Pathophysiologische Veränderungen im kardialen autonomen Nervensystem, insbesondere in seinem sympathischen Zweig, tragen zum Auftreten und zur Aufrechterhaltung ventrikulärer Arrhythmien bei. Im vorliegenden Protokoll zeigen wir, wie murine Stellatganglien charakterisiert werden können, um das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen und zellulären Prozesse zu verbessern.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Lage, Dissektion und Analyse des Murin-Stellat-Ganglions
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das vegetative Nervensystem ist ein wesentlicher Treiber der kardialen Elektrophysiologie. Insbesondere die Rolle seines sympathischen Zweiges ist eine laufende Untersuchungsfrage in der Pathophysiologie ventrikulärer Arrhythmien (VA). Neuronen in den Sternganglien (SG) – bilaterale sternförmige Strukturen der sympathischen Kette – sind ein wichtiger Bestandteil der sympathischen Infrastruktur. Die SG sind ein anerkanntes Ziel für die Behandlung über kardiale sympathische Denervierung bei Patienten mit therapierefraktärer VA. Während neuronaler Umbau und Gliaaktivierung im SG bei Patienten mit VA beschrieben wurden, sind die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Prozesse, die möglicherweise dem Auftreten von Arrhythmien vorausgehen, nur unzureichend verstanden und sollten zur Verbesserung der autonomen Modulation aufgeklärt werden. Mausmodelle ermöglichen es uns, sympathische neuronale Umbauten zu untersuchen, aber die Identifizierung des murinen SG ist für den unerfahrenen Forscher eine Herausforderung. So fehlen für viele häufige Herzerkrankungen vertiefte zelluläre und molekularbiologische Untersuchungen des murinen SG. Hier beschreiben wir ein grundlegendes Repertoire zur Sezierung und Untersuchung des SG bei erwachsenen Mäusen für Analysen auf RNA-Ebene (RNA-Isolierung für Genexpressionsanalysen, In-situ-Hybridisierung), Proteinebene (immunfluoreszierende Ganzkomountfärbung) und zelluläre Ebene (Basismorphologie, Zellgrößenmessung). Wir stellen mögliche Lösungen vor, um Herausforderungen in der Präparationstechnik zu meistern und die Färbung durch Abschrecken der Autofluoreszenz zu verbessern. Dies ermöglicht die Visualisierung von Neuronen sowie Gliazellen über etablierte Marker, um die Zellzusammensetzung und Umbauprozesse zu bestimmen. Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen die Charakterisierung des SG, um weitere Informationen über autonome Dysfunktion bei Mäusen zu gewinnen, die zu VA neigen, und können durch zusätzliche Techniken ergänzt werden, die neuronale und gliale Komponenten des autonomen Nervensystems im Herzen untersuchen.
Einleitung
Das kardiale autonome Nervensystem ist ein streng reguliertes Gleichgewicht von sympathischen, parasympathischen und sensorischen Komponenten, das es dem Herzen ermöglicht, sich an Umweltveränderungen mit der entsprechenden physiologischen Reaktion anzupassen1,2. Störungen in diesem Gleichgewicht, zum Beispiel eine Zunahme der sympathischen Aktivität, wurden als Schlüsselfaktor für den Beginn sowie die Aufrechterhaltung von ventrikulären Arrhythmien (VA)3,4festgestellt. Daher ist die autonome Modulation, die durch pharmakologische Reduktion der sympath....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Animal Care and Use Committee des Landes Hamburg (ORG870, 959) und dem Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (LANUV, 07/11) genehmigt und entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der Nationalen Gesundheitsinstitute (2011). Die Studien wurden mit männlichen und weiblichen (im Alter von 10-24 Wochen) C57BL/6-Mäusen (Stocknummer 000664, Jackson Laboratories) und Mäusen homozygot (db/db) oder heterozygot (db/het; Kontrolle) für die Diabetes-Spontanmutation (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, Lagernummer 000642, Jackson Laboratories). Die Autoren h....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt, wie das SG identifiziert und seziert werden kann. Abbildung 1A zeigt eine schematische Zeichnung des Ortes, während Abbildung 1B den Blick in den Thorax nach Entfernung des Herz-Lungen-Pakets darstellt. Der linke und rechte Longus-Colli-Muskel medial vom SG und der Brustkorb sind wichtige Orientierungspunkte. Die Dissektion erfolgt entlang der gepunkteten Linien zwischen den Muskeln und der ersten Rippe. Das SG un.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Das Verständnis zellulärer und molekularer Prozesse in Neuronen und Gliazellen des sympathischen Nervensystems, die dem Ausbruch der VA vorausgehen, ist von großem Interesse, da plötzlicher Herzstillstand weltweit die häufigste Todesursache bleibt5. Daher stellen wir im aktuellen Manuskript ein grundlegendes Repertoire an Methoden zur Verfügung, um das murine SG – ein murines Element innerhalb dieses Netzwerks – zu identifizieren und anschließend Analysen auf RNA-, Protein- und zellulärer Ebene du.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Die Autoren danken Hartwig Wieboldt für die hervorragende technische Unterstützung und der UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf für die Bereitstellung von Mikroskopen und Unterstützung. Diese Forschung wurde vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung) [FKZ 81Z4710141] gefördert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96-Well-Platte | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhäsionsobjektträger SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Mikroskopie |
| Albumin Rinderfraktion V-Rezeptor Lyophil. | Serva | 11924.03 | Ganzfassungsfärbung |
| BisBenzimid H33342 Trihydrochlorid (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Ganzfassung Färbung |
| Huhn Anti-Neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Ganzfassung Färbung |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Deutschland | D8418 | Ganzfassung Färbung |
| Esel Anti Huhn IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Deutschland | AP194SA6 | Ganzes Reittier Färbung Esel |
| Anti Ziege IgG Alexa 568 | Thermo Fisher | Scientific A11057 | Ganze Halterung Färbung Esel |
| Anti Kaninchen IgG Alexa 488 | Thermo Fisher | Scientific A21206 | Whole Mount Färbeblock |
| 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Färben des gesamten Passepartouts |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Einbettfärbung |
| Ethanol 99 % vergällt mit MEK, IPA und Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Einbettfärbung |
| Eukitt Eindeckmedium | AppliChem | 253681.0008 | Einbettfärbung |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Einbettfärbung |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole Mount Färbung |
| Ziege Anti-Cholin Acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole Mount Färbung |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Deutschland | H1009 | Whole Mount Färbung |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Vorbereitung SG |
| cDNA-Reverse-Transktiption-Kit mit hoher Kapazität | Life-Technologien | 4368813 | RNA-Isolierung |
| Isofluran (Foren) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Präparation |
| Mayer's Hämalum Lösung | Merck | 1.09249.0500 | Whole Mount Färbung |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole Mount Färbung |
| Mikroskop Deckglas 20x20 mm oder kleiner | Marienfeld | 0101040 | Whole Mount Färbung |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 RNA-Isolierung | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C RNA-Isolierung | |
| Opal 570 Reagenzienpaket | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyd, 16% w/v aq. soln., methanolfrei | Alfa Aesar | 43368 | Ganzfassungsfärbung |
| Pasteurpipetten, LDPE, unsteril, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Ganzbettfärbung |
| Phosphatgepufferte Kochsalztabletten | Gibco | 18912-014 | Ganzbettfärbung |
| Pinzette Dumont SS Pinzette | FineScienceTools | 11203-25 | Vorbereitung SG |
| QIAzol Lysereagenz | Qiagen | 79306 | RNA-Isolierung |
| Kaninchen-Anti-Tyrosin-Hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole Mount Färbe-RNAlater |
| Merck | R0901-100ML | RNA-Isolierung (optional) | |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Sonde-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Edelstahlperlen 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA-Isolierung |
| Sudan schwarz B | Roth | 0292.2 | Ganzbandfärbung |
| TaqMan Genexpressionsassay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Genexpressionsanalyse |
| TaqMan Genexpressionsassay Cholinacetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Genexpressionsanalyse |
| TaqMan Genexpressionsassay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Genexpressionsanalyse |
| TaqMan Genexpressionsassay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Genexpressionsanalyse |
| TaqMan Genexpressionsassay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Genexpressionsanalyse |
| TaqMan Genexpressionsassay Tyrosinhydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Genexpressionsanalyse |
| TaqMan Mastermix | Angewandte Biosysteme | 4370074 | Genexpressionsanalyse |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA-Isolierung |
| Triton X-100 10% Lösung | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole Mount Färbung |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom Bambusstift | Wacom | CTL-460/K | Zellgrößenmessungen |
| Whatman vorgefaltetes qualitatives Filterpapier, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole Mount Färbung |
| Weizenkeim-Agglutinin, Alexa Fluor 633 Konjugat | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
Referenzen
- Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
- Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Jo....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
