Summary
Detta protokoll använder en immunofluorescensanalys för att upptäcka PM2,5-induceradDNA-skada i de dissekerade hjärtana hos zebrafiskembryon.
Abstract
Omgivande fina partiklar (PM2,5) exponering kan leda till hjärt utvecklingstoxicitet men de underliggande molekylära mekanismerna är fortfarande oklart. 8-hydroxy-2'deoxygenas (8-OHdG) är en markör för oxidativ DNA-skada och γH2AX är en känslig markör för DNA dubbelsträngsbrott. I denna studie syftade vi till att upptäcka PM2,5-inducerad8-OHdG och γH2AX förändringar i hjärtat av zebrafiskembryon med hjälp av en immunofluorescensanalys. Zebrafiskembryon behandlades med extrakterbara organiska ämnen (EOM)från PM 2, 5 vid 5 μg/ml i närvaro eller frånvaro av antioxidant N-acetyl-L-cystein (NAC, 0, 25 μM) vid 2 h efter befruktning (hpf). DMSO användes som fordonskontroll. Vid 72 hpf dissekerades hjärtan från embryon med hjälp av en spruta nål och fasta och permeabilized. Efter att ha blockerats undersöktes prover med primära antikroppar mot 8-OHdG och γH2AX. Prover tvättades och inkuberades sedan med sekundära antikroppar. De resulterande bilderna observerades under fluorescensmikroskopi och kvantifierades med ImageJ. Resultaten visar att EOM från PM2,5 avsevärt förbättrade 8-OHdG- och γH2AX-signaler i hjärtat av zebrafiskembryon. NAC, som fungerar som en reaktiv syreart (ROS) asätare, motverkade dock delvis den EOM-inducerade DNA-skadan. Här presenterar vi ett immunofluorescensprotokoll för att undersöka DNA-skadans roll i PM2,5-induceradehjärtfel som kan tillämpas på detektion av miljömässiga kemiskt inducerade proteinuttrycksförändringar i hjärtat på zebrafiskembryon.
Introduction
Luftföroreningar är nu ett allvarligt miljöproblem som världen står inför. Omgivande fina partiklar (PM2.5), som är en av de viktigaste indikatorerna på luftkvalitet, kan bära ett stort antal skadliga ämnen och komma in i blodcirkulationssystemet, vilket orsakar allvarlig skada på människors hälsa1. Epidemiologiska studier har visat att PM2, 5 exponering kan leda till en ökad risk för medfödda hjärtfel (CHDs)2,3. Bevis från djurförsök visade också att PM2,5 kan orsaka onormal hjärtutveckling hos zebrafiskembryon och avkomman till möss men de molekylära mekanismerna i hjärtutvecklingstoxiciteten hos PM2,5 är fortfarande till stor delokänd 4,5,6.
DNA-skador kan orsaka cellcykelstopp och inducera apoptos, vilket i stor utsträckning kan förstöra potentialen hos stamceller och därmed försämra hjärtutvecklingen7). Det har väl dokumenterats att miljöföroreningar, inklusive PM2,5, har potential att attackera DNA genom oxidativastressmekanismer 8,9. Både mänskliga och zebrafisk hjärt utveckling är känsliga för oxidativ stress10,11,12. 8-OHdG är en oxidativ DNA-skademarkör, och γH2AX-signal är en markör för DNA-dubbla strandbrott. N-acetyl-L-cystein (NAC), en syntetisk föregångare till intracellulär cystein och glutation, används ofta som en antioxidantförening. I denna studie använder vi NAC för att undersöka oxidativ stress i PM2.5- inducerad DNA-skada13.
Zebrafisk som modell ryggradsdjur har använts i stor utsträckning för att studera hjärtutveckling och mänskliga hjärt-kärlsjukdomar eftersom mekanismer för hjärtutveckling är mycket bevarade bland ryggradsdjur14,15. Fördelarna med att använda zebrafisk som modell inkluderar deras lilla storlek, starka reproduktiva förmåga och låga utfodringskostnader. Av särskilt intresse för dessa studier är zebrafiskembryon inte beroende av cirkulationssystemet under tidig utveckling och kan överleva allvarlig hjärtmissbildning14. Dessutom gör deras transparens att hela kroppen kan observeras direkt under ett mikroskop. Zebrafiskembryon ger således en enastående möjlighet att bedöma de molekylära mekanismer som är involverade i induktion av hjärtutvecklingstoxicitet till följd av exponering för olikamiljökemikalier 5,16,17. Vi har tidigare rapporterat att PM2,5-induceradoxidativ stress leder till DNA-skador och apoptos, vilket resulterar i hjärtmissbildningar i zebrafisk18. I denna studie tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att undersöka PM2,5-induceradDNA-skada i hjärtat av zebrafiskembryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafisk av vild typ (AB) som används i denna studie erhölls från National Zebrafish Resource Center i Wuhan, Kina. Alla djurförsök som beskrivs här har granskats och godkänts av Djurvårdsinstitutionen vid Soochow Universitys etikkommitté.
1. PM2.5 provtagning och extraktion av organiska föreningar
OBS: PM2.5 samlades in i ett stadsområde i Suzhou, Kina, 1-7 augusti 2015, som beskrivits tidigare5.
- Grädda 47 mm kvartsmembranfilter i en 500 °C muffleugn i 2 h för att ta bort de organiska komponenterna.
- Placera ett filter i en PM2.5-provtagare för 24 timmar oavbruten provtagning.
- Ta bort filtret och torka i 24 timmar vid rumstemperatur.
- Kvantifiera filtret med en analytisk balans.
- Extrahera organiska komponenter från filtret genom Soxhlet extraktion med diklormetan som lösningsmedel19.
- Torka EOM genom en roterande avdunstning i ett vattenbad och kväveflöde på 60 °C. Lös upp EOM i DMSO och förvara vid -20 °C.
2. Insamling och behandling av zebrafiskembryon
- Håll zebrafisken på 28,5 ± 0,5 °C i ett återcirkulationssystem med en 14 h ljus och 10 h mörk fotoperiodcykel.
- Placera friska vuxna zebrafisk i en tank med ett förhållande mellan män och kvinnor på 2:1.
- Nästa dag samlar du embryona och tvättar dem med systemvatten (dvs. zebrafiskuppfödningsvatten).
- Välj och slumpmässigt dela zebrafiskembryon som visar en normal utveckling (enhetlig storlek, fullkorn och ingen äggkoagulering) i 4 grupper i enskilda petriskålar i glas med en diameter av 7 cm (ca 50 embryon per maträtt).
- Behandla embryona med PM2,5 (5 mg/L) i närvaro eller frånvaro av NAC vid 0,25 μM från 2 hkf till 72 hkf. Använd DMSO som fordonskontroll till en slutlig koncentration vid 0,1 % (v/v).
3. Morfologisk observation av zebrafiskembryon och hjärtdesektion
- Vid 72 hkf, överför embryon till glasrutschbanor och observera under ett stereomikroskop. Registrera hjärt missbildningar, såsom perikardvätska ödem, förändrad looping och minskad storlek.
- Beräkna missbildningsfrekvensen (andelen embryon med hjärtfel av de totala levande embryona) och analysera skillnader mellan grupper med enkelvägs ANOVA följt av Turkiets multipla jämförelsetest (p < 0,05 = statistiskt signifikant).
- Bedöva embryona med 0,6 mg/ml MS-222 för att immobilisera dem på glasrutschbanor.
- Spela in hjärtslag i 30 s och kvantifiera hjärtfrekvensen med ImageJ-programvara5,20.
- Dissekera hjärtan från zebrafiskembryon med en engångsspruta under ett stereomikroskop. Varning: Undvik att förstöra hjärtformen.
4. Immunofluorescensanalys
- För att använda en immunofluorescensanalys för att upptäcka PM2,5 inducerad DNA-skada i hjärtat av zebrafiskembryon, använd en hydrofobisk barriärpenna för att rita en cirkel på en ren glassida.
- Tillsätt 50 μL paraformaldehyd 4 % till 1,25 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att göra en fixativ lösning.
- Placera 3 dissekerade hjärtan i en hydrofobisk barriärpennacirkel och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Dekanta lösningen under mikroskopet och torka proverna vid rumstemperatur i minst 5 minuter, så att hjärtana helt fäster på glasrutschbanorna.
- Tvätta bilderna tre gånger i PBS med 0,1% Tween 20 (PBST) i 5 min per tvätt.
- Tillsätt 50 μL bovint serumalbumin (BSA) till 1000 μL PBST för att få en 5% BSA-lösning och inkubera diabilderna i en fuktig kammare i 1 h för att blockera icke-specifik antikroppsbindning.
- Dekanta lösningen och tvätta proverna tre gånger med PBST i 5 min per tvätt.
- Späd 2 μL mus monoklonal antikropp mot 8-OHdG och 2 μL kanin polyklonal antikropp mot γH2AX i 296 μL PBST för att erhålla en fungerande primär antikropp cocktaillösning.
- Inkubera hjärtproverna med 50 μL av den primära antikroppscocktaillösningen mot 8-OHdG och γH2AX i en fuktad kammare i minst en timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C (Inkubation över natten kan öka signalintensiteten).
- Dekanta lösningen och tvätta proverna tre gånger med PBST i 5 min per tvätt.
- Späd 1 μL FITC-märkt getantimus sekundär antikropp och 1 μL cy3 get antikanin sekundär antikropp i 498 μL PBST för att erhålla en fungerande sekundär antikroppscocktaillösning och inkubera proverna med sekundära antikroppar (1:500 i PBST) i 1 timme vid rumstemperatur i mörkret.
- Dekanta lösningen och tvätta proverna tre gånger med PBS i 5 min per tvätt skyddad mot ljus.
- Tillsätt 20 μL DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole) till proverna för kärnfärgning i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Applicera ett täckglas för att glida och försegla med nagellack för att förhindra torkning och rörelse. Avbilda sedan proverna under ett fluorescensmikroskop och kvantifiera fluorescenssignalen i hjärtområdet med ImageJ-programvara. Beräkna de relativa ändringarna med medelvärdet av DMSO-kontrollprover. Bestäm uppgifternas statistiska signifikans enligt steg 3.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna immunofluorescensanalys är en känslig och specifik metod för att mäta proteinuttrycksförändringar i hjärtan hos zebrafiskembryon som exponeras för miljökemikalier.
I denna representativa analys utvärderades embryon som exponerats för PM2,5 i avsaknad eller närvaro av antioxidanten NAC för närvaro av hjärtmissbildningar (figur 1). Som observerats orsakade EOM från PM2, 5 en signifikant ökning av hjärt teratogenes, såsom perikardvätska ödem, förändrad looping och minskad storlek, jämfört med DMSO kontrollbehandlade hjärtan. Hjärtslagsfrekvensen minskade också avsevärt hos embryon som exponerades för valobservatörstörsakt (figur 1B). Tillsats av NAC försvagade EOM-inducerade hjärtfel avsevärt (figur 1).
Här användes immunofluorescensanalysen för att mäta 8- OHdG- och γH2AX-uttrycket i zebrafiskembryon för att utvärdera omfattningen av DNA-skador i EOM- behandlade vävnader. Som framgår av figur 2ökade nivåerna av 8- OHdG- och γH2AX-uttryck avsevärt i hjärtat på zebrafiskembryon som behandlats med EOM-gruppen jämfört med kontrollen, DMSO-behandlade hjärtan, vilket tyder på en ökning av oxidativa DNA-skador respektive DNA-dubbla strandbrott. Dessutom motverkades den EOM-inducerade DNA-skadan delvis av NAC-tillskott (figur 2).
Figur 1. Hjärt defekter av zebrafisk embryon på 72 hpf. A) Bilder av zebrafiskembryon vid 72 hpf. Prickade linjer indikerar atria (röd) eller ventriklar (blå). Skalstång, 200 μm. B) Hjärtfel och hjärtslagsfrekvens. Resultaten presenteras som ett ± SEM. Minst 50 embryon i varje grupp undersöktes. EOM: EOM vid 5 mg/L. NAC: NAC vid 0,25 μM.. **,P < 0,01; , p<0.001 Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2. DNA-skador i hjärtat av zebrafiskembryon vid 72 hpf. A) Immunofluorescens färgning. Skalstång, 100 μm. B) Kvantitativa resultat. Resultaten presenterades som ± SEM. Minst 15 hjärtan från varje grupp undersöktes. EOM: EOM vid 5 mg/L. NAC: NAC vid 0,25 μM. **; P < 0,01; ***; s<0.001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om zebrafisk är en utmärkt ryggradsdjursmodell för att studera miljökemikaliernas hjärtutvecklingstoxicitet, på grund av embryohjärtats lilla storlek, är det svårt att få tillräckligt med protein för västerländsk fläckanalys. Därför presenterar vi en känslig immunofluorescensmetod för kvantifiering av proteinuttrycksnivåerna för DNA-skador biomarkörer i hjärtat på zebrafiskembryon som utsätts för PM2,5.
Under dissekering är det viktigt att hålla hjärtats integritet intakt. Enligt vår erfarenhet är det relativt enkelt att utföra isoleringen vid 72 hkf. Dessutom måste hjärtat sättas i fixeringslösning så snart som möjligt efter insamling. Ett annat kritiskt steg är att torka proverna för att se till att de dissekerade hjärtana är helt fästa vid glasrutschbanan. Annars kan proverna tvättas bort från bilden under märkningen.
Dubbel immunofluorescens färgning utförs för att upptäcka både 8-OHdG och γH2AX signaler i de isolerade hjärtan. Denna metod sparar inte bara arbete och tillåter användning av en minskad provstorlek, men underlättar också samlokalisering av de två signalerna. Även om denna antikroppsbaserade metod inte kan upptäcka fluorescenssignaler i levande embryon, kan detta snabba protokoll användas för att upptäcka proteinuttryck i isolerade zebrafiskembryonhjärtan.
Det har ofta rapporterats att oxidativ stress förmedlar PM2,5-induceradDNA-skada8,9. Överdriven ROS-produktion kan leda till DNA-skador och apoptos under zebrafisk embryonal utveckling21,22,23. Som vi tidigare har rapporteratobserveras 18, ett ökat 8-OHdG och γH2AX signaluttryck i hjärtat på zebrafiskembryon som exponeras för EOM, vars uttryck motverkas avsevärt genom behandling med ROS-asätaren NAC. Det är anmärkningsvärt att NAC inte helt vänder PM2.5-induceradDNA-skada signaluttryck, vilket indikerar att oxidativ stress endast delvis kan bidra till de DNA-skador som observerats i hjärtat av zebrafiskembryon som utsätts för PM2.5.
Sammanfattningsvis använder denna metod en känslig teknik för att upptäcka PM2.5 inducerad DNA-skada i zebrafiskembryons intakta hjärtan. Dessutom kan metoden tillämpas för att upptäcka proteinuttrycksförändringar i hjärtan hos zebrafiskembryon som utsätts för andra miljökemikalier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Nature Sciences Foundation of China (Anslagsnummer: 81870239, 81741005, 81972999) och Den prioriterade akademiska programutvecklingen för Jiangsu Lärosäten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M.
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
