Eine neuartige Technik zur Rekonstruktion des Blutkreislaufs in einem heterotopen abdominalen Mausherztransplantationsmodell wird demonstriert.
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Methodenartikel
Rekonstruktion des Blutkreislaufs in einem abdominalen Mausherztransplantationsmodell
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Operationstechnik der heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Mäusen ist ein Standardmodell für die Forschung in der Transplantationsimmunologie. Hier wird die etablierte Technik für eine modifizierte Blutkreislaufrekonstruktion in einem heterotopen abdominalen Herztransplantationsmodell vorgestellt. Diese Methode verwendet die intrathorakale vena cava inferior (IIVC) anstelle der Lungenarterie des Spenderherzens für die Anastomose zur unteren Hohlvene des Empfängers. Es erleichtert und verbessert die Erfolgsraten für abdominale Herztransplantationen bei Mäusen.
Einleitung
Die Operationstechnik der heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Mäusen stellt ein Standardmodell für die Forschung in der Transplantationsimmunologiedar 1,2,3. Es ist jedoch sehr schwierig durchzuführen und dies impliziert eine Einschränkung der weit verbreiteten Verwendung dieses Modells4,5.
Bei der traditionellen Mausherztransplantation (THTx) werden die Spenderaorta und die Empfängerabentraorta anastomosiert, während die Lungenarterie anastomosiert wird, um die Vena cava inferior des Empfängers zu astomosieren6,7,8.
Bei dieser modifizierten Mausherztransplantationstechnik wird die Spenderaorta anastomosiert an die Empfänger-Bauchaorta und der Spender IIVC wird an die Empfänger-Vena cava inferior anastomosiert(3,4,6) ( Abbildung2 und Abbildung 3).
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, durchgeführt (Ethikausschuss genehmigt, #G1071/09).
HINWEIS: Vorbereitende Vorbereitung, Anästhesie, postoperative Pflege und Überwachungsarbeiten sind die gleichen wie bei traditionellen chirurgischen Methoden1,2,4. BALB/c-Mäuse dienten als Herzspender und C57BL/6J als Transplantatempfänger. Mäuse waren 8-12 Wochen alt, wogen bei der Transplantation ~ 30 g und wurden unter Standardbedingungen untergebracht.
1. Vorbereitende Schritte
- Zur Anästhesie geben Mäuse inhalatives Isofluran (2%) bis zum Einschlafen, gefolgt von intraperitonealen Injektionen von Ketamin (100 mg/kg) + Xylazin (10 mg/kg) + Acepromazin (2 mg/kg). Zur postoperativen Analgesie Metamizol (200 mg/kg) p.o. und Carprofen (5 mg/kg) s.c.
HINWEIS: Auf die Anwendung von Antibiotika wurde absichtlich verzichtet, da diese Substanzen die immunologischen Reaktionen beeinflussen können. - Verwenden Sie für die Operation eine Reihe mikroskopischer Instrumente, darunter eine Mikroschere, eine Mikrozange, einen Nadelhalter und mikro hämostatische Klemmen. Ein elektrochirurgischer Stift ist ebenfalls notwendig. Führen Sie Nähte mit 7/0er, 10/0er und 4/0er Nylontypen durch.
- Legen Sie die Maus in eine Box zur Isofluran-Inhalation (2%) für 40-60 Sekunden. Bestimmen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Pfote mit einer Pinzette zusammendrücken. Wenn es einen völligen Mangel an Reaktion auf diesen Reiz gibt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
- Sobald die Maus eingeschlafen ist, wiegen Sie die Maus.
- Tragen Sie eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg) + Xylazin (10 mg/kg) + Acepromazin (2 mg/kg) auf die betäubte Maus auf.
- Befestigen Sie das Bauchfell und legen Sie die Maus auf den Operationstisch. Führen Sie die Desinfektion mit Povidoniodid für 3 Mal durch und drapieren Sie die Maus dann ordnungsgemäß mit einem fenestrierten chirurgischen Handtuch.
2. Verfahren der Spenderoperation
- Verwenden Sie eine Schere, um die Haut vom Hals bis zum Unterbauch zu schneiden, und schälen Sie die gesamte Hautschicht bis zur Mittellinie beider Achselhöhlen ab.
- Schneiden Sie mit einer Schere die Muskeln der Bauchdecke ab und bewegen Sie die Eingeweide vorsichtig nach links (aus der Sicht des Bedieners). Wickeln Sie die Eingeweide mit einer salzhaltigen Gaze weg, um die vena cava inferior sicher freizulegen.
- Verwenden Sie eine 1 ml Spritze, um 0,4 ml der Heparinlösung (enthält 500 U Heparin) langsam in die untere Hohlvene zu injizieren und warten Sie 1 Minute, bevor Sie die Nadel herausziehen.
- Ziehen Sie die Nadel heraus und schneiden Sie mit einer Mikroschere sowohl die Vena cava inferior als auch die Bauchaorta ab, um die Exsanguination zu beschleunigen.
- Verwenden Sie eine Schere, um die Brusthöhle zu öffnen, indem Sie einen U-förmigen Schnitt durchführen. legen Herz, Lunge und alle Blutgefäße der Brust vollständig frei.
- Legen Sie die thorakale Aorta frei, schneiden Sie 1/2 des Lumens und schneiden Sie dann die Lungenvene, um die Bewässerung und Drainage zu erleichtern.
- Führen Sie ein Spülrohr in die Öffnung der thorakalen Aorta ein, injizieren Sie mindestens 2 ml 4 °C kalte Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Kardioplegielösung (Custodiol HTK-Lösung)9, bis der Lungenvenenabfluss vollständig klar ist und das Herz vollständig aufhört zu schlagen.
- Ziehen Sie das Bewässerungsrohr heraus und lösen Sie das Brustbein.
- Verwenden Sie eine Mikroschere, um den Thymus zu entfernen und das Fett um den Aortenbogen leicht zu entfernen.
- Verwenden Sie eine gerade und gekrümmte Zette, um den Stamm der Arteria pulmonalis (auf der rechten Seite des Aortenbogens) mit einer 10/0-Naht freizulegen und zu ligieren.
- Verwenden Sie eine Mikrozette, um das fette und bindegewebe am IIVC befestigte Fett und Bindegewebe zu trennen, die obere Hohlvene (auf der linken Seite des Aortenbogens) mit einer 7/0-Naht freizulegen und zu ligieren, und schneiden Sie sie mit einer Mikroschere hinter die Ligatur.
- Machen Sie eine 7/0-Naht um die Basis des Herzens unter dem Aortenbogen, dem IIVC und beiden Ohrmuscheln. Dann ligaieren Sie die Lungenarterienäste und venösen Lungengefäße.
- Verwenden Sie eine Mikroschere, um den Aortenbogen so distal wie möglich, die Lungengefäße unter der Ligatur und das IIVC in der Nähe des Zwerchfells zu transektieren. Entfernen Sie das Herz aus der Brust.
- Das explantierte Spenderherz in eine 4 °C kalte HTK-Kardioplegielösung geben und vorübergehend konservieren.
3. Verfahren für die Empfängeroperation
HINWEIS: Die ersten Operationsschritte ähneln denen, die zuvor für die Spendermaus gezeigt wurden, einschließlich Anästhesie und Desinfektion.
- Führen Sie die Bauchhaut quer geschnitten durch, bedecken Sie die Bauchorgane mit einer nassen Gaze mit Kochsalzlösung.
- Verwenden Sie eine Mikrozette, um die Untervene und die Bauchaorta freizulegen und sie vom umgebenden Fettgewebe zu befreien.
- Verwenden Sie eine Mikrozette, um seitliche Zweiggefäße (seitlich oder unter der Vene / Aorta) unterhalb der Nierengefäße zu ligieren oder zu elektrokauterisieren.
- Verwenden Sie eine Clip-Applikatorzange, um zwei mikro hämostatische Klemmen am bauchigen Teil der Vene / Aorta von rechts zu positionieren, so dass mehr als 1 cm Abstand für beide Aorta / Vene bleibt, um Platz für den Aufbau der Anastomose zwischen ihnen zu gewährleisten.
- Verwenden Sie eine Mikroschere, um einen Schnitt in die Aorta etwas näher an der unteren Klemme als an der oberen Klemme zu machen. Alternativ können Sie mit einer 30 G-Nadel ein kleines Loch machen und mit einer Mikroschere öffnen.
- Positionieren Sie die Empfängermaus so, dass die Aorta dem Bediener mit der Hohlvene auf der anderen Seite zugewandt ist. Dann legen Sie das Herz in die Bauchhöhle und bedecken Sie es mit einem kleinen nassen Mullkissen.
- Verwenden Sie eine 10/0-Naht, um die Spenderaorta an die Kaudatanute des Empfängers anzupassen und zu nähen, einen Knoten zu machen und mit einer laufenden Naht bis zur Oberseite des Schnitts fortzufahren (ca. 4-5 Stiche). Als nächstes drehen Sie das Herz nach rechts (aus der Sicht des Subjekts), bedecken Es erneut und setzen Sie die Naht auf der linken Seite fort, bis Sie das kaudale Ende erreichen und es knoten.
- Verwenden Sie ein Bewässerungsröhrchen, um mindestens 0,5 ml 4 °C HTK-Kardioplegielösung zu injizieren, um den IIVC des Spenders zu spülen.
- Verwenden Sie eine Mikroschere, um ein rundes Loch auf der unteren Hohlvene des Empfängers zu schneiden, das die gleiche Größe wie das IIVC-Lumen des Spenders haben sollte. Der Schnitt sollte sich oberhalb der anastomotischen Aortenöffnung befinden. Machen Sie den Venenschnitt größer als den Aortenschnitt.
- Verwenden Sie eine 10/0-Naht, um den Spender IIVC an die Vena cava des Empfängers zu nähen, beginnend kaudal. Binden Sie einen Knoten und führen Sie eine laufende Naht durch, bis die Oberseite des Schnitts erreicht ist. Verwenden Sie fünf Stiche und setzen Sie die Naht auf der linken Seite fort. Zum Schluss einen Knoten in der Heckecke binden und vorsichtig festziehen (achten Sie darauf, nicht zu fest zu ziehen).
- Legen Sie die kleinen Teile des hämostatischen Schwammes um die Vene und Aortenaneastomosen.
- Verwenden Sie eine Clip-Applikatorzange, um zuerst die unteren und dann die oberen mikro-hämostatischen Klemmen zu entfernen und die Bauchhöhle mit 38,0 ° C temperiertem 0,9% Natriumchlorid zu spülen.
- Verwenden Sie eine Mikrozette, um den hämostatischen Schwamm zu entfernen.
- Beobachten Sie den Herzschlag des transplantierten Herzens.
- Verwenden Sie eine Zette, um den Darm wieder in die Bauchhöhle zu bringen, und zweischichtige Nähte (Bauchmuskeln, gefolgt von Haut), um die Bauchwunde mit einer 4/0-Naht zu schließen.
- Legen Sie die Mäuse in eine Sauerstoff- und Temperaturkontroll-Arbeitsplatzkammer (z. B. INVIVO2-400), um eine warme und sauerstoffreiche Umgebung für die Transplantatmäuse zu schaffen, um sich zu erholen, warten Sie, bis die Mäuse aufwachen.
- Bei postoperativer Analgesie metamizol nach der Operation direkt 200 mg/kg pro os verern. Vier und 16 Stunden nach der Operation geben Sie Metamizol 200 mg/kg pro os+ Carprofen (5 mg/kg) s.c. In der weiteren Nachbeobachtung carprofen (5 mg/kg) s.c an den transplantierten Mäusen alle 24 Stunden an drei aufeinanderfolgenden Tagen nach der Operation.
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Ergebnisse
Hier wird eine modifizierte Technik der heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Mäusen vorgestellt, die zuvor in unserem Labor entwickelt wurde und sich in den letzten 16 Jahren als nützlich erwiesen hat. Zuvor wurde berichtet, dass in insgesamt 40 Fällen von Vena cava zu vena cava (V-V-Gruppe) im Vergleich zu 40 Fällen der traditionellen Lungenarterie zu vena cava (P-V-Gruppe) Anastomose Verfahren4 (Tabelle 1) die Gefäßanastomose 20,8±1,3 min in der V-V-Gruppe dauerte, wa...
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Diskussion
Die Operationstechnik der heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Mäusen ist sehr anspruchsvoll und impliziert eine Einschränkung der weit verbreiteten Verwendung dieses Modells.
Einer der Nachteile der herkömmlichen Technik ist die begrenzende Länge der Lungenarterie (PA) des Spenders. Es ist in der Regel etwa 2 mm lang, während die Länge des IIVC des spenderherzens, das in unserem Modell verwendet wird, im Allgemeinen etwa 1 cm beträgt (Abbildung 2). Das...
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Danksagungen
Wir danken Dr. Yun Xu für ihre Hilfe als Synchronsprecherin, Dr. Jianhua Peng für ihre Hilfe bei der Videobearbeitung und Dr. Annika Kuckhahn für ihre Kommentare und Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterm Teil von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) zur Förderung internationaler Kooperationen (HO2581/4-1 bis AH) und der National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 zu FJ) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 30G-Nadeln: | Braun | 456300 | |
| Acepromazin | CP, Pharma | Tranquisol, P | |
| , BALB/c, AnNCrl, Mäuse | Charles River. Deutschland | keine Katalognummer | |
| Bepanthen Augensalbe | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Mikrozange | FST | 11083-07 | |
| Box für Isolierung und Sauerstoffversorgung | Gerät RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J Mäuse | Charles River. Deutschland | keine Katalognummer | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| KATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applikator Pinzette Typ | FST | 18057-14 | |
| Gebogene Pinzette | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Kö hler Chemie | keine Katalognummer | |
| Cutasept Hautdesinfektion | VWR | BODL980365 | |
| Elektrochirurgie-Pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| Mullbinden, Wattestäbchen | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heizmatte | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Blutstillender Schwamm | CuraSpon | J1276A | |
| Heparin-Lösung | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Eisbox | PETZ | Keine Katalognummer vorhanden | |
| Inhalationsanästhesiegerät | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| Isolations- und Sauerstoffversorgungsgerät | RUSKINN | INVIV | |
| Isofluran | CP | Pharma Isofluran CP 1 ml/ml | |
| Ketamin | Zoetis | no catalog number | |
| metamizole | WDT | no catalog | |
| Scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Abgewinkelt / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Mikroskop | Leica | LEICAMZ6 | |
| Mikroskopleuchte | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline Lösung (NaCl 0,9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Schere | Peha Instruments | 991083/4 | |
| kleine Petrischale | Sarstedt | 833900 | |
| Gerade Pinzette | WPI | 14113-G | |
| OP-Band | BSN | 4120 | |
| Nahtbindezange - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Nähte(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Nähte(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Nähte(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Spritze (0,3 mL) | BD | 324826 | |
| Spritze (1 mL) | BD | 320801 | |
| Xylazin | Bayer | Rompun |
Referenzen
- Corry, R., Winn, H., Russell, P. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Habertheuer, A., et al. Donor tissue-specific exosome profiling enables noninvasive monitoring of acute rejection in mouse allogeneic heart transplantation. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (6), 2479-2489 (2018).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26, 223-228 (2013).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Alamran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45, 625-629 (2013).
- Melanie, L., et al. Potential of Heterotopic Cardiac Transplantation in Mice as a Model for Elucidating Mechanisms of Graft Rejection. Cardiac Transplantation. Moffatt-Bruce, S. D., et al. , IntechOpen (2012).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513(2019).
- Wang, C., Wang, Z., Allen, R., Bishop, G. A., Sharland, A. F. A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), e51423(2014).
- Mokbel, M., et al. Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate Solution for Donor Heart Preservation Is Safe for Transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 109 (3), 763-770 (2020).
- Song, S., et al. Modified Suture Technique in a Mouse Heart Transplant Model. Asian Journal of Surgery. 34 (2), 86-91 (2011).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
- Wu, K., et al. cold storage using a new histidine-tryptophan-ketoglutarate-based preservation solution in isogeneic cardiac mouse grafts. European Heart Journal. 32 (4), 509-516 (2011).
- Türk, T. R., et al. Reduction of chronic graft injury with a new HTK-based preservation solution in a murine heart transplantation model. Cryobiology. 64 (3), 273-278 (2012).
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