Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.
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Methodenartikel
Funktionalisierte spirozyklische Heterocyclensynthese und Zytotoxizitätstest
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Spirozyklische Heterocyclen wurden kürzlich in der Literatur als potenzielle Medikamente für die Krebstherapie beschrieben. Die Synthese dieser neuartigen orthogonalen Ringsysteme ist eine Herausforderung. Eine effiziente Methodik zur Synthese dieser Verbindungen wurde kürzlich veröffentlicht, die die Festphasensynthese in vier Schritten anstelle der zuvor berichteten fünf Schritte beschreibt. Der Vorteil dieser kürzeren Synthese ist der Wegfall der Verwendung toxischer Reagenzien. Es erwies sich heraus, dass REM-Linkerharz (Low Loading) Regenerating Michael (REM) entscheidend für die Synthese war, da hochladende Versionen die Zugabe von Reagenzien mit sperrigem Phenyl und aromatischen Seitenketten verhinderten. Der kolorimetrische 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay wurde verwendet, um die Zytotoxizität der mikromolaren Konzentrationen dieser neuartigen spirocyclischen Moleküle in vitro zu untersuchen. MTT ist kommerziell leicht erhältlich und liefert relativ schnelle, zuverlässige Ergebnisse, was diesen Assay ideal für diese spirocyclischen Heterocyclen macht. Orthogonale Ringstrukturen sowie Furfurylamin (eine Vorstufe der Synthesemethode, die ein ähnliches 5-gliedriges Ringmotiv enthält) wurden getestet.
Einleitung
Es ist bekannt, dass die kleinmolekulare Hemmung der Interaktion von E3-Ubiquitin-Ligase-Maus-Doppelminuten-2-Homolog (MDM2) mit p53 die p53-vermittelte Induktion der Tumorzellapoptose 1,2,3 wiederherstellt. MDM2 ist ein negativer Regulator des p53-Signalwegs und wird in Krebszellenoft überexprimiert 4,5,6,7,8,9. Neuere kristallographische und biochemische Studien haben gezeigt, d....
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Protokoll
HINWEIS: Mehrere Chemikalien und biologische Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Konsultieren Sie vor der Verwendung die relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Verwenden Sie vor Beginn des Experiments geeignete persönliche Schutzausrüstung (von der Occupational Safety and Health Administration zugelassene Schutzbrille, geeignete Handschuhe, Laborkittel, durchgehende Hosen und geschlossene Schuhe). Darüber hinaus sollten Sie bei der Synthese und dem Umgang mit toxischen Chemikalien und Reagenzien (Abzug) geeignete Sicherheitspraktiken anwenden.
1. Festphasensynthese spirocyclischer Heterozyk....
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Ergebnisse
Die spirozyklischen Oxime 6 und 7 wurden unter Verwendung eines modifizierten Protokolls synthetisiert (Abbildung 1). Michaels Zusatz von Furfurylamin zu einem REM-Linker 1b ergab polymergebundenes Harz 2. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels Infrarotspektroskopie (IR) überwacht, indem das Verschwinden des α,β-ungesättigten Esters bei 1722 cm-1 nachgewiesen wurde (Abbildung 3). Spirozyklisch gebundenes Harz 4 wurde aus 2 über ein transientes Zwische.......
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Diskussion
Die Synthese der spirocyclischen Verbindungen basierte auf früheren Forschungen dieses Labors, jedoch mit einigen Modifikationen (Abbildung 1)11,12. Der Fortschritt jedes Reaktionsschrittes wurde mittels IR-Spektroskopie überwacht. Michael Zusatz des REM-Linkers 1 mit Furfurylamin ergab polymergebundenes 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Aus dem vorh.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Faculty Research Council an K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA) finanziert. A.N.G. und J.F.M. sind Empfänger des Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. und B.M.R. sind Empfänger der STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Wir danken Dr. Matthew Berezuk und Dr. Philip Cox für die Beratung zu den Bioassays.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CELLS | |||
| COS-7-Zellen (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | Afrikanische grüne Affennierenzellen |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromoctan | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkylhalogenid |
| Allylbromid | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkylhalogenid |
| Benzylbromid | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkylhalogenid |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Kontrolle der Zytotoxizität |
| Dichlormethan (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Lösungsmittel |
| Dimethylformamid (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Lösungsmittel |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Lösungsmittel |
| DMEM, hoher Glukosegehalt, mit L-Glutamin | Genesee Scientific | 25-500 | Zellkulturmedien |
| FBS (Fötales Rinderserum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Zellkulturmedien |
| Furfurylamin | Acros Organics | 119800050 | Reagenz |
| Iodomethan | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkylhalogenid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Lösungsmittel |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagenz |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Zellkulturmedien |
| REM-Harz | Nova Biochem | 8551010005 | Polymerträger; 0,500 mmol/g Beladung |
| trans-β-Nitrostyrol | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-Olefin-Reagenz |
| Toluol | Sigma-Aldrich | 244511 | Lösungsmittel |
| Triethylamin (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagenz zur Beta-Eliminierung |
| Trimethylsilylchlorid (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagenz; VORSICHT - sehr flüchtig; stellt HCl-Gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL Festphasen-Reaktionsgefäß | her Chemglass | CG-1861-02 | Glaswaren mit Filter |
| 96 Well Plate Reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR-Spektrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Lösungsmittel: CDCl3 und CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Handgelenkschüttler | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
Referenzen
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S.
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Nachdrucke und Genehmigungen
