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Methodenartikel

Lage, Dissektion und Analyse des Murin-Stellat-Ganglions

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DOI:

10.3791/62026

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22. Dezember 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Pathophysiologische Veränderungen im kardialen autonomen Nervensystem, insbesondere in seinem sympathischen Zweig, tragen zum Auftreten und zur Aufrechterhaltung ventrikulärer Arrhythmien bei. Im vorliegenden Protokoll zeigen wir, wie murine Stellatganglien charakterisiert werden können, um das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen und zellulären Prozesse zu verbessern.

Zusammenfassung

Das vegetative Nervensystem ist ein wesentlicher Treiber der kardialen Elektrophysiologie. Insbesondere die Rolle seines sympathischen Zweiges ist eine laufende Untersuchungsfrage in der Pathophysiologie ventrikulärer Arrhythmien (VA). Neuronen in den Sternganglien (SG)   – bilaterale sternförmige Strukturen der sympathischen Kette –   sind ein wichtiger Bestandteil der sympathischen Infrastruktur. Die SG sind ein anerkanntes Ziel für die Behandlung über kardiale sympathische Denervierung bei Patienten mit therapierefraktärer VA. Während neuronaler Umbau und Gliaaktivierung im SG bei Patienten mit VA beschrieben wurden, sind die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Prozesse, die möglicherweise dem Auftreten von Arrhythmien vorausgehen, nur unzureichend verstanden und sollten zur Verbesserung der autonomen Modulation aufgeklärt werden. Mausmodelle ermöglichen es uns, sympathische neuronale Umbauten zu untersuchen, aber die Identifizierung des murinen SG ist für den unerfahrenen Forscher eine Herausforderung. So fehlen für viele häufige Herzerkrankungen vertiefte zelluläre und molekularbiologische Untersuchungen des murinen SG. Hier beschreiben wir ein grundlegendes Repertoire zur Sezierung und Untersuchung des SG bei erwachsenen Mäusen für Analysen auf RNA-Ebene (RNA-Isolierung für Genexpressionsanalysen, In-situ-Hybridisierung), Proteinebene (immunfluoreszierende Ganzkomountfärbung) und zelluläre Ebene (Basismorphologie, Zellgrößenmessung). Wir stellen mögliche Lösungen vor, um Herausforderungen in der Präparationstechnik zu meistern und die Färbung durch Abschrecken der Autofluoreszenz zu verbessern. Dies ermöglicht die Visualisierung von Neuronen sowie Gliazellen über etablierte Marker, um die Zellzusammensetzung und Umbauprozesse zu bestimmen. Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen die Charakterisierung des SG, um weitere Informationen über autonome Dysfunktion bei Mäusen zu gewinnen, die zu VA neigen, und können durch zusätzliche Techniken ergänzt werden, die neuronale und gliale Komponenten des autonomen Nervensystems im Herzen untersuchen.

Einleitung

Das kardiale autonome Nervensystem ist ein streng reguliertes Gleichgewicht von sympathischen, parasympathischen und sensorischen Komponenten, das es dem Herzen ermöglicht, sich an Umweltveränderungen mit der entsprechenden physiologischen Reaktion anzupassen1,2. Störungen in diesem Gleichgewicht, zum Beispiel eine Zunahme der sympathischen Aktivität, wurden als Schlüsselfaktor für den Beginn sowie die Aufrechterhaltung von ventrikulären Arrhythmien (VA)3,4festgestellt. Daher ist die autonome Modulation, die durch pharmakologische Reduktion der sympathischen Aktivität mit Betablockern erreicht wird, seit Jahrzehnten ein Eckpfeiler in der Behandlung von Patienten mit VA5,6. Aber trotz pharmakologischer und katheterbasierter Interventionen leidet eine relevante Anzahl von Patienten immer noch an wiederkehrender VA7.

Der sympathische Input zum Herzen erfolgt meist über neuronale Zellkörper in den Sternganglien (SG), bilateralen sternförmigen Strukturen der sympathischen Kette, die Informationen über zahlreiche intrathorarakale Nerven vom Hirnstamm zum Herzen weiterleiten8,9,10. Nervenkeimen aus dem SG nach Verletzung ist mit VA und plötzlichem Herztod verbunden11,12, wobei das SG als Ziel für autonome Modulation13,14hervorgehoben wird. Eine Reduktion des sympathischen Inputs in das Herz kann vorübergehend durch perkutane Injektion von Lokalanästhetika oder dauerhaft durch teilweise Entfernung des SG mittels videogestützter Thorakoskopie erreicht werden15,16. Herzsympathische Denervierung stellt eine Option für Patienten mit therapierefraktärer VA mit vielversprechenden Ergebnissendar 14,16,17. Wir haben von explantierten SG dieser Patienten gelernt, dass neuronale und neurochemische Umbauten, Neuroentzündungen und Gliaaktivierung Kennzeichen des sympathischen Umbaus sind, der die autonome Dysfunktion beitragen oder verschlimmern kann18,19. Dennoch bleiben die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Prozesse in diesen Neuronen bis heute unklar, zum Beispiel die Rolle der neuronalen Transdifferenzierung in einen cholinergen Phänotyp20,21. Experimentelle Studien präsentieren neue Ansätze zur Behandlung von VA, zum Beispiel die Verringerung der sympathischen Nervenaktivität über die Optogenetik22, aber eine eingehende Charakterisierung des SG fehlt noch bei vielen Herzerkrankungen, die mit VA einhergehen. Mausmodelle, die diese Pathologien nachahmen, ermöglichen es, neuronale Umbauten zu untersuchen, die möglicherweise dem Auftreten von Arrhythmien vorausgehen12,23. Diese können durch weitere morphologische und funktionelle Analysen zur autonomen Charakterisierung des Herzens und des Nervensystems ergänzt werden. Im vorliegenden Protokoll stellen wir ein grundlegendes Repertoire an Methoden zur Verfügung, die es ermöglichen, das murine SG zu sezieren und zu charakterisieren, um das Verständnis von VA zu verbessern.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Animal Care and Use Committee des Landes Hamburg (ORG870, 959) und dem Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (LANUV, 07/11) genehmigt und entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der Nationalen Gesundheitsinstitute (2011). Die Studien wurden mit männlichen und weiblichen (im Alter von 10-24 Wochen) C57BL/6-Mäusen (Stocknummer 000664, Jackson Laboratories) und Mäusen homozygot (db/db) oder heterozygot (db/het; Kontrolle) für die Diabetes-Spontanmutation (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, Lagernummer 000642, Jackson Laboratories). Die Autoren haben die vorliegenden Protokolle ohne Variationen für Mäuse im Alter von bis zu 60 Wochen verwendet.

1. Lage und Dissektion von murinen Sternganglien

HINWEIS: Obwohl Beschreibungen und Zeichnungen meist bei größeren Arten verfügbar sind, haben einige Publikationen zuvor den Standort des SG bei Ratten24 und Mäusen25 mit anatomischen Methoden bzw. fluoreszierenden Reporterlinien beschrieben.

  1. 50 ml eiskalte (3-4 °C) heparinisierte (20 Einheiten/ml, siehe Materialtabelle)phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten. Führen Sie die Dissektion des SG bei Raumtemperatur (RT) durch.
  2. Betäubung der Maus durch Inhalation von 3%-5% Isofluran gemäß den institutionellen und lokalen Richtlinien. Überprüfen Sie eine ausreichende Anästhesie durch Verlust des Pedalentzugsreflexes. Enthaupten Sie Mäuse oder führen Sie eine zervikale Dislokation durch.
    HINWEIS: Eine falsche zervikale Dislokation kann zu einem Bruch der Wirbelsäule und einer Schädigung der Brustgefäße führen, was zu Blutungen führt, die die Vorbereitung oder das Durchtrennen der Sympathischkette behindern, so dass SG nicht in ihrer richtigen Position sind. Daher ist es wichtig, dass erfahrenes Personal zervikale Dislokationen durchführt oder Tiere in tiefer Sedierung enthauptet.
  3. Besprühen Sie die Haut mit Ethanol und öffnen Sie den Thorax mit zwei Einschnitten entlang der vorderen Achsellinien mit einer Mayo-Schere und einer schmalen Musterzette. Schneiden Sie die Membran ab und entfernen Sie die Vorderseite des Brustkorbs.
  4. Entfernen Sie das Herz-Lungen-Paket, indem Sie die Aorta und die Hohlvene mit einer Londoner Zeilzette direkt über dem Zwerchfell greifen und mit der Strabismus-Schere alle Gefäße und das Bindegewebe in der Nähe der Wirbelsäule darunter schneiden.
  5. Spülen Sie den Thorax gründlich mit heparinisiertem PBS mit einer Kunststoff-Einwegpipette, bis alle Blutspuren entfernt sind.
  6. Legen Sie den Rumpf unter ein Stereomikroskop-Vorbereitungsfernglas und sorgen Sie mit externen Lichtquellen für eine gute Beleuchtung im Thorax.
  7. Lokalisieren Sie die erste Rippe und die Longus-Colli-Muskeln.
    HINWEIS: Die SG befinden sich bilateral, parallel zur Wirbelsäule am Ast zwischen der ersten Rippe und der Wirbelsäule, in einer Rille seitlich zu den Longus Colli Muskeln24. Die flache Seite des SG befindet sich neben den Longus-Colli-Muskeln. Je nach Präparat können Teile der sympathischen Kette bereits als weiße, schräge Fasern parallel zur Wirbelsäule sichtbar sein. Diese können bis zum SG zurückverfolgt werden.
  8. Verwenden Sie vorsichtig die Spitze der Dumont #5/45-Zette, um das Bindegewebe seitlich dem Longus-Colli-Muskel auszusetzen.
  9. Drehen Sie die Zette um 180° und verwenden Sie die flache Seite, um das SG zu greifen und mit minimalem Druck herauszuziehen.
  10. Wiederholen Sie dies mit dem zweiten SG.
  11. Beide SG in eine mit kaltem PBS gefüllte Schale (6 cm Durchmesser) geben und mit entsprechender Vergrößerung inspizieren. Entfernen Sie bei Bedarf überschüssige Gefäße, Fettgewebe und größere Nerven.
    HINWEIS: Autonome Ganglien sind von einer Bindegewebskapsel umgeben, die aus Kollagenfasern und Fibroblasten26,27besteht. Die Durchlässigkeit dieser Kapseln scheint zwischen den Arten, verschiedenen Arten von Ganglien26 und Alter28zu variieren. Mit der Dumont #5/45-Zette und gegebenenfalls der Federschere so viel Bindegewebe wie möglich entfernen.
  12. Fahren Sie je nach Ziel des Experiments mit Abschnitt 2, 3 oder 5 dieses Protokolls fort.

2. Immunhistochemie-Protokoll für die gesamte Montierung

HINWEIS: Dieses Protokoll ist von kardialen Ganzkettfärbungen4,29angepasst. Führen Sie Inkubationsschritte für jedes einzelne SG in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte durch und verwenden Sie 100 μL (für antikörperhaltige Lösungen) bis 200 μL (für alle anderen Lösungen) der Lösung, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. Überprüfen Sie regelmäßig die Abdeckung und das korrekte Eintauchen des SG mit einem Fernglas. Entfernen Sie Flüssigkeiten manuell mit einer 200 μL Pipette mit einer zusätzlichen 10 μL Spitze auf der 200 μL Spitze. Dies verhindert eine Aspiration des SG in der Pipettenspitze. Verwenden Sie frisch zubereitete Lösungen und sterile Flüssigkeiten, um Bakterienwachstum zu verhindern.

  1. Fix SG für die Histologie für 2 h bei RT in 4% methanolfreiem Paraformaldehyd (PFA)/PBS.
  2. Verarbeiten Sie SG so schnell wie möglich, aber sie können an dieser Stelle 2-4 Wochen bei 4-6 °C in PBS mit 0,02% (w/v) Natriumazid gelagert werden.
  3. Bereiten Sie sudanesische Schwarzstofflösung (1% Sudan Schwarz w/ v in 100% Ethanol) zur Reduzierung der Autofluoreszenz und Verbesserung des Signal-Hintergrund-Verhältnisses30 vor. 2-3 h auf einem Magnetrührer bei RT auflösen.
    HINWEIS: Verwenden Sie die Stammlösung für maximal 6-8 Wochen, entsorgen Sie sie früher, wenn Sedimentation auftritt.
  4. Bereiten Sie sudanesische schwarze Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung für 30 Minuten mit voller Geschwindigkeit (13.000 x g)zentrifugieren, um Ablagerungen zu entfernen und den Bestand in 70% Ethanol auf eine Endkonzentration von 0,25% Sudan Black zu verdünnen.
  5. Behandeln Sie SG mit Dents Bleichmittel, um die Antikörperpermeabilisierung zu verbessern31. Bereiten Sie dent-Bleichmittel frisch vor, indem Sie Methanol (MeOH), Wasserstoffperoxidlösung 30% (w/w) inH2Ound Dimethylsulfoxid (DMSO) im Verhältnis 4:1:1 mischen. Fügen Sie 200 μL pro SG hinzu und legen Sie die Platte für 1 h bei RT auf einen Orbitalschüttler.
  6. Führen Sie eine absteigende MeOH-Serie zur Rehydratation durch, indem Sie jeweils 10 Minuten auf einem Orbitalschüttler inkubieren: 100% MeOH, 75% MeOH/ PBS, 50% MeOH / PBS, 25% MeOH / PBS.
  7. Führen Sie eine Permeabilisierung durch, indem Sie SG zweimal für jeweils 60 Minuten in PBS/1% Triton-X-100 bei RT inkubieren.
  8. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung aus dem SG und fügen Sie die Sudan Black Working Solution hinzu. Inkubieren Sie für 2 h bei RT auf einem Orbitalschüttler.
  9. In der Zwischenzeit eine Blockierungslösung vorbereiten, indem Sie 5% Rezeptor-Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Triton-X-100 in PBS einem 15-ml-Gefäß hinzufügen und es auf einem Walzenschüttler für ca. 5-10 min auflösen lassen. Dekantieren Sie durch einen vorgefertigten Papierfilter, um Schmutz zu entfernen.
  10. Entfernen Sie Sudan Schwarz sehr vorsichtig, indem Sie die Platte kippen und vorsichtig von der aufrechten Seite pipettieren.
    HINWEIS: Es ist nicht möglich, das SG in Sudan schwarz zu sehen. Verwenden Sie eine starke Lichtquelle und arbeiten Sie langsam. Ab diesem Schritt sind SG schwarz gefärbt, was die Sichtbarkeit verbessert. Wenn an dieser Stelle zusätzliches Bindegewebe um SG herum zu sehen ist, entfernen Sie es mit Dumont #5/45-Zette und Federschere.
  11. Fügen Sie 200 μL PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) hinzu und waschen Sie es 5 Minuten bei RT auf einem Orbitalschüttler.
  12. Entfernen Sie PBS-T, indem Sie es mit einer Pipette absaugen und 2 Mal wiederholen.
  13. PBS entfernen; 200 μL Blocklösung hinzufügen und bei 4 °C über Nacht auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
  14. Bereiten Sie am nächsten Tag Lösungen vor, indem Sie primäre Antikörper in die Blockierungslösung geben. Passen Sie Antikörperkonzentrationen aus etablierten Protokollen an.
    HINWEIS: Fügen Sie ein SG als Antikörperkontrolle ohne primären Antikörper ein (inkubiert mit Antigen-vorabsorbiertem Antikörper oder IgG, falls verfügbar, oder Blockierender Puffer).
  15. Führen Sie die primäre Antikörperinkubation für 36-48 h bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler durch. Für Zellgrößenmessungen und die Färbung sympathischer Neuronen verwenden Sie Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase (siehe Materialtabelle für Antikörperempfehlungen).
    HINWEIS: Legen Sie die 96-Well-Platte in eine Nasskammer (z. B. Kunststoffbox, die mit ddH2O-benetzten Papiertüchern ausgekleidet ist), um eine Verdunstung an dieser Stelle zu verhindern.
  16. Entfernen Sie die Antikörperlösung vorsichtig und fügen Sie 200 μL PBS-T hinzu. Legen Sie die Platte für 30 minuten auf einen Orbitalschüttler.
  17. Entfernen Sie PBS-T und wiederholen Sie den Waschschritt 5 weitere Male.
  18. Bereiten Sie die sekundäre Antikörper-Arbeitslösung vor, indem Sie fluoreszierende Alexa-markierte sekundäre Antikörper vor der Verwendung für 1 Minute mit voller Geschwindigkeit (13.000 x g)zentrifugieren. Verdünnen Sie die entsprechenden sekundären Antikörper entsprechend den primären Antikörpern 1:500 in der Blocklösung und fügen Sie sie zu SG hinzu. Fügen Sie 1 μg/ml Bisbenzimid H33342 Trihydrochlorid (Hoechst-Färbung) hinzu, wenn eine Kernfärbung gewünscht wird. 12-24 h bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
  19. Entfernen Sie die Antikörperlösung vorsichtig und fügen Sie 200 μL PBS-T hinzu. Legen Sie die Platte für 30 minuten auf einen Orbitalschüttler.
  20. Entfernen Sie PBS-T und wiederholen Sie den Waschschritt 5 weitere Male. Verwenden Sie für den letzten Schritt PBS ohne Triton.
  21. Zum Einbetten 50-100 μL fluoreszierendes Montagemedium (siehe Materialtabelle)auf einem Glasobjektträger verteilen und unter Vorbereitung ein Fernglas legen. Verwenden Sie die Dumont #5/45-Heft, um SG von der 96-Well-Platte aufzunehmen und überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem Sie ein Ende auf ein Filterpapier (z. B. Whatman-Trockenpad) tauchen und auf den Tropfen legen.
  22. Verwenden Sie die Dumont #5/45-Zette, um die Positionierung mit der entsprechenden Vergrößerung zu korrigieren.
  23. Legen Sie vorsichtig einen Glasdeckel (20 mm x 20 mm) neben das SG und steigen Sie langsam ab.
    HINWEIS: Die Verwendung von zu viel Montagemedium führt zu einer Bewegung des SG oder zu einem Verheddern der Nerven. Entfernen Sie in diesem Fall schnell die Abdeckung und wiederholen Sie die Schritte 2.9-2.21.
  24. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei RT im Dunkeln trocknen. Die Lagerung der gefärbten Probe ist für mindestens 4-6 Wochen bei 4 °C möglich.

3. In-situ-Hybridisierung der gesamten Montierung

HINWEIS: Die Ganzkilierung in situ-Hybridisierung des SG wird aus dem Organ von Corti32 und dem kommerziellen RNA-Fluoreszenz-in-situ-Protokoll adaptiert (siehe Materialtabelle). Beziehen Sie Sonden für die interessierenden Gene und Puffer und Lösungen vom Lieferanten. Alle Inkubationsschritte werden bei RT durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie steriles PBS. Wenn Sie mehrere SG in einer Vertiefung färben möchten, verwenden Sie mindestens 150 μL Puffer und Lösungen.

  1. Führen Sie die Dissektion des SG wie in den Schritten 1.1-1.13 beschrieben durch.
  2. Fixieren Sie SG für 1 h in 200 μL 4% MeOH-freiem PFA/PBS in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte, die auf einem Orbitalschüttler platziert ist.
  3. Waschen Sie SG dreimal für jeweils 30 minuten in 0,1% Tween-20/PBS auf einem Orbitalschüttler.
  4. Dehydrieren Sie SG in der MeOH/PBS-Serie durch anschließende Inkubation in 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS und 100% MeOH für jeweils 10 min auf einem Orbitalschüttler.
  5. SG bei -20 °C in 100% MeOH über Nacht lagern.
  6. Am nächsten Tag den Inkubator auf 40 °C vorwärmen. Überprüfen Sie die Temperatur mit einem Thermometer.
  7. Rehydrieren Sie SG in umgekehrter MeOH/PBS-Serie (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) für jeweils 10 min.
  8. Waschen Sie SG dreimal für jeweils 5 minuten in PBS.
  9. In der Zwischenzeit beginnen Sie mit dem Vorwärmen der Sonden durch Inkubation bei 40 °C für 10 min, gefolgt von einer Abkühlung für 10 min.
  10. Inkubieren Sie SG in 200 μL Protease III für 15 min.
  11. Optional: Führen Sie eine Sudan-Schwarzbehandlung durch, um die Autofluoreszenz gemäß den Abschnitten 2.3, 2.4 und 2.8 dieses Protokolls zu löschen, wenn eine anschließende Immunfluoreszenzfärbung geplant ist.
  12. SG in 200 μL 0,1% Tween-20/PBS 3x für jeweils 5 min auf einem Orbitalschüttler waschen.
  13. Optional: Wenn eine Co-Färbung mit mehreren Sonden gewünscht ist, verdünnen Sie Kanal-2 (50x) und Kanal-3-Sonde (50x) in Kanal-1-Sonde (1x).
  14. SG mit 100 μL Sonde für das interessierenden Gen abdecken und über Nacht bei 40 °C mit leichter Rührung inkubieren. Legen Sie die 96-Well-Platte für alle Inkubationsschritte in eine Nasskammer bei 40 °C.
    HINWEIS: Fügen Sie ein SG als Negativkontrolle ein, indem Sie eine Sonde gegen ein bakterielles Gen (z. B. Dihydro-Dipicolinat-Reduktase, Dapb)verwenden, um in späteren Schritten auf unspezifische Bindung von Amplifikationsreagenzien zu überprüfen.
  15. Sg im mitgelieferten Waschpuffer 3x für je 15 min auf einem Orbitalshatter waschen.
  16. Vorwärmen Sie Amp1-3, HRP-C1 und HRP-Blocker auf RT. Wenn eine Co-Färbung mit Kanal-2 und/oder Kanal-2-Sonde gewünscht ist, hrP-C2 und HRP-C3 vorwärmen.
  17. Fixieren Sie SG für 10 min bei RT in 4% PFA/ PBS auf einem Orbitalschüttler.
  18. Sg in 200 μL mitgeliefertem Waschpuffer 3x für je 5 min auf einem Orbitalschüttler bei RT waschen.
  19. Zur Verstärkung SG mit 100 μL Amp1 für 35 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
  20. Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit und waschen Sie SG in 200 μL des mitgelieferten Waschpuffers 3x für jeweils 5 min bei RT auf einem Orbitalschüttler.
  21. Inkubieren Sie SG mit 100 μL Amp2 für 35 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler.
  22. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  23. Inkubieren Sie SG mit 100 μL Amp3 für 20 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler.
  24. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  25. Inkubieren Sie SG mit 100 μL mitgeliefertem Multiplex FL v2 HRP-C1 für 20 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler.
  26. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  27. Opalkonjugierte sekundäre Antikörper 1:1.000 in 200 μL zugeführtem TSA-Puffer vorbereiten und SG für 35 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Schützen Sie vor Licht während der Inkubation und ab diesem Schritt.
  28. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  29. Inkubieren Sie SG in 100 μL des mitgelieferten Multiplex FL v2 HRP-Blockers für 15 min bei 40 °C auf einem Orbitalschüttler.
  30. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  31. Optional: Für die Co-Färbung mit der Channel-2-Sonde wiederholen Sie die Schritte 3.25-3.30 mit dem mitgelieferten Multiplex FL v2 HRP-C2.
  32. Optional: Für die Co-Färbung mit der Channel-3-Sonde wiederholen Sie die Schritte 3.25-3.30 mit dem mitgelieferten Multiplex FL v2 HRP-C3.
  33. Im Falle einer nachfolgenden immunfluoreszierenden Färbung führen Sie die Schritte 2.13-2.25 dieses Protokolls durch.
  34. Inkubieren Sie in 1% BSA/PBS für 30 min auf einem Orbitalschüttler.
  35. Inkubieren Sie SG für 30 min in 1 μg/ml Bisbenzimid H33342 Trihydrochlorid (Hoechst-Färbung) in 1% BSA/PBS, wenn eine Kernfärbung gewünscht ist, und/oder fügen Sie Alexa-gekoppeltes Weizenkeimagglutinin (WGA, 1:500) auf einem Orbitalschüttler hinzu.
  36. Wiederholen Sie Schritt 3.18.
  37. Einbetten wie in den Schritten 2.19-2.22 beschrieben.

4. Bildgebung und Analyse von mausen Stellatganglien

  1. Führen Sie konfokale Mikroskopie von eingebettetem SG in der lokalen Bildgebungseinrichtung durch.
  2. Wenn Zellgrößenmessungen erforderlich sind, bilden Sie SG für Tyrosinhydroxylase (siehe Materialtabelle)mit 200-facher Vergrößerung und nehmen Sie 4-6 zufällige Bilder von jedem SG auf.
  3. Analysieren Sie Bilder mit der ImageJ33-Software, um die Zellgröße zu schätzen (z. B. mit einer Stifttabelle, siehe Materialtabelle). Verwenden Sie die freie Handauswahl,umkreisen Sie jede Zelle und klicken Sie auf Analyse | Messen, um die Zellfläche zu erhalten. Achten Sie darauf, nur intakte, vollständig sichtbare Zellen einzubeziehen, die sich gut im SG befinden.
  4. Mit dieser Methode können Sie etwa 100 Zellen pro SG messen.
  5. Lassen Sie einen verblindeten Prüfarzt die Schritte 4.2-4.3 durchführen, wenn Sie SG von verschiedenen Mäusen vergleichen möchten. Verwenden Sie eine Häufigkeitsverteilung in statistiker Software, um Größenunterschiede zwischen Gruppen34zu visualisieren.

5. Molekulare Analysen von mausinen Sternganglien

HINWEIS: Fügen Sie je nach experimentellem Design Steuerelemente ein. Dies könnte SG mit unterschiedlichen Genotypen und Krankheitshintergrund und/oder anderen autonomen Ganglien sein, wie z.B. das sympathische obere zervikale Ganglion (im Halsbereich gelegen, siehe detaillierte Beschreibung in Ziegler et al.35)oder parasympathische Ganglien (wie intrakardiale Ganglien, siehe Jungen et al.4).

  1. Bereiten Sie ein 2-ml-Röhrchen mit 500 μL Phenol/Guanidinthiocyanat-Lösung (z. B. Qiazol) pro Tier vor und halten Sie flüssigen Stickstoff für das Schock-Frosting bereit oder ziehen Sie kommerzielle Lösungen zum Schutz von RNA in Betracht (optional, siehe Materialtabelle)36. Arbeiten Sie schnell für die RNA-Isolierung.
  2. Führen Sie die Dissektion des SG wie in den Schritten 1.1-1.13 beschrieben durch.
  3. Tauchen Sie beide SG sofort direkt in ein Röhrchen mit Phenol/Guanidinthiocyanat-Lösung und Schockfrost-Röhrchen in flüssigen Stickstoff.
  4. Bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C lagern.
  5. Für die Gewebelyse Röhrchen mit SG auftauen lassen, bis Phenol/Guanidinthiocyanatlösung verflüssigt ist und zwei 7 mm Edelstahlperlen hinzufügen. Kühlen Sie die Metallteile des Gewebehomogenisators (Kugel- oder Mischermühle, z.B. Tissue Lyser II) auf Trockeneis und Zentrifuge bei 4 °C ab.
  6. Zentrifugenröhrchen bei 500 x g für 1 min bei 4 °C, so dass SG am Boden des Rohres sind.
  7. Schläuche in die Metallteile des Tissue Lyser geben und 1 min bei 20 Hz lysieren.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7 bis zu 5 Mal, bis kein intaktes Gewebe nachweisbar ist.
  9. Die Flüssigkeit in ein frisches 1,5 ml Röhrchen geben.
  10. Führen Sie die RNA-Isolierung mit einem säulenbasierten RNA-Isolationskit (z. B. miRNeasy Mini-Kit) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  11. Elute RNA in 20 μL RNase-freiem Wasser und Messung der Konzentration mit einem Spektralphotometer.
    HINWEIS: Um eine Kontamination der gereinigten RNA mit genomischer DNA auszuschließen, schlagen wir vor, eine Polymerase-Kettenreaktion mit genomischen Primern und 1 μL RNA als Vorlage durchzuführen, anstatt abzüglich der Reverse-Transkriptase-Kontrolle. Dies spart eine erhebliche Menge an RNA. Wenn RNA kontaminiert ist, verwenden Sie Exon-Intron-Grenzprimer oder Intron-Flankenprimer für die anschließende quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion.
  12. Verwenden Sie 250 ng SG RNA, um die cDNA-Synthese durchzuführen und etablierte Protokolle zu verwenden. Hier wurde ein hochleistungsfähiges cDNA-Reverse-Transkriptions-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
  13. Verdünnen Sie auf eine Endkonzentration von 2,5 ng/μL cDNA und führen Sie eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion mit den entsprechenden Sonden gemäß den festgelegten Protokollen durch. Hier wurde der TaqMan Assay (siehe Materialtabelle)mit 10 ng cDNA pro Reaktion durchgeführt.
    HINWEIS: Führen Sie für jedes Gen eine Kontroll ohne Vorlage durch, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen.
  14. Normalisieren Sie die Genexpression Ihres interessierenden Gens auf einem Haushaltungsgen (z. B. Cdkn1b),um die relative Genexpression zwischen verschiedenen Gruppen von SG zu vergleichen.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt, wie das SG identifiziert und seziert werden kann. Abbildung 1A zeigt eine schematische Zeichnung des Ortes, während Abbildung 1B den Blick in den Thorax nach Entfernung des Herz-Lungen-Pakets darstellt. Der linke und rechte Longus-Colli-Muskel medial vom SG und der Brustkorb sind wichtige Orientierungspunkte. Die Dissektion erfolgt entlang der gepunkteten Linien zwischen den Muskeln und der ersten Rippe. Das SG un...

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Diskussion

Das Verständnis zellulärer und molekularer Prozesse in Neuronen und Gliazellen des sympathischen Nervensystems, die dem Ausbruch der VA vorausgehen, ist von großem Interesse, da plötzlicher Herzstillstand weltweit die häufigste Todesursache bleibt5. Daher stellen wir im aktuellen Manuskript ein grundlegendes Repertoire an Methoden zur Verfügung, um das murine SG – ein murines Element innerhalb dieses Netzwerks – zu identifizieren und anschließend Analysen auf RNA-, Protein- und zellulärer Ebene du...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Hartwig Wieboldt für die hervorragende technische Unterstützung und der UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf für die Bereitstellung von Mikroskopen und Unterstützung. Diese Forschung wurde vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung) [FKZ 81Z4710141] gefördert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-PlatteTPP92097RNAscope
Adhäsionsobjektträger SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Mikroskopie
Albumin Rinderfraktion V-Rezeptor Lyophil.Serva11924.03Ganzfassungsfärbung
BisBenzimid H33342 Trihydrochlorid (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Ganzfassung Färbung
Huhn Anti-NeurofilamentEMD MilliporeAB5539Ganzfassung Färbung
Dimethylsulfoxid (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, DeutschlandD8418Ganzfassung Färbung
Esel Anti Huhn IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, DeutschlandAP194SA6Ganzes Reittier Färbung Esel
Anti Ziege IgG Alexa 568 Thermo FisherScientific A11057Ganze Halterung Färbung Esel
Anti Kaninchen IgG Alexa 488 Thermo FisherScientific A21206Whole Mount Färbeblock
37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992 Färben des gesamten Passepartouts
Eosin YSigma AldrichE4009Einbettfärbung
Ethanol 99 % vergällt mit MEK, IPA und Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Einbettfärbung
Eukitt EindeckmediumAppliChem253681.0008Einbettfärbung
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Einbettfärbung
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Whole Mount Färbung
Ziege Anti-Cholin AcetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole Mount Färbung
H2O2 30% (w/w)Merck, KGA, Darmstadt, DeutschlandH1009Whole Mount Färbung
Heparin Sodium 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN: 3862340Vorbereitung SG
cDNA-Reverse-Transktiption-Kit mit hoher KapazitätLife-Technologien 4368813RNA-Isolierung
Isofluran (Foren)Abbott Laboratories2594.00.00Präparation
Mayer's Hämalum LösungMerck1.09249.0500Whole Mount Färbung
MethanolSigma-Aldrich34860Whole Mount Färbung
Mikroskop Deckglas 20x20 mm oder kleinerMarienfeld0101040Whole Mount Färbung
miRNeasy Mini KitQiagen217004 RNA-Isolierung
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000C RNA-Isolierung
Opal 570 ReagenzienpaketAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldehyd, 16% w/v aq. soln., methanolfreiAlfa Aesar43368Ganzfassungsfärbung
Pasteurpipetten, LDPE, unsteril, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Ganzbettfärbung
Phosphatgepufferte KochsalztablettenGibco18912-014Ganzbettfärbung
Pinzette Dumont SS PinzetteFineScienceTools11203-25Vorbereitung SG
QIAzol LysereagenzQiagen 79306RNA-Isolierung
Kaninchen-Anti-Tyrosin-HydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole Mount Färbe-RNAlater
MerckR0901-100MLRNA-Isolierung (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Sonde-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Edelstahlperlen 7 mm Qiagen 69990RNA-Isolierung
Sudan schwarz BRoth0292.2Ganzbandfärbung
TaqMan Genexpressionsassay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Genexpressionsanalyse
TaqMan Genexpressionsassay Cholinacetyltransferase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Genexpressionsanalyse
TaqMan Genexpressionsassay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Genexpressionsanalyse
TaqMan Genexpressionsassay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Genexpressionsanalyse
TaqMan Genexpressionsassay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Genexpressionsanalyse
TaqMan Genexpressionsassay Tyrosinhydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Genexpressionsanalyse
TaqMan MastermixAngewandte Biosysteme4370074Genexpressionsanalyse 
Tissue Lyser IIQiagen85300RNA-Isolierung
Triton X-100 10% LösungSigma-Aldrich93443-100mlWhole Mount Färbung
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Wacom BambusstiftWacomCTL-460/KZellgrößenmessungen
Whatman vorgefaltetes qualitatives Filterpapier, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Whole Mount Färbung
Weizenkeim-Agglutinin, Alexa Fluor 633 KonjugatThermo Fisher ScientificW21404RNAscope
SG

Referenzen

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