Summary
Veel knaagdiermodellen van endometriose worden beperkt door technische complexiteit, reproduceerbaarheid en/of behoefte aan immuungecompromitteerde dieren of speciale reportermuizen. We presenteren een vereenvoudigd systeem van laesie-inductie met behulp van elke experimentele muis met een onafhankelijk verifieerbaar, objectief scoresysteem en zonder vereiste voor ovariëctomie of overlevingsoperaties.
Abstract
Endometriose is een belangrijke oorzaak van bekkenpijn en onvruchtbaarheid. Het wordt gedefinieerd door de aanwezigheid van endometriumweefsel op extra-uteriene locaties. De ontwikkeling van nieuwe therapieën en diagnostische instrumenten voor endometriose is beperkt, deels als gevolg van uitdagingen bij het bestuderen van de ziekte. Buiten primaten menstrueren weinig zoogdieren en geen enkele ontwikkelt spontane endometriose. Knaagdiermodellen zijn populair, maar vereisen kunstmatige inductie van endometriose, waarbij velen immunocompromitterende muizen of chirurgisch geïnduceerde ziekte gebruiken. De laatste tijd is er meer aandacht voor modellen met intraperitoneale injectie. We presenteren een murien model van endometriose dat verschillende kenmerken van bestaande endometriosemodellen integreert in een nieuw, vereenvoudigd systeem dat afhankelijk is van microscopische kwantificering in plaats van subjectieve gradatie. In dit model voeren we hormonale stimulatie van donormuizen, intraperitoneale injectie, systematisch buikonderzoek en weefseloogst uit, en histologische kwantificering die op elk moment na obductie kan worden uitgevoerd en geverifieerd. Dit model vereist minimale middelen en training; vereist geen deskundigheid van laboranten bij muriene overlevingschirurgie of bij de identificatie van grove endometriotische laesies; kan worden gebruikt bij immuungecompromitteerde, immunocompetente en/of gemuteerde muizen; en creëert betrouwbaar endometriotische laesies die histologisch consistent zijn met menselijke endometriotische ziekte.
Introduction
Endometriose is een raadselachtige ziekte van het vrouwelijke voortplantingskanaal met aanzienlijke financiële en gezondheidslasten voor vrouwen1,2. De etiologie van endometriose is niet volledig begrepen, en er zijn meerdere verklaringen voorgesteld, waaronder coelomische metaplasie, embryonale Mülleriaanse rust, rekrutering van beenmerg afgeleide voorlopercellen en retrograde menstruatie3. Hoewel meerdere aspecten van deze voorgestelde mechanismen betrokken kunnen zijn, en geen enkele verklaring alle vormen van de ziekte kan verklaren, is het leidende model van endometriose pathogenese retrograde menstruatie. Retrograde menstruatie is de passage van menstruatie-effluent door de eileiders en in de buikholte; geschat wordt dat 90% van de menstruerende vrouwen regelmatig retrograde menstruatie ondergaat4,5. Gezien dit alledaagse fenomeen van retrograde menstruatie, waarom endometriose zich alleen ontwikkelt bij een subset van vrouwen is onduidelijk5. Om de etiologie van deze ziekte beter te begrijpen, zijn directe menselijke studies niet haalbaar en zijn dierstudies gerechtvaardigd.
Endometriose is een uitdaging om zowel te behandelen als te bestuderen. Prevalentie van de ziekte is niet bekend, maar geschat op 10%1. Hoewel sommige geavanceerde soorten endometriose nauwkeurig kunnen worden geïdentificeerd door middel van niet-invasieve beeldvorming, wordt een definitieve diagnose alleen bereikt door histopathologische analyse van chirurgisch verkregen biopsiemonsters; laesies die visueel ziek lijken te zijn, kunnen in feite fibrose of littekens van andere oorzaken zijn6. Ernst en omvang van de ziekte correleren niet met symptomatologie7.
Endometrioselaesies bestaan uit heterogene celtypen en populaties die op complexe manieren interageren binnen het micromilieu, waardoor het nut van cellulaire modellen8,9wordtbeperkt . In vivo modellen bestaan, maar deze hebben inherente uitdagingen en beperkingen10,11,12. Primatenmodellen zijn ideaal, maar zijn vaak niet haalbaar13,14,15. Weinig niet-primatenzoogdieren menstrueren en ontwikkelen endometriose spontaan16. Knaagdiermodellen van endometriose bestaan, maar hebben elk beperkingen17. Veel van deze modellen vereisen overlevingschirurgie om endometriumweefsel in de wand of darm van de donorontvanger te hechten of te implanteren, wat technische complexiteit toevoegt, anesthesie nodig heeft en immuunfactoren van de operatie zelf verbijstert18,19,20. Bovendien vereisen veel modellen ovariëctomie en oestrogeensuppletie; terwijl het verhogen van laesieopbrengst, voegt dit tijd, kosten, en extra overlevingschirurgie toe. Intraperitoneale (IP) injectiemodellen vereisen geen anesthesie of overlevingsoperatie, en deze modellen simuleren logischerwijs retrograde menstruatie beter dan het hechten van modellen21,22,23. De meeste IP-modellen zijn echter onderhevig aan meer variabiliteit in de locatie van laesies als gevolg van de willekeurige dispersie van endometriumfragmenten na injectie en dus aan meer bias in laesie-identificatie en -meting.
Hier presenteren we een murien model van endometriose dat verschillende kenmerken van bestaande endometriosemodellen integreert in een nieuw, vereenvoudigd en efficiënt systeem dat afhankelijk is van microscopische kwantificering in plaats van subjectieve sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het gebruik van dieren in deze studie is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Cleveland Clinic Lerner Research Institute. Alle openbaar beschikbare normen voor dierverzorging en -gebruik werden uitgevoerd volgens richtlijnen van de National Institutes of Health. Deze procedure maakt gebruik van aseptische technieken. De Petrischaal is steriel. De gebruikte PBS/zoutoplossing is steriel. De chirurgische instrumenten voor obductie en weefseldissectie worden gesteriliseerd via autoclaaf. We gebruiken 70% EtOH op de instrumenten tussen diergevallen (indien meer dan één per sessie) om besmetting te verminderen.
1. Bereiding van donor- en ontvangende muizen (zie figuur 1)
- Zorg ervoor dat er een passende goedkeuring is om met proefdieren te werken.
- Bepaal de belasting van de muis. In deze experimenten werden wildtype en mutante muizen met een C57BL/6J-achtergrond gebruikt, maar onderzoekers die vergelijkbare modellen gebruiken, rapporteren succes met andere muizenstammen zoals BALB/c-muizen10. Daarnaast kunnen donor- en/of ontvangermuizen gebruik maken van verslaggeversystemen, zoals GFP- of RFP-muizen (zie figuur 2 en figuur 3).
- Voor de timing van de endometriumweefseltransplantatie, zorg ervoor dat de donormuizen tussen de 22-24 dagen oud zijn op het moment van gonadotropine-injectie. Dit zorgt ervoor dat ze reproductief naïef zijn, bijvoorbeeld nog niet begonnen met estrous fietsen.
- Zorg ervoor dat de ontvangende muizen reproductief intact zijn (geen eerdere ovariëctomie) tussen de leeftijd van 2 en 4 maanden. Hoewel dit niet nodig is, wordt aanbevolen om met urine doordrenkt beddengoed uit een mannelijke muizenkooi periodiek in de kooi van de ontvanger te plaatsen om het voortdurende estrous fietsen te vergemakkelijken en opnieuw om 72 uur voorafgaand aan endometriumweefseltransplantatie.
OPMERKING: Dit garandeert geen synchronisatie van de estrous cyclus van de ontvangers, omdat de plaatsing urine-doordrenkt beddengoed is sterk afhankelijk van de hoeveelheid mannelijke beddengoed gebruikt en heeft variabele resultaten. Als synchronisatie van de estrous cyclus gewenst is, zullen drie opeenvolgende subcutane injecties van 100 ng/100 μL estradiol alle dieren in de estrous fase brengen. Hoewel we geen verschil in laesie-inductie vonden op basis van de fase van estrous cyclus, hebben andere groepen de cyclusfase belangrijk gevonden10. - Subcutaan injecteren Zwangere Mare Serum Gonadotropin (PMSG, 2 IE verdund tot 200 μL) in donormuizen subcutaan met behulp van een fijne naald (25-27 Gaanbevolen). Geef PMSG niet aan ontvangende muizen, omdat het de ovulatie en de daaropvolgende hoge progesteronomgeving zal activeren, die minder ontvankelijk is voor endometriosevorming.
OPMERKING: Eerdere muismodellen hebben PMSG of oestrogeen gebruikt om endometriumproliferatie bij de donormuizen te stimuleren voorafgaand aan de endometriumoogst23. PMSG wordt aanbevolen om de volgende redenen: De halfwaardetijd van PMSG is 40 uur, terwijl de halfwaardetijd van 17-bèta-estradiol slechts 2 uur is. Het gebruik van een enkele subcutane injectie van PMSG bij de donoren 40 uur voorafgaand aan de aanschaf van endometriumweefsel biedt een aanhoudende duur van blootstelling aan gonadotropinestimulatie, die werkt om endogene oestrogeen te stimuleren. Veel preparaten van exogene oestrogeen vereisen meerdere injecties om het endometrium adequaat te primen. - Na PMSG-injectie, plan necropsie, aankoop en transplantatie in de ontvanger tussen 38-42 uur. Tijd de endometriumweefseloogst na gonadotropineinjectie om inzameling van weefsel vóór ovulatie te verzekeren, die bij 42 h na injectie plaatsvindt. Ovulatie produceert een hoge progesteron (P4) omgeving, die laesie vestiging zou verminderen.
2. Aanschaf van donormuis endometriumweefsel
- Na euthanasie van donormuis (met behulp van CO2-kamer gevolgd door cervicale dislocatie), besproei de buik met 70% ethanoloplossing; dit dient om verontreiniging van het verkregen weefsel van huidflora en van losgeraakte haren te verminderen. Maak met een ontleedschaar een ondiepe dwarssnip in het midden door de huid en het onderhuidse weefsel. Pak vervolgens elke kant van de huidincisie vast, gebruik stompe tractie om de buik te openen.
- Identificeer de baarmoeder. Voordat u de baarmoeder verwijdert, trimt u het aangrenzende bindweefsel weg. Transect elke baarmoederhoorn net onder hun respectievelijke eileider en transect vervolgens de baarmoederhals om de hele baarmoeder en bloc te verwijderen.
- Inspecteer na verwijdering uit de buikholte de baarmoeder zorgvuldig en verwijder eventueel extra perifeer vet of bindweefsel. Plaats de baarmoeder in een druppel koude PBS op een petrischaaltje. Bepaal en documenteer de gecombineerde massa van de hele baarmoeder.
- Transect elke hoorn van de baarmoeder fundus, waardoor de transsectie zo dicht mogelijk bij de fundus om de lengte van elke hoorn te maximaliseren. Plaats met behulp van een ontleedmicroscoop een mes van de ontleedschaar in het lumen van de eerste hoorn en snijd vervolgens langs de hoofdas van de buis. Open de buis voorzichtig, houd er rekening mee welke kant de serosa is en welke kant het epitheel is.
- Doe 500 cc zoutoplossing of PBS op een nieuwe petrischaal; de vloeistof blijft bij elkaar vanwege oppervlaktespanning.
- Voer vervolgens fragmentatie van de baarmoeder op een uniforme manier uit. Het is beter om minder grotere laesies te hebben dan veel kleinere laesies. Begin met het scheiden van het epitheel van het myometrium door de endometriumlaag vast te pakken en af te pellen.
- Als alternatief fragmenteert u eenvoudig het weefsel zonder het myometrium af te scheiden (zolang de epitheelzijde volledig is blootgesteld), maar het behouden van het myometrium vermindert de fysiologische relevantie van dit model voor menselijke ziekten. Zorg ervoor dat fragmenten zo groot mogelijk zijn, maar klein genoeg om door een naald van 18 G te gaan; (1 mm x 1 mm wordt aanbevolen).
- Verzamel 10-12 van deze fragmenten van 1 mm x 1 mm van de eerste hoorn (wat ongeveer overeenkomt met 40 mg weefsel in de C57BL/6J muizen). Plaats verzamelde fragmenten in de vloeistofverzameling.
- Voer dezelfde stappen uit voor de andere baarmoederhoorn voor in totaal ongeveer 24 fragmenten per muis. Documenteer het totale aantal fragmenten.
3. Peritoneale injectie van weefselfragmenten in de ontvangende muis
- Aspireer de zwevende fragmenten van 1 mm x 1 mm met behulp van het stompe uiteinde van een spuit van 1 cc; het totale volume moet 1 ml zijn.
- Bevestig een 18 G naald aan de volle spuit en laad de vloeistof in de naald. Overweeg een nepinjectie terug in de Petrischaal om ervoor te zorgen dat al het weefsel door de naald gaat.
- Neem de ontvanger muis. Voor of na IP-injectie, verkrijg een vaginaal uitstrijkje van de ontvangende muis voor estrous cyclusdocumentatie (10 μL zoutoplossing met behulp van de bolspuit bij de vaginale opening en geplateerd op de glazen dia met de afdeklip).
- Voer intraperitoneale injectie van de fragmenten uit met de spuit onder een hoek van 45 graden, waarbij u ervoor zorgt dat u niet subcutaan injecteert.
- Als er na injectie fragmenten achterblijven, trekt u nog eens 200 μL van de vloeistof in de spuit voor injectie om ervoor te zorgen dat alle fragmenten intraperitoneaal met succes worden geïnjecteerd.
- Eenmaal verzekerd van geen bloedingen of complicaties, plaats de ontvangende muizen terug in hun kooien en voer een normaal dieet.
4. Oogst van endometriotische laesies
- Euthanaseer ontvangende muizen ongeveer 21 dagen na fragmentinjectie na de transplantatie.
OPMERKING: Uit ervaring en uit overleg met medewerkers die vergelijkbare modellen gebruiken, treden de maximale laesiegrootte en het maximale aantal op na ongeveer 3 weken na de transplantatie; na 3 weken beginnen laesies in omvang terug te gaan. De IACUC-goedgekeurde methode van euthanasie wordt gebruikt. - Na euthanasie en cervicale dislocatie, besproei de buik van het dier met 70% ethanol en tent de huid om oppervlakkig te snijden met een ontledende schaar. Insnijd de huid en de onderhuidse ruimte met een schaar om de buik botweg te openen.
- Voordat verdere dissectie wordt uitgevoerd, wordt een volledig onderzoek uitgevoerd naar grove laesies, waarbij de grootte wordt gemeten door remklauwen en gedocumenteerd over hun anatomische regio (zie hieronder).
- Voer een volledige verzameling uit van drie verschillende anatomische regio's en bloc (ongeacht of laesies al dan niet grof kunnen worden gewaardeerd). Als laesies in andere regio's (bijv. darmen) worden waargenomen, moeten deze worden genegeerd en niet worden verzameld, tenzij de laesie een van de drie onderstaande gebieden doorkruist.
- A = buikwand/buikvlies (kan in een cassette worden afgevlakt of opgerold, zolang dit consistent is tussen de monsters).
- B = alvleesklier en mesenterisch vet.
- C = para-uterien bindweefsel en vet (wit glinsterend weefsel dat de baarmoeder omringt, maar geen andere organen dan de blaas omvat; zorg ervoor dat u de blaas niet verwart met een laesie).
- Plaats elk ontleed gebied in een cassette, op de juiste manier gelabeld, en plaats het in formaline en verwerk het volgens het labprotocol voor histologische doorsneden.
- Sectie formalineblokken in twee dia's (D1 en D2) per weefselgebied op twee uniforme diepten.
5. Scoren van endometriotische laesies
- Scan (bij 40x vergroting) en archiveer dia's.
- Gebruik digitale dialeessoftware, definieer de langste afstand (X) tussen randen van een endometriotische laesie - of de rand nu uit klieren of stroma bestaat - en markeer deze. Een continue laesie wordt gedefinieerd door klieren omgeven door stroma; de lijn doorkruist niet noodzakelijkerwijs alleen endometriotisch weefsel (zoals in het geval van het bepalen van eindpunten op een onregelmatig gevormde of golvende focus van endometriose), maar de twee eindpunten moeten worden verbonden door continu stroma en/of klieren (zie figuur 4).
- Maak een tweede regel (Y) 90 graden over de eerste regel, waarbij de lengte van de tweede regel wordt bepaald volgens de bovenstaande regels.
- Als er meerdere niet-aaneengesloten laesies worden aangetroffen, geef dan elk hun eigen X- en Y-metingen.
- Bereken de eindscore voor elke dia als de som van de gebieden (X*Y) van elke laesie.
- Neem de grootste van de scores uit de twee dia's (D1 vs D2) als eindscore voor die regio (A, B, C).
- Totaal de scores van elke regio om de uiteindelijke microscopische score voor dat dier te geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor een eerste proof of concept experiment werd donorendometrium van RFP muizen geïnjecteerd in wildtype ontvanger muizen. H&E-kleuring onthulde histopathologische bevestiging van de klassieke architectuur van endometrioselaesie (figuur 3A). Fluorescerende microscopie bevestigde dat de waargenomen laesie in kwestie afkomstig was van de donor (figuur 3B).
Het tweede experiment werd uitgevoerd met 10 wildtype C57BL/6J donoren en 10 ontvangers. Nog eens 5 ontvangers kregen schijnbehandeling (geïnjecteerd met PBS en geen endometriumfragmenten) en kregen een willekeurig identificatienummer toegewezen; recensenten werden verblind voorafgaand aan obductie en histopathologische beoordeling.
Alle ontvangers kregen donor endometriumweefsel binnen 42 uur na de behandeling met PSMG-donor. Er was geen correlatie tussen dit tijdsinterval en het uiteindelijke baarmoedergewicht of laesiegrootte. Op het moment van donoraankoop was het gemiddelde totale baarmoedergewicht 54 ± 9,5 mg. Gemiddeld fragmentaantal was 22,4 ± 5,2, wat resulteerde in een gemiddeld fragmentgewicht van 2,5 ± 0,5 mg. Eindpuntchirurgie vond plaats op dag 20 of dag 22 voor alle ontvangers.
Met een gemiddeld aantal laesies van 1,5 en een gemiddelde bruto totale laesiediameter van 3,7 mm zijn deze eindpunten vergelijkbaar met andere studies met muismodellen met een vergelijkbaar gewicht van geïnjecteerde endometriumfragmenten (Figuur 2)10. De prevalentie van laesies voor alle muizen was 80%. De muizen zonder laesies hadden significant grotere endometriumfractie in vergelijking met muizen met laesies (respectievelijk 30,5 totale fragmenten versus 20,3; gemiddelde totale fragmenten voor alle muizen waren 22,4) wat resulteerde in een ondergemiddelde fragmentgrootte op het moment van injectie (1,9 mg versus 2,6 mg). Zoals verwacht hadden schijncontroles (geïnjecteerd met zoutoplossing en niet met endometriumfragmenten) geen grove of microscopische ziekte. In een daaropvolgende studie met behulp van een uitgebreid aantal muizen werd de estrous fase van de ontvangende muis niet geassocieerd met laesieaantal of microscopische ziektescore.
Het bruto laesieaantal lijkt een slechte surrogaatmarker te zijn voor de totale laesielast, omdat er onenigheid was tussen de macroscopische en de microscopische ziekte die in de weefsels aanwezig was. In 60% (n = 6) van de gevallen was er overeenstemming tussen de macroscopische en microscopische score (overeenkomst gedefinieerd als zowel het aantonen van aan- als afwezigheid en het verschil in totale grootte was binnen 3 mm). In 40% (n = 4) van de gevallen was er echter onenigheid, waarbij 10% (n = 1) van de tijd macroscopische ziekte afwezig was, maar microscopische ziekte aanwezig was door histologie, 10% (n = 1) macroscopische ziekte werd gezien ondanks geen afwezigheid van endometriose op bevestigende histologie (figuur 5), en de resterende 20% (n = 2) was er overeenstemming in aanwezigheid, maar niet in omvang. Macroscopisch onderzoek naar laesies alleen is dus niet voldoende voor de kwantificering van de ziektelast van endometriose.
Figuur 1: Overzicht van het model. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Onderzochte gebieden voor laesiekwantificering. Hoewel de darm en andere intraperitoneale locaties laesies kunnen herbergen, is het uitdagender om deze grof te onderscheiden en een uitputtend onderzoek van de buik zou meer tijdsintensief zijn met afnemende rendementen. Daarom wordt een consistente, systematische benadering van het oogsten van het volledige weefsel (ongeacht of er sprake is van een grove ziekte) uitgevoerd in de drie meest voorkomende gebieden van endometriosevorming: de buikwand / peritoneum (A), de alvleesklier en mesenterisch vet (B) en het para-uteriene vet (C). Gelabeld zijn representatieve beelden van microscopische bevindingen van laesies uit elk van de drie regio's. 40x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Inductie van endometriose met behulp van donormuizen endometrium dat rode fluorescerende eiwitten uitdrukt. (A) H&E-sectie van de laesie. (B) Fluorescerende microscopie met DAPI-kleuring. 40x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve afbeeldingen van de software die wordt gebruikt om de afmetingen van de laesieafmetingen te meten en de laesielast te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Representatieve monsters van grove "laesies" die geen endometriose zijn door histopathologisch onderzoek. 40x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze studie toont aan dat endometriose betrouwbaar kan worden geïnduceerd bij muizen zonder gebruik van ovariëctomie en/of overlevingsoperaties, en dat ectopische endometriumlaesies kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van een gestandaardiseerd onderzoek van de buik en histologische analyse.
Veel muriene studies van endometriose maken gebruik van chirurgisch geïnduceerde endometriose waarbij donorendometrium op zijn plaats wordt gehecht aan de darm, buikwand of andere intraperitoneale locatie12,20. Dit heeft als voordeel dat de grootte en locatie van het getransplanteerde weefsel worden gestandaardiseerd. Naast extra logistieke uitdagingen van overlevingschirurgie, kan dit echter verwarrende variabelen van de operatie zelf introduceren, aangezien endometriose een ontstekingsziekte is en dat endometriose zich in een klinische omgeving meestal ontwikkelt voorafgaand aan een chirurgische ingreep. Intraperitoneale injectie, aan de andere kant, modelleert nauwkeuriger de retrograde menstruatie waarvan wordt gedacht dat deze de meerderheid van endometrioselaesies veroorzaakt.
Ovariëctomie wordt vaak uitgevoerd in knaagdiermodellen om de variabiliteit te verminderen die door de estrous-cyclus wordt geïntroduceerd; en aangezien endometriose een hormoonafhankelijke ziekte is, worden in deze gevallen suprafysiologische doses estradiol toegediend. Deze praktijk beperkt aantoonbaar de toepasbaarheid van een muismodel op menselijke ziekten. Onze studie toont aan dat ovariëctomie niet nodig is om op betrouwbare wijze endometrioselaesies te creëren en dat de fase van de estrous cyclus geen invloed heeft op het vermogen om laesies vast te stellen.
Een tekort aan andere intraperitoneale injectiemodellen is de afhankelijkheid van subjectieve metingen van laesiegrootte of -last. Hoewel het gebruik van remklauwen of andere instrumenten objectieve maatregelen kan bieden, worden deze metingen geregistreerd op het moment van de laesieoogst en kunnen zij daarom later niet worden geverifieerd en kunnen zij onderhevig zijn aan variabiliteit binnen de waarnemer. In ons model kan histologische kwantificering lang na obductie worden uitgevoerd en geverifieerd, wat betekent dat degenen die de obductie uitvoeren geen expertise hoeven te hebben in het identificeren van grove laesies en gemakkelijker verblind zijn over de ontvangen interventie. Bovendien kan, zoals uit ons werk blijkt, een deel van de ziekte worden gemist wanneer alleen wordt vertrouwd op een grove ziekte; bovendien kunnen veel vermoedelijke laesies eigenlijk fysiologisch zijn (bijv. lymfoïde weefsel) of fibrose. Ten slotte vermindert het nemen van gestandaardiseerde secties van hele anatomische gebieden in elke muis de variabiliteit verder. Deze benadering van het verkrijgen van dezelfde hoeveelheid weefsel per muis voorkomt de onvermijdelijke onderscopie die zou optreden bij kleine monsters en de overscore van grote monsters, vooral omdat microscopische ziekte aanwezig kan zijn.
Uiteindelijk dienen deze verfijningen om de aanpak zowel te standaardiseren als te vereenvoudigen, wat resulteert in een muismodel dat endometriose op een hoge doorvoermanier kan bestuderen. Dit model is een testbare methode om te screenen op trajecten en medicijndoelen, en ons lab gebruikt dit model momenteel voor een onderzoek naar medicijnvalidatie. Dit model is vooral nuttig bij het bepalen van het relatieve belang van afwijkende genexpressie (of medicamenteuze behandeling) in het donorendometrium versus de perifere omgeving van de ontvanger. Het kan ook worden gebruikt met reporter muizen (zoals we hebben aangetoond) en immunocompromised en knock-out muizen.
Samengevat bieden we verschillende belangrijke innovaties die een murien model bieden met een hoge betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid en objectiviteit bij het bestuderen van endometriose. Onze aanpak bevordert het veld door niet alleen een eenvoudig, gestroomlijnd proces voor laesie-inductie te bieden, maar ook een gestandaardiseerde manier om gegevens te meten en te rapporteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om openbaar te maken.
Acknowledgments
We willen de leden van het Reizes-laboratorium bedanken voor hun kritische beoordeling en inzichten tijdens de voorbereiding van het manuscript, evenals de kernen Imaging en Histology van het Lerner Research Institute voor hun hulp bij het verzamelen van gegevens en gegevensanalyse. Dit werk werd ondersteund door een interne subsidiefinanciering via het Research Program Committee van Cleveland Clinic en door een externe subsidie via de Society for Reproductive Investigation en Bayer. Onderzoek in het Reizes Laboratory wordt ook gefinancierd via VeloSano Bike to Cure, Center of Research Excellence in Gynecologic Cancer, en via De Laura J. Fogarty Endowed Chair voor Uterine Cancer Research. Cleveland Clinic bezit de auteursrechtelijke toestemming voor figuur 1 en figuur 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Zondervan, K. T., Becker, C. M., Missmer, S. A.
- Schwartz, K., Llarena, N. C., Rehmer, J. M., Richards, E. G., Falcone, T. The role of pharmacotherapy in the treatment of endometriosis across the lifespan. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 21 (8), 893-903 (2020).
- Giudice, L. C.
- D'Hooghe, T. M., Debrock, S. Endometriosis, retrograde menstruation and peritoneal inflammation in women and in baboons. Human Reproduction Update. 8 (1), 84-88 (2002).
- Ahn, S. H., et al. Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Falcone, T., Flyckt, R.
- Vercellini, P., et al. Association between endometriosis stage, lesion type, patient characteristics and severity of pelvic pain symptoms: a multivariate analysis of over 1000 patients. Human Reproduction. 22 (1), 266-271 (2007).
- Bulun, S. E., et al.
- Brueggmann, D., et al. Novel three-dimensional in vitro models of ovarian endometriosis. Journal of Ovarian Research. 7, 17 (2014).
- Dodds, K. N., Beckett, E. A. H., Evans, S. F., Hutchinson, M. R. Lesion development is modulated by the natural estrous cycle and mouse strain in a minimally invasive model of endometriosis. Biology of Reproduction. 97 (6), 810-821 (2017).
- Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), (2019).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3396 (2012).
- Nishimoto-Kakiuchi, A., et al. Spontaneous endometriosis in cynomolgus monkeys as a clinically relevant experimental model. Human Reproduction. 33 (7), Oxford, England. 1228-1236 (2018).
- Nair, H. B., et al. An efficient model of human endometriosis by induced unopposed estrogenicity in baboons. Oncotarget. 7 (10), 10857-10869 (2016).
- Laganà, A. S., et al. Translational animal models for endometriosis research: a long and windy road. Annals of Translational Medicine. 6 (22), 431 (2018).
- Bellofiore, N., et al. First evidence of a menstruating rodent: the spiny mouse (Acomys cahirinus). Amercian Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (1), 1-11 (2017).
- Bruner-Tran, K. L., Mokshagundam, S., Herington, J. L., Ding, T., Osteen, K. G. Rodent models of experimental endometriosis: identifying mechanisms of disease and therapeutic targets. Current Women's Health Reviews. 14 (2), 173-188 (2018).
- Bilotas, M. A., et al. Interplay between endometriosis and pregnancy in a mouse model. PloS One. 10 (4), 0124900 (2015).
- Peterse, D., et al. Of mice and women: a laparoscopic mouse model for endometriosis. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 25 (4), 578-579 (2018).
- Richards, E. G., et al. KLF11 is an epigenetic mediator of DRD2/dopaminergic signaling in endometriosis. Reproductive Sciences. 224 (8), Thousand Oaks, Calif. 1129-1138 (2017).
- Jones, R. L., Lang, S. A., Kendziorski, J. A., Greene, A. D., Burns, K. A. Use of a Mouse Model of Experimentally Induced Endometriosis to Evaluate and Compare the Effects of Bisphenol A and Bisphenol AF Exposure. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127004 (2018).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Nothnick, W. B., Graham, A., Holbert, J., Weiss, M. J. miR-451 deficiency is associated with altered endometrial fibrinogen alpha chain expression and reduced endometriotic implant establishment in an experimental mouse model. PloS One. 9 (6), 100336 (2014).
