Methodenartikel

Elektroporationsbasierte genetische Veränderung von primären menschlichen Pigmentepithelzellen mit dem Dornröschen-Transposon-System

DOI:

10.3791/61987

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4. Februar 2021

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1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir haben ein Protokoll entwickelt, um primäre menschliche Pigmentepithelzellen durch Elektroporation mit dem Gen, das für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) kodiert, unter Verwendung des Sleeping Beauty (SB) Transposon-Systems zu transfizieren. Die erfolgreiche Transfektion wurde durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Immunoblotting und enzymgebundenen Immunassay (ELISA) nachgewiesen.

Zusammenfassung

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Unsere zunehmend alternde Gesellschaft führt zu einer zunehmenden Inzidenz neurodegenerativer Erkrankungen. Bisher sind die pathologischen Mechanismen nur unzureichend verstanden, was die Etablierung definierter Therapien erschwert. Zellbasierte additive Gentherapien zur erhöhten Expression eines Schutzfaktors gelten als vielversprechende Option zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD). Wir haben eine Methode zur stabilen Expression des Gens entwickelt, das für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) kodiert, der als neuroprotektives und antiangiogenes Protein im Nervensystem charakterisiert wird, in das Genom primärer humaner Pigmentepithelzellen (PE) unter Verwendung des Dornröschen-Transposon-Systems. Primäre PE-Zellen wurden aus menschlichen Spenderaugen isoliert und in Kultur gehalten. Nach Erreichen des Zusammenflusses wurden 1 x 104 Zellen in 11 μL Resuspensionspuffer suspendiert und mit 2 μL einer gereinigten Lösung kombiniert, die 30 ng hyperaktives SB (SB100X) Transposase-Plasmid und 470 ng PEDF-Transposon-Plasmid enthielt. Die genetische Veränderung erfolgte mit einem Kapillarelektroporationssystem unter Verwendung folgender Parameter: zwei Impulse mit einer Spannung von 1.100 V und einer Breite von 20 ms. Transfizierte Zellen wurden in Kulturplatten überführt, die ein mit fetalem Rinderserum ergänztes Medium enthielten; Antibiotika und Antimykotika wurden mit dem ersten Medienaustausch hinzugefügt. Die erfolgreiche Transfektion wurde in unabhängig durchgeführten Experimenten nachgewiesen. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zeigte die erhöhte Expression des PEDF-Transgens. Die PEDF-Sekretion war signifikant erhöht und blieb stabil, wie durch Immunoblotting bewertet und durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) quantifiziert. Der SB100X-vermittelte Transfer ermöglichte eine stabile PEDF-Genintegration in das Genom von PE-Zellen und stellte die kontinuierliche Sekretion von PEDF sicher, was für die Entwicklung einer zellbasierten Genadditionstherapie zur Behandlung von AMD oder anderen degenerativen Netzhauterkrankungen entscheidend ist. Darüber hinaus zeigte die Analyse des Integrationsprofils des PEDF-Transposons in menschliche PE-Zellen eine fast zufällige genomische Verteilung.

Einleitung

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Das fortgeschrittene Alter wird als Hauptrisiko für neurodegenerative Erkrankungen beschrieben. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), eine polygene Erkrankung, die bei Patienten über 60 Jahren zu schwerem Sehverlust führt, gehört zu den vier häufigsten Ursachen für Erblindung und Sehbehinderung1 und wird voraussichtlich bis 2040 auf 288 Millionen Menschen ansteigen2. Funktionsstörungen des retinalen Pigmentepithels (RPE), einer einzigen Schicht dicht gepackter Zellen zwischen der Choriokapillare und den retinalen Photorezeptoren, tragen zur Pathogenese der AMD bei. Das RPE erfüllt mehrere Aufgaben, die für eine normale Netzhautfunktion unerlässlich sind3 und sondert eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Faktoren ab, die für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Netzhaut und der Choriokapillaris unerlässlich sind, wodurch das Überleben der Photorezeptoren unterstützt und eine Grundlage für die Zirkulation und die Versorgung mit Nährstoffen geschaffen wird.

In gesunden Augen ist der Pigmentepithel-abgeleitete Faktor (PEDF) dafür verantwortlich, die Auswirkungen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) auszugleichen und Neuronen vor Apoptose zu schützen, die Proliferation von Endothelzellen zu verhindern und das kapillare Endothel zu stabilisieren. Ein verschobenes VEGF-zu-PEDF-Verhältnis hängt mit der okulären Neovaskularisation zusammen, die in Tiermodellen4,5 sowie in Proben von Patienten mit choroidaler Neovaskularisation (CNV) aufgrund von AMD und proliferativer diabetischer Retinopathie beobachtet wurde 6,7,8,9,10 . Die erhöhte VEGF-Konzentration ist das Ziel für die aktuelle Standardbehandlung. Die Anti-VEGF-Medikamente Bevacizumab, Ranibizumab, Aflibercept und neuerdings Brolucizumab verbessern bei etwa einem Drittel der CNV-Patienten die Sehschärfe bzw. stabilisieren das Sehvermögen in 90% der Fälle11,12,13. Die häufigen, oft monatlichen intravitrealen Injektionen bergen jedoch das Risiko unerwünschter Ereignisse14, beeinträchtigen die Compliance der Patienten und stellen eine erhebliche wirtschaftliche Belastung für die Gesundheitssysteme dar15. Darüber hinaus spricht ein gewisser Prozentsatz der Patienten (2%-20%) nicht oder nur schlecht auf die Anti-VEGF-Therapiean 16,17,18,19. Diese negativen Begleiterscheinungen erfordern die Entwicklung alternativer Therapien, z.B. intraokularer Implantate, zell- und/oder gentherapeutischer Ansätze.

Die Gentherapie hat sich zu einer vielversprechenden Behandlung für erbliche und nicht-erbliche Krankheiten entwickelt und zielt darauf ab, nicht funktionsfähige Gensequenzen wiederherzustellen oder Fehlfunktionen zu unterdrücken. Bei polygenen Erkrankungen, bei denen die Identifizierung und der Ersatz der ursächlichen Faktoren kaum möglich ist, zielen Strategien auf die kontinuierliche Bereitstellung eines Schutzfaktors ab. Im Fall der AMD wurden verschiedene additive Therapien entwickelt, wie die stabile Expression von Endostatin und Angiostatin 20, der VEGF-Antagonist lösliche fms-ähnliche Tyrosinkinase-1 (sFLT-1)21,22, der komplementregulatorische Proteincluster der Differenzierung 59 (CD59)23 oder PEDF 24,25 . Das Auge und insbesondere die Netzhaut sind aufgrund der geschlossenen Struktur, der guten Zugänglichkeit, der geringen Größe und des Immunprivilegs ein ausgezeichnetes Ziel für eine genbasierte Medikation, wodurch eine lokalisierte Abgabe niedriger therapeutischer Dosen ermöglicht wird und Transplantate weniger anfällig für Abstoßungen werden. Darüber hinaus ermöglicht das Auge eine nicht-invasive Überwachung und die Netzhaut kann mit verschiedenen bildgebenden Verfahren untersucht werden.

Virale Vektoren sind aufgrund ihrer hohen Transduktionseffizienz das Hauptvehikel, um therapeutische Gene in Zielzellen zu bringen. Je nach verwendetem viralen Vektor wurden jedoch unterschiedliche Nebenwirkungen beschrieben, wie Immun- und Entzündungsreaktionen26, mutagene und onkogene Wirkungen 27,28 oder Verbreitung in anderen Geweben29. Zu den praktischen Einschränkungen gehören eine begrenzte Verpackungsgröße30 sowie Schwierigkeiten und Kosten im Zusammenhang mit der Herstellung von klinischen Chargen31,32. Diese Nachteile haben die Weiterentwicklung nicht-viraler, plasmidbasierter Vektoren gefördert, die über Lipo-/Polyplexe, Ultraschall oder Elektroporation übertragen werden. Die genomische Integration des Transgens in das Wirtsgenom wird jedoch in der Regel nicht mit Plasmidvektoren gefördert, was zu einer vorübergehenden Expression führt.

Transposons sind natürlich vorkommende DNA-Fragmente, die ihre Position innerhalb des Genoms ändern, eine Eigenschaft, die für die Gentherapie übernommen wurde. Aufgrund eines aktiven Integrationsmechanismus ermöglichen transposonbasierte Vektorsysteme eine kontinuierliche und konstante Expression des eingefügten Transgens. Das Dornröschen-Transposon (SB), rekonstituiert aus einem alten Transposon vom Typ Tc1/Mariner, das in Fisch33 gefunden und durch molekulare Evolution weiter verbessert wurde, was zur hyperaktiven Variante SB100X34 führte, ermöglichte eine effiziente Transposition in verschiedenen Primärzellen und wurde für die phänotypische Korrektur in verschiedenen Krankheitsmodellenverwendet 35. Derzeit wurden 13 klinische Studien mit dem SB-Transposon-System gestartet. Das SB100X-Transposon-System besteht aus zwei Komponenten: dem Transposon, das das interessierende Gen umfasst, flankiert von terminalen invertierten Wiederholungen (TIR), und der Transposase, die das Transposon mobilisiert. Nach der Lieferung von Plasmid-DNA an die Zellen bindet die Transposase die TIRs und katalysiert die Exzision und Integration des Transposons in das Genom der Zelle.

Wir haben eine nicht-virale zellbasierte additive Therapie zur Behandlung der neovaskulären AMD entwickelt. Der Ansatz umfasst die elektroporationsbasierte Insertion des PEDF-Gens in primäre Pigmentepithelzellen (PE) mittels des SB100X-Transposonsystems 36,37,38. Die genetische Information von Transposase und PEDF wird auf separaten Plasmiden bereitgestellt, wodurch die Einstellung des idealen SB100X-zu-PEDF-Transposon-Verhältnisses ermöglicht wird. Die Elektroporation wird mit einem pipettenbasierten Kapillartransfektionssystem durchgeführt, das sich durch eine maximale Spaltgröße zwischen den Elektroden bei gleichzeitiger Minimierung ihrer Oberfläche auszeichnet. Es wurde gezeigt, dass das Gerät hervorragende Transfektionsraten in einem breiten Spektrum von Säugetierzellenerreicht 39,40,41. Die kleine Elektrodenoberfläche sorgt für ein gleichmäßiges elektrisches Feld und reduziert die verschiedenen Nebenwirkungen der Elektrolyse42.

Die antiangiogene Funktionalität von PEDF, das von transfizierten Pigmentepithelzellen sezerniert wird, wurde in verschiedenen In-vitro-Experimenten gezeigt, in denen das Keimen, die Migration und die Apoptose menschlicher Nabelvenendothelzellen analysiertwurden 43. Darüber hinaus zeigte die Transplantation von PEDF-transfizierten Zellen in einem Kaninchenmodell der Hornhautneovaskularisation44 sowie einem Rattenmodell von CNV43,45,46 einen Rückgang der Neovaskularisation.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die stabile Insertion des PEDF-Gens in primäre menschliche RPE-Zellen über das SB100X-Transposonsystem unter Verwendung eines Kapillartransfektionssystems. Die transfizierten Zellen wurden 21 Tage in Kultur gehalten und anschließend hinsichtlich der PEDF-Genexpression durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und hinsichtlich der PEDF-Proteinsekretion durch Immunoblotting und enzymgebundenen Immunassay analysiert (ELISA, Abbildung 1).

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Protokoll

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Humane Spenderaugen wurden von der Aachener Hornhautbank der Augenklinik (Universitätsklinikum RWTH Aachen) nach Einholung der Einverständniserklärung gemäß den Protokollen der Deklaration von Helsinki bezogen. Die Verfahren für die Entnahme und Verwendung von Humanproben wurden von der institutionellen Ethikkommission genehmigt.

1. Isolierung primärer humaner RPE-Zellen

  1. Legen Sie sterile Schutzkleidung und Handschuhe aus. Legen Sie einen sterilen Vorhang unter eine laminare Strömung.
  2. Legen Sie sterile Präparationsinstrumente und andere notwendige sterile Geräte unter die laminare Strömung.
  3. Notieren Sie den Erhalt der Augenkugeln, den Beginn der Vorbereitung sowie mögliche Anomalien. Registrieren Sie das Alter des Spenders, das Geschlecht, die Todesursache und den Zeitraum zwischen dem Zeitpunkt des Todes und der Augenentfernung.
  4. Legen Sie die Augenkugel in eine sterile Gazekompresse und halten Sie sie in einer Hand.
  5. Trennen Sie das vordere Segment vom hinteren Segment durch einen umlaufenden Schnitt etwa 3,5 mm hinter dem Limbus mit einem Skalpell und einer extra feinen spitzen Augenschere.
  6. Nachdem Sie das hintere Segment nach unten geneigt haben, entfernen Sie vorsichtig den Glaskörper und die Netzhaut mit einer Colibri-Pinzette.
  7. Ordnen Sie den kollabierten RPE/Choroidea-Komplex diskret mit geraden Iriszangen neu an und halten Sie ihn anschließend mit einer gekrümmten Iriszange in Position.
  8. Füllen Sie die hintere Augenmuschel mit 1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Ham's F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F12), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 80 U / ml Penicillin und 80 μg / ml Streptomycin (Pen / Strepto) und 2,5 μg / ml Amphotericin B (AmphoB).
    HINWEIS: Im Gegensatz zur Isolierung von primären RPE-Zellen aus Schweine- oder Rinderaugen36,37 muss die hintere Augenmuschel nicht mit Trypsin gefüllt und inkubiert werden.
  9. Ernten Sie die RPE-Zellen, indem Sie das retinale Pigmentepithel vorsichtig mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette aus gebogenem Glas vom Sehnerv in Richtung Limbus bürsten, während Sie den RPE / Choroidea-Komplex mit einer Colibri-Pinzette am Limbus fixieren. Die Zellsuspension in eine Petrischale überführen.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 1.8 und 1.9 und sammeln Sie alle Zellen in der Petrischale. Resuspendieren Sie die Zellsuspension vorsichtig, indem Sie mit einer Einkanalpipette (100-1.000 μL) auf und ab pipettieren.
  11. Die RPE-Zellsuspension jeder Augenkugel wird in drei Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte gesät und bis zu 1 ml mit DMEM / F12 gefüllt, ergänzt mit FBS, Pen / Streptokokken und AmphoB.
  12. Die RPE-Zellkulturen werden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft und 5%CO2 gehalten, bis der Zusammenfluss erreicht ist. Wechseln Sie das Zellkulturmedium zweimal pro Woche.

2. Elektroporation primärer humaner RPE-Zellen

  1. Herstellung des SB100X Transposase/PEDF Transposon Plasmidgemisches
    1. Reinigen Sie die SB100X-Transposase- und PEDF-Transposon-Plasmid-DNA mit handelsüblichen Plasmid-Reinigungskits, die gemäß dem Protokoll des Herstellers für die Verwendung in Anwendungen wie Transfektion geeignet sind.
    2. Quantifizieren Sie die Plasmid-DNA-Gehalte mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer und stellen Sie sie auf eine Konzentration von 250 ng/μL mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) ein.
    3. Mischen Sie eine Portion 250 ng/μL SB100X-Transposase-Plasmid-DNA (z. B. 2,5 μL) mit 16 Portionen 250 ng/μL PEDF-Transposon-Plasmid-DNA (z. B. 40 μL). Restplasmidgemisch kann bei -20 °C gelagert werden.
      HINWEIS: Mehrere wiederholte Gefrier- und Auftauzyklen des Plasmidgemisches sollten vermieden werden.
    4. 2 μL der SB100X-Transposase/PEDF-Transposon-Plasmidmischung, die 29,4 ng SB100X-Transposon-Plasmid und 470,6 ng PEDF-Transposon-Plasmid enthält, in ein steriles 1,5-ml-Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen geben. Auf Eis halten, bis es mit Zellen vermischt ist.
  2. Aufbau des Kapillartransfektionssystems
    HINWEIS: Die Elektroporation von primären humanen RPE-Zellen wurde über ein Kapillartransfektionssystem unter Verwendung des 10-μL-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Das System besteht aus der Transfektionsvorrichtung, der Transfektionspipette und der Pipettenstation. Das Kit enthält 10 μL Transfektionsspitzen, Pufferröhrchen, Elektrolytpuffer E (Puffer E) und Resuspensionspuffer R (Puffer R).
    1. Schließen Sie die Pipettenstation an das Transfektionsgerät an.
    2. Füllen Sie ein Pufferrohr mit 3 mL Puffer E und führen Sie es in die Pipettenstation ein, bis ein Klickgeräusch zu hören ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Seitenelektrode des Pufferrohrs mit dem seitlichen Kugelkolben der Pipettenstation verbunden ist.
    3. Für die Elektroporation von primären humanen RPE-Zellen stellen Sie die folgenden Pulsbedingungen auf dem Transfektionsgerät ein: 1.100 V (Pulsspannung), 20 ms (Pulsbreite), zwei Impulse (Pulszahl).
  3. Präparation der kultivierten primären humanen RPE-Zellen
    1. Dokumentieren Sie Form und Morphologie der primären RPE-Zellkulturen mittels Phasenkontrastmikroskopie. Nehmen Sie Aufnahmen mit geringer Vergrößerung, um das Wachstum der RPE-Zellen zu einer konfluenten und integrierten Monoschicht zu demonstrieren, sowie Mikroskopaufnahmen mit höherer Vergrößerung, um die typische Kopfsteinpflastermorphologie der RPE-Zellen aufzuzeigen.
    2. Das Zellkulturmedium einsaugen und die Zellen zweimal mit 1 ml gepufferter Phosphatsalzlösung (PBS, pH 7,4) waschen.
    3. Trypsinisieren Sie primäre humane RPE-Zellen mit 0,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft und 5%CO2 für 7-15 min (maximal). Überprüfen Sie die Zellablösung mikroskopisch.
    4. Stoppen Sie die Trypsinisierung mit 1 ml DMEM/F12, ergänzt mit FBS. Nehmen Sie ein 20 μL Aliquot zur Zellzählung mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die RPE-Zellsuspension bei 106 x g für 10 min.
    5. Mischen Sie das 20 μL Aliquot mit 20 μL Trypanblau-Lösung. Pipettieren Sie 10 μL in jede Hälfte des Hämozytometers und zählen Sie die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop.
    6. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das RPE-Zellpellet in 1 ml PBS.
    7. Nehmen Sie 10.000-100.000 RPE-Zellen pro Transfektionsreaktion und zentrifugieren Sie sie bei 106 x g für 10 min.
      ANMERKUNG: Neben den Transfektionsreaktionen mit elektrischer Feldapplikation und Zugabe von Plasmid-DNA umfasst jeder Ansatz auch zwei verschiedene Kontrollkulturen: (1) ohne elektrische Feldapplikation und ohne Plasmid-DNA; (2) mit elektrischer Feldanwendung, aber ohne Plasmid-DNA.
    8. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 11 μL Puffer R und kombinieren Sie es mit 2 μL der SB100X-Transposase/PEDF-Transposon-Plasmidmischung (siehe Schritt 2.1.4).
      HINWEIS: Nach der Resuspension im Puffer R müssen die Zellen innerhalb von 15 Minuten verarbeitet werden, um eine Verringerung der Zelllebensfähigkeit und Transfektionseffizienz zu vermeiden.
    9. Führen Sie den Kopf der Transfektionspipette in die 10-μL-Transfektionsspitze ein, bis die Klemme den Montageschaft des Kolbens vollständig aufnimmt. Ziehen Sie die Zell-/Plasmidlösung in die Transfektionsspitze.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Erzeugung von Luftblasen und deren Aspiration in die Transfektionsspitze.
    10. Geben Sie 1 ml DMEM/F12, ergänzt mit FBS, aber ohne Pen/Streptokokken und ohne AmphoB, in die erforderliche Anzahl von Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte.
  4. Elektroporationsverfahren
    1. Führen Sie die Transfektionspipette in das Pufferrohr in der Pipettenstation ein (siehe Schritt 2.2.2), bis ein Klickgeräusch zu hören ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Metallkopf der Transfektionspipette mit dem Kugelkolben in der Pipettenstation und mit dem Pufferrohr verbunden ist.
    2. Drücken Sie auf dem Touchscreen des Transfektionsgeräts auf Start . Vor dem Anlegen des elektrischen Impulses prüft das Gerät automatisch, ob das Pufferrohr und die Transfektionspipette richtig eingesetzt sind. Nach der Abgabe der elektrischen Impulse wird Complete auf dem Touchscreen angezeigt.
    3. Entfernen Sie vorsichtig die Transfektionspipette aus der Pipettenstation und lösen Sie sofort die elektropolierten Zellen aus der 10-μL-Transfektionsspitze, indem Sie die Zell-/Plasmidlösung in die vorbereiteten Vertiefungen der Zellkulturplatte pipettieren (siehe Schritt 2.3.10).
    4. Transfizierte RPE-Zellkulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft und 5%CO2 halten. Fügen Sie Pen / Strep und AmphoB mit dem ersten Medienaustausch 3 Tage nach der Elektroporation hinzu.

3. Analysen transfizierter primärer humaner RPE-Zellen

  1. Probenvorbereitung
    1. Nach einer Kultivierungszeit von 3 Wochen schließlich die RPE-Zellkulturen in einem definierten Volumen von 1,0 ml DMEM/F12 ergänzt mit FBS, Pen/Streptokokken und AmphoB für eine definierte Zeit von 24 h inkubieren.
    2. Nehmen Sie die Zellkulturüberstände und lagern Sie sie bei -20 °C bis zur weiteren zeitnahen Verarbeitung oder bei -80 °C für thermisch instabile Proben und Langzeitlagerung.
    3. Trypsinisieren transfizierter RPE-Zellkulturen mit 0,5 mL 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre aus 95% Luft und 5%CO2 für 10 min.
    4. Stoppen Sie die Trypsinisierung mit 1 ml DMEM/F12, ergänzt mit FBS. Nehmen Sie kleine Aliquots für die Zellzählung mit einem Hämozytometer (siehe Schritt 2.3.5). Zentrifugieren Sie die RPE-Zellsuspensionen bei 106 x g für 10 min.
    5. Lagern Sie die RPE-Zellpellets bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C.
  2. Bewertung der PEDF-Sekretion durch Western Blotting
    HINWEIS: Für eine qualitative Bewertung werden Zellkulturüberstände (siehe Schritt 3.1.2) mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und anschließendem Western Blotting analysiert. Abhängig von der PEDF Transposon-Plasmid-DNA verwendet, müssen die Überstände unterschiedlich verarbeitet werden.
    1. Aufreinigung von His-markierten PEDF-Fusionsproteinen aus Zellkulturüberständen
      1. Nehmen Sie 30 μL Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) Aufschlämmung pro Probe mit einer abgeschrägten Spitze und pelletieren Sie das Ni-NTA-Harz durch Zentrifugation (2.660 x g für 30 s).
      2. Das Ni-NTA-Harz wird vorsichtig mit 200 μL 1x Inkubationspuffer (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0) resuspendiert und durch Zentrifugation pelletiert (2.660 x g für 30 s).
      3. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
      4. Das Ni-NTA-Harz wird vorsichtig mit 40 μL 4x Inkubationspuffer (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM Imidazol, pH 8,0) pro Probe resuspendiert.
      5. Mischen Sie 900 μL Zellkulturüberstand mit 260 μL 4x Inkubationspuffer und 55 μL vorbehandeltem Ni-NTA-Schlamm (siehe Schritt 3.2.1.4).
      6. Inkubieren Sie die Mischung auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur für 60 min.
      7. Pelletieren Sie das Ni-NTA-Harz durch Zentrifugieren (2660 x g für 60 s).
      8. Resuspendieren Sie das Ni-NTA-Harz vorsichtig mit 175 μL 1x Inkubationspuffer und Pelletharz durch Zentrifugation (2.660 x g für 60 s).
      9. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
      10. Das Ni-NTA-Harz wird vorsichtig mit 30 μL Elutionspuffer (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0) resuspendiert und die Mischung auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert.
      11. Pelletieren Sie das Ni-NTA-Harz durch Zentrifugieren (2.660 x g für 30 s).
      12. Nehmen Sie den Überstand vorsichtig und mischen Sie ihn mit 2x SDS-Probenpuffer47.
      13. Die Mischung wird 5 min bei 95 °C erhitzt und die Ni-NTA-gereinigten Proteine auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel getrennt.
      14. Western Blotting unter Verwendung von Anti-Penta-His-Antikörpern (Maus monoklonal, 1:500) und Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Anti-Maus-Antikörpern (Kaninchen polyklonal, 1:1.000) wie zuvor beschrieben36,37.
    2. Direkte Analyse von nicht markierten PEDF-Proteinen
      1. Nehmen Sie 15 μL Zellkulturüberstand und mischen Sie es mit 2x SDS-Probenpuffer47.
      2. Die Mischung 5 min bei 95 °C erhitzen und die Proteine auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel trennen.
      3. Western Blotting unter Verwendung von Anti-Human-PEDF-Antikörpern (Kaninchen polyklonal, 1:4.000) und HRP-konjugierten Anti-Kaninchen-Antikörpern (Ziege polyklonal, 1:2.000) wie zuvor beschrieben38.
    3. Quantifizierung der PEDF-Sekretion mittels ELISA
      1. Analyse von Zellkulturüberständen (siehe Schritt 3.1.2) mit einem humanen PEDF-ELISA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      2. Die Menge der sezernierten PEDF wird mit dem Zeitpunkt und der Zellzahl in Beziehung gesetzt, die für jede Transfektionsreaktion bestimmt wurden (siehe Schritt 3.1.4).
    4. Analyse der PEDF-Genexpression in transfizierten RPE-Zellen
      1. Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus den RPE-Zellpellets (siehe Schritt 3.1.5) unter Verwendung eines handelsüblichen Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      2. Quantifizieren Sie den RNA-Gehalt mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer.
      3. Durchführung der reversen Transkription auf 0,1 μg RNA unter Verwendung eines reversen Transkriptionssystems gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      4. Führen Sie die real-time qPCR wie zuvor beschriebendurch 38.
    5. Analyse von Transgen-Insertionsstellen in transfizierten RPE-Zellen
      1. Isolieren Sie genomische DNA aus den RPE-Zellpellets (siehe Schritt 3.1.5) mit einem handelsüblichen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      2. Quantifizieren Sie den DNA-Gehalt mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer.
      3. Generieren Sie Insertionsstellenbibliotheken unter Verwendung eines rechengestützten Hemi-spezifischen PCR-Schemas, wie zuvor beschrieben38.
      4. Führen Sie eine rechnerische Analyse wie zuvor beschriebendurch 38.

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Ergebnisse

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Kultivierung und Elektroporation primärer humaner RPE-Zellen
Wir haben gezeigt, dass die Aussaat einer ausreichenden Anzahl von primären RPE-Zellen tierischen Ursprungs die Kultivierung und das Wachstum zu einer integrierten Monoschicht pigmentierter, hexagonal geformter Zellenermöglicht 36,37,48. Ihre Fähigkeit, Tight Junctions zu bilden, phagozytische Aktivität zu zeigen und...

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Diskussion

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In unserem Projekt streben wir die nicht-virale Produktion von gentechnisch veränderten primären humanen RPE-Zellen an, die kontinuierlich einen wirksamen Faktor überexprimieren und sezernieren, um die transfizierten Zellen als Langzeittherapeutikum für die Etablierung und Aufrechterhaltung einer schützenden Umgebung zu nutzen. Wir haben die Einführung des Gens etabliert, das für PEDF kodiert, ein ubiquitär exprimiertes multifunktionales Protein mit antiangiogenen und neuroprotektiven Funktionen. Das hier beschriebene Pr...

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Offenlegungen

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Zoltán Ivics und Zsuzsanna Izsvák sind Erfinder mehrerer Patente auf SB-Transposon-Technologie

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch das Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Union für Forschung, technologische Entwicklung und Demonstration, Finanzhilfevereinbarung Nr. 305134, unterstützt. Zsuzsanna Izsvák wurde vom Europäischen Forschungsrat ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742) gefördert. Die Autoren danken Anna Dobias und Antje Schiefer (Augenklinik, Universitätsklinikum RWTH Aachen) für die hervorragende fachliche Unterstützung sowie der Aachener Hornhautbank (Augenklinik, Universitätsklinikum RWTH Aachen) für die Bereitstellung der menschlichen Spenderaugen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Isolierung von primären humanen RPE-Zellen
24-Well-ZellkulturplatteEppendorf, Hamburg, Deutschland0030722019
Amphotericin B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, DeutschlandA2942
Colibri PinzetteGeuder, Heidelberg, DeutschlandG-18950
Gebogene Iriszange Geuder, Heidelberg, DeutschlandG-18856
Einweg-Skalpell (Nr. 11)Feather, Osaka, Japan
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium/Schinken" s F-12 Nährstoffmischung (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, DeutschlandP04-41150
Extra feine spitze Augenschere Geuder, Heidelberg, DeutschlandG-19405
Fötales Rinderserum [0,2 µ m Steril gefiltert (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, DeutschlandP40-37500
GlaspasteurpipettenMarke, Wertheim, Deutschland747715
Penicillin [10.000 Einheiten/ml] und Streptomycin [10 mg/ml] (Pen/Strepto)Merck, Darmstadt, DeutschlandP0781
Pipettenspitzen (1000 &Mikro; L)Starlab, Hamburg, Deutschland
Einkanal-Pipette (100-1000 & Mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Sterile AbdecktuchLohmann & Rauscher, Rengsdorf, Deutschland
Sterile MullkompresseFink-Walter, Merchweiler, Deutschland321063
Sterile HandschuheSempermed, Wien, Österreich
Sterile Petrischale (Falcon 60 mm x 15 mm)Corning, Corning, NY351007
Steriler OP-KittelHalyard Health, Alpharetta, GA
Gerade Iris-Pinzette Geuder, Heidelberg, DeutschlandG-18855
Elektroporation von primären humanen RPE-Zellen
10 mM Tris-HCl (pH 8,5)
12-Well-ZellkulturplatteThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
24-Well-ZellkulturplatteEppendorf, Hamburg, Deutschland
Amphotericin B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, DeutschlandA2942
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium/Schinken" s F-12 Nährstoffmischung (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, DeutschlandP04-41150
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Fötales Rinderserum [0,2 µ m Steril filtriert] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, DeutschlandP40-37500
Inverses MikroskopLeica Mikrosysteme, Wetzlar, DeutschlandLeica DMi8
Mikrovolumen-Spektralphotometer (NanoDrop Spektralphotometer)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Kapillar-Transfektionssystem (Neon-Transfektionssystem)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Neon Transfection System 10 µ L KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Hämozytometer (Neubauer-Kammer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Deutschland0640110
PBS Dulbecco ohne Ca2+ ohne Mg2+Biochrom, Berlin, DeutschlandL182-50
Penicillin [10.000 Einheiten/ml] und Streptomycin [10 mg/ml] (Pen/Strepto)Merck, Darmstadt, DeutschlandP0781
Pipettenspitzen (10 & Mikro; L)Starlab, Hamburg, Deutschland
Pipettenspitzen (1000 µ L)Starlab, Hamburg, Deutschland
Pipettenspitzen (200 µ L)Starlab, Hamburg, Deutschland
Plasmid Maxi KitQiagen, Hilden, Deutschland12163
Einkanalpipette (0,1-10 & Mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Einkanal-Pipette (100-1000 µ L)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Einkanal-Pipette (10-200 µ L)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Trypanblau-LösungMerck, Darmstadt, DeutschlandT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Analysen von transfizierten primären humanen RPE-Zellen
10% SDS-Polyacrylamid Gel
1x Inkubationspuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0)
2x SDS-Probenpuffer
4x Inkubationspuffer (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM Imidazol, pH 8,0)
Amersham Protran unterstützt 0,2 µ M  Nitrocellulose-Blotting-MembranCytiva, Marlborough, MA10600015
Amphotericin B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, DeutschlandA2942
Anti-PEDF-Antikörper (Kaninchen polyklonal)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1
Anti-Penta-His-Antikörper (monoklonale Maus)Qiagen, Hilden, Deutschland34660
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium/Schinken" s F-12 Nährstoffmischung (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, DeutschlandP04-41150
Elutionspuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0)  
Fötales Rinderserum [0,2 µ m Steril filtriert] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, DeutschlandP40-37500
Hämozytometer (Neubauer-Kammer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Deutschland0640110
Meerrettich-Peroxidase-konjugierte Anti-Maus-Antikörper (Kaninchen-Polyklonal)Agilent Dako, Santa Clara, CAP0260
Meerrettich-Peroxidase-konjugierte Anti-Kaninchen-Antikörper (Ziegen-Polyklonal)Abcam, Cambridge, Vereinigtes Königreichab6721
Human PEDF ELISA Kit BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 Imaging SystemFujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 InstrumentRoche Life Science, Penzberg, Deutschland
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Penzberg, Deutschland12239264001
LightCycler  Kapillaren (20 μ l)Roche Life Science, Penzberg, Deutschland4929292001
Mikrovolumen-Spektralphotometer (NanoDrop-Spektralphotometer)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  Tetra Cell Casting ModuleBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Deutschland1658015
Mini-PROTEAN  Tetra Vertikale Elektrophoresezelle für vorgefertigte Mini-Gele, 4-GelBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Deutschland1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Deutschland30410
PageRuler Leiter für vorgefärbte ProteineThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
Penicillin [10.000 Einheiten/ml] und Streptomycin [10 mg/ml] (Pen/Streptomycin) Merck, Darmstadt, DeutschlandP0781
Pipettenspitzen (10 & Mikro; L)Starlab, Hamburg, Deutschland
Pipettenspitzen (1000 µ L)Starlab, Hamburg, Deutschland
Pipettenspitzen (200 µ L)Starlab, Hamburg, Deutschland
PowerPac BasicPower Supply Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Deutschland1645050
QIAamp DNA Mini KitQiagen, Hilden, Deutschland51304
Reverse Transkriptionssystem Promega, Madison, WIA3500
RNase-freies DNase-SetQiagen, Hilden, Deutschland79254
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Deutschland74104
SchaukelschüttlerCole-Parmer, Staffordshire, Vereinigtes KönigreichSSM3
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen (2,0 mL)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Einkanalpipette (0,1-10 & Mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Einkanal-Pipette (100-1000 µ L)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Einkanal-Pipette (10-200 µ L)Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Deutschland1704150
Trypan Blue SolutionMerck, Darmstadt, DeutschlandT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
0030722019MPK5000

Referenzen

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