Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Summary

Wir stellen ein Protokoll für die Entwicklung und Verwendung eines oxidativen Stressmodells vor, indemwir retinale Pigmentepithelzellen mit H_2O2behandeln und Zellmorphologie, Lebensfähigkeit, Dichte, Glutathion und UCP-2-Spiegel analysieren. Es ist ein nützliches Modell, um die antioxidative Wirkung von Proteinen zu untersuchen, die von Transposon-transfizierten Zellen sezerniert werden, um neuroretinale Degeneration zu behandeln.

Abstract

Oxidativer Stress spielt eine entscheidende Rolle bei mehreren degenerativen Erkrankungen, einschließlich der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer Pathologie, von der weltweit etwa 30 Millionen Patienten betroffen sind. Es führt zu einer Abnahme der retinalen Pigmentepithel (RPE) -synthetisierten neuroprotektiven Faktoren, z. B. Pigmentepithel-abgeleiteter Faktor (PEDF) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), gefolgt vom Verlust von RPE-Zellen und schließlich dem Tod von Photorezeptoren und retinalen Ganglienzellen (RGC). Wir stellen die Hypothese auf, dass die Rekonstitution der neuroprotektiven und neurogenen netztinalen Umgebung durch die subretinale Transplantation von transfizierten RPE-Zellen, die PEDF und GM-CSF überexprimieren, das Potenzial hat, die Degeneration der Netzhaut zu verhindern, indem sie die Auswirkungen von oxidativem Stress mildert, Entzündungen hemmt und das Überleben der Zellen unterstützt. Mit dem Sleeping Beauty Transposon-System (SB100X) wurden menschliche RPE-Zellen mit den PEDF- und GM-CSF-Genen transfiziert und zeigten eine stabile Genintegration, langfristige Genexpression und Proteinsekretion mittels qPCR, Western Blot, ELISA und Immunfluoreszenz. Um die Funktionalität und Die Wirksamkeit der von den transfizierten RPE-Zellen sezernierten PEDF und GM-CSF zu bestätigen, haben wir einen In-vitro-Assay entwickelt, um die Reduktion von_{H2O2-induziertem}oxidativem Stress auf RPE-Zellen in Kultur zu quantifizieren. Der Zellschutz wurde durch die Analyse der Zellmorphologie, der Dichte, des intrazellulären Glutathionspiegels, der UCP2-Genexpression und der Zelllebensfähigkeit bewertet. Sowohl transfizierte RPE-Zellen, die PEDF und/oder GM-CSF überexprimieren, als auch Zellen, die nicht transfiziert, aber mit PEDF und/oder GM-CSF (kommerziell erhältlich oder aus transfizierten Zellen gereinigt) vorbehandelt wurden, zeigten im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollen einen signifikanten antioxidativen Zellschutz. Das vorliegende_H2O2-Modellist ein einfacher und effektiver Ansatz zur Bewertung der antioxidativen Wirkung von Faktoren, die zur Behandlung von AMD oder ähnlichen neurodegenerativen Erkrankungen wirksam sein können.

Introduction

Das hier beschriebene Modell bietet einen nützlichen Ansatz, um die Wirksamkeit biopharmazeutischer Wirkstoffe zur Reduzierung von oxidativem Stress in Zellen zu bewerten. Wir haben das Modell verwendet, um die schützenden Wirkungen von PEDF und GM-CSF auf den_{H2O2-vermittelten}oxidativen Stress auf retinale Pigmentepithelzellen, die hohen Konzentrationen von_O2und sichtbarem Licht ausgesetzt sind, und die Phagozytose von Photorezeptor-Außensegmentmembranen zu untersuchen, wodurch signifikante Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt werden^{1. (2)}Die Mitgliedstaaten sin....

Protocol

Verfahren zur Entnahme und Verwendung menschlicher Augen wurden von der kantonalen Ethikkommission für Forschung (Nr. 2016-01726) genehmigt.

1. Zellisolierung und Kulturbedingungen

1. Humane ARPE-19 Zelllinie
   1. Kultur 5 x 10⁵ ARPE-19-Zellen, eine humane RPE-Zelllinie, in Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/Ham's F-12), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 80 U/ml Penicillin, 80 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B (komplettes Medium) bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 %_CO2 und 95 % Luft in einem T75-Kolben (für andere Zelldichten siehe Tabelle 1....

Results

Induktion von oxidativem Stress in menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen
ARPE-19 und primäre hRPE-Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von_H2O2für 24 h behandelt und der intrazelluläre Spiegel des Antioxidans Glutathion quantifiziert (Abbildung 2A,B). H2O2 bei 50 μM und 100 μM hatte keinen Einfluss auf die Glutathionproduktion, während bei 350 μM eine signifikante Abnahm.......

Discussion

Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen Ansatz zur Analyse der antioxidativen und schützenden Funktion von PEDF und GM-CSF, die von transfizierten Zellen produziert werden, die auf Zellen angewendet werden können, die mit jedem vermeintlich vorteilhaften Gen transfiziert sind. Bei gentherapeutischen Strategien, die das Ziel haben, Proteine durch Transplantation genetisch veränderter Zellen an Gewebe abzugeben, ist es wichtig, Informationen über das Niveau der Proteinexpression, die Langlebigkeit der Expression und d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well-Platten	Corning	353047
6-Well-Platten	Greiner	7657160
96-Well-Kulturplatte weiß mit klarem flachem Boden	Costar	3610	Ermöglicht die Überprüfung der Zellen vor der Messung der Lumineszenz (GSH-Glo Assay)
96-Well-Platten	Corning
Acrylamid 40%	Biorad	161-0144
Amphotericin B	AMIMED	4-05F00-H
Antikörper gegen GMCSF	ThermoFisher Scientific	PA5-24184
Antikörper gegen Maus IgG/IgA/IgM	Agilent	P0260
Antikörper anti-PEDF	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-390172
Antikörper gegen Penta	Qiagen	34660
Antikörper Anti-Phospho-Akt	Cell Signaling Technology	9271
Antikörper Anti-Kaninchen IgG H& L-HRP	Abcam	ab6721
Antikörper Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594	ThermoFisher Wissenschaftlich	A11034
Antikörper Ziege Anti-Maus Alexa 488	ThermoFisher Scientific	A-11029
ARPE-19 Zelllinie	ATCC	CRL-2302
BSA	Sigma-Aldrich	A9418-500G
Objektträger aus Kammerkulturglas	Corning	354118
CytoTox-Glo Zytotoxizitätsassay	Promega	G9291
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
DMEM/Ham's F12	Sigma-Aldrich	D8062
Duo Set ELISA-Kit	R& D Systems	DY215-05
EDTA	ThermoFisher Scientific	78440
ELISAquant Kit	BioProducts MD	PED613-10-Human
Eyes (human)	Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS	Brunschwig	P40-37500
Fluormount Wässriges Eindeckmedium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML
FLUOstar Omega Plattenleser	BMG Labtech
GraphPad Prism Software (Version 8.0)	GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathion Assay	Promega	V6912
Wasserstoffperoxid (H2O2)	Merck	107209
ImageJ Software (Bildverarbeitungsprogramm)	W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997– 2014
Imidazol	Axonlab	A1378.0010
Leica DMI4000B Mikroskop	Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II	Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 Software	Roche Molecular Systems
NaCl	Sigma-Aldrich	71376-1000
NaH2PO4	Axonlab	3468.1000
Neon Transfektionssystem	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Neon Transfection System 10 & micro; L Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neubauer Kammer	Marienfeld-superior	640010
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30410
Nitrocellulose	VWR	732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System	Aplegen Life Science
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
PerfeCTa SYBR Grün FastMix	Quantabio	95072-012
PFA	Sigma-Aldrich	158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23227
Grundierungen	Invitrogen		Siehe Tabelle 1 in Ergänzende Materialien
pSB100X (250 ng/µ L)			M&aakut; té S et al., 2009. Bereitgestellt von Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His Plasmid-DNA (250 ng/µ L)			Konstruiert unter Verwendung des vorhandenen pT2-CMV-PEDF-EGFP-Plasmids, das in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796 berichtet wurde.
pT2-CMV-PEDF-His-Plasmid-DNA (250 ng/&mikro; L)			Konstruiert unter Verwendung des vorhandenen pT2-CMV-PEDF-EGFP-Plasmids, das in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796 berichtet wurde.
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51304
rekombinant hGM-CSF	Peprotech	100-11
rekombinant hPEDF	BioProductsMD	004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System	Promega	Z6011
RIPA Puffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase-freies DNase Set	QIAGEN	79254
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74204
SDS	Applichem	A2572
Semi-Dry Transfer System für WB	Bio-Rad
SuperMix qScript	Quantabio	95048-025
Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)	ThermoFisher	Scientific 15504020
Triton X-100	AppliChem	A4975
Trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
Tween	AppliChem	A1390
Harnstoff	ThermoFisher Scientific	29700
WesternBright ECL HRP Substrat	Advansta	K-12045-D50
Whatman Nitrocellulose Membran	Chemie Brunschwig	MNSC04530301