوالي 3300-3500 سم -1 إلى وجود مجموعة هيدروكسيل. يتم أيضا عرض ترددات التمدد القابلة للكشف للبوليسترين. الاختصارات: REM = تجديد مايكل. ISOC = إضافة حلقية داخل الجزيئات سيليوكسي أوليفين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تأثيرات سيسبلاتين على صلاحية خلية COS-7 في مقايسة MTT المعدلة. تراوحت تركيزات سيسبلاتين من 0 ميكرومتر إلى 60 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تأثيرات مركبات الاختبار على صلاحية خلية COS-7 في مقايسة MTT المعدلة. تراوحت التركيزات من 0 ميكرومتر إلى 100 ميكرومتر وتم رسمها على مقياس لوغاريتمي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول 1: تخطيط لوحة 96 بئر. كانت جميع صفوف بيانات الاختبار في ثلاث نسخ. تم استخدام الآبار التي تحتوي على خلايا COS-7 ووسط فقط كعناصر تحكم. للتأكد من أن DMSO لم يكن سبب السمية الخلوية في الخلايا التي تم جرعاتها بالسيسبلاتين ، تم استخدام الآبار التي تحتوي على DMSO فقط كضوابط للمذيبات. يتم تسليط الضوء على الآبار التي تحتوي على خلايا COS-7. الاختصارات: DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استند تخليق المركبات الحلقية الحلقية إلى الأبحاث السابقة التي أجراها هذا المختبر ، ولكن مع بعض التعديلات (الشكل 1)11,12. تمت مراقبة تقدم كل خطوة تفاعل بواسطة التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء. إضافة مايكل لرابط REM 1 مع فورفوريلامين الممنوح بالبوليمر 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). ومن التقرير السابق، أنتجت ISOC of 2 المركب الحلقية غير المتجانسة ثلاثية الحلقات 3، على النحو الذي أكده الكشف عن مجموعة TMS (IR 1214 cm-1). هذه خطوة حاسمة في التوليف حيث قدمت ISOC الانتقائية والانتقائية الفراغية اللازمة للمنتجات. لوحظ تردد تمدد مجموعة هيدروكسيل يبلغ 3500 سم -1 بدلا من تردد المجموعة الوظيفية TMS. قد يكون هذا لأن المركب ثلاثي الحلقات هو وسيط عابر يؤدي إلى النظام الحلقية الحلقية اللولبية.
تم العثور على أنواع مختلفة من راتنج حركة العين السريعة للحد من التوليف. منع البوليمر عالي التحميل (1.00 مليمول / جم) تخليق المركبات الحلقية الحلقية التي تحتوي على سلاسل جانبية ضخمة R2. بسبب أوجه التشابه في المجموعات الوظيفية في الراتنجات 4 و 5 ، كانت نتائج الأشعة تحت الحمراء غير حاسمة. لا يمكن تحديد نجاح هذه الخطوة إلا من خلال محاولة إعادة إنشاء رابط حركة العين السريعة (5 → 1). لم يحدث التجديد في الحالات التي تمت فيها إضافة مجموعة R2 ضخمة. يوصى باستخدام راتنجات منخفضة التحميل (0.5 مليمول / جم أو أقل) للتوليف الناجح. تتوافق طريقة التوليف هذه مع الإجراءات الموضحة في الأدبيات.
كاختبار أولي ، تم تطوير بروتوكول لفحص السمية الخلوية باستخدام MTT. على مدار العديد من التجارب ، تم اكتشاف خطوات وقيود حرجة. لكي يتم تطبيع النتائج في جميع الآبار ، يجب أن يتم زرع الخلايا بالتساوي عبر الآبار ، مما يستلزم قياس تركيز الخلية قبل البذر. تطلب الفحص لوحات ذات آبار مسطحة القاع ، حيث لا يمكن قراءة الامتصاص بدقة من الآبار ذات القاع المستدير. بالإضافة إلى ذلك ، كان لا بد من إزالة MTT الزائد الذي بقي بعد الحضانة لمنع التداخل في القراءات دون إزعاج الفورمازان غير القابل للذوبان.
يجب قراءة امتصاص الفورمازان المذاب عند 590 نانومتر. ومع ذلك ، استلزمت الأجهزة الحالية في المختبر أخذ قراءات عند 600 نانومتر بدلا من ذلك. وجد أن التخزين عند 0 درجة مئوية مهم للمواد الكيميائية المستخدمة في الفحص (سيسبلاتين ، جزيئات حلقية ، فورفوريلامين). تم استخدام DMSO - وهي مادة كيميائية ذات سمية خلوية معروفة - كمذيب لمركبات الاختبار واستخدمت لعمل تخفيفات للفحص. كان لا بد من تحضير كاشف MTT نفسه ، حيث تم تخزينه كمسحوق يحتاج إلى إذابة وتصفية ، حيث تتداخل الجسيمات غير القابلة للذوبان مع القراءات.
بشكل عام ، تهدف نتائج هذا الفحص إلى أن تكون أولية ، حيث تم اختبار عدد قليل فقط من الجزيئات. ومن المقرر إجراء اختبار شامل باستخدام بطارية من الجزيئات، وستصدر قريبا مخطوطة كاملة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون التوليف قابلا للتطبيق على الأمينات المشتقة من pyrrole-2-carbaldehyde. في هذه الحالة ، يمكن تصنيع بيروليدينات الحلقية الحلقية واختبارها بحثا عن التأثيرات السامة للخلايا على خطوط الخلايا السرطانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من مجلس أبحاث أعضاء هيئة التدريس إلى KSH (مكتب البحوث والمنح ، جامعة أزوسا باسيفيك - الولايات المتحدة الأمريكية). A.N.G. و J.F.M. حاصلان على زمالة الخبرة البحثية العلمية الجامعية (SURE). S.K.M. و B.M.R. حاصلان على منح زمالة أبحاث العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات (مركز البحوث في العلوم ، جامعة أزوسا باسيفيك - الولايات المتحدة الأمريكية). نحن ممتنون للدكتور ماثيو بيريزوك والدكتور فيليب كوكس للحصول على إرشادات حول المقايسات الحيوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R.
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S.
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).
