Summary
Patofysiologiska förändringar i hjärt autonoma nervsystemet, särskilt i dess sympatiska gren, bidrar till uppkomsten och underhållet av Ventrikulärt arytmier. I det nuvarande protokollet visar vi hur man karakteriserar murin stellate ganglier för att förbättra förståelsen av de underliggande molekylära och cellulära processerna.
Abstract
Det autonoma nervsystemet är en betydande drivkraft för hjärtelektrofysiologi. Särskilt rollen för dess sympatiska gren är en pågående fråga om undersökning i patofysiologi av Ventrikulärt arytmier (VA). Nervceller i stellate ganglierna (SG) – bilaterala stjärnformade strukturer i den sympatiska kedjan – ären viktig del av den sympatiska infrastrukturen. SG är ett erkänt mål för behandling via hjärt sympatisk denervation hos patienter med terapi-eldfast VA. Medan neuronal ombyggnad och stödjeceller aktivering i SG har beskrivits hos patienter med VA, är de underliggande cellulära och molekylära processer som potentiellt föregår uppkomsten av arytmi endast otillräckligt förstådda och bör klargöras för att förbättra autonoma modulering. Musmodeller gör det möjligt för oss att studera sympatisk neuronal ombyggnad, men identifiering av murin SG är utmanande för den oerfarna prövaren. Således saknas djupgående cellulära och molekylärbiologiska studier av murin SG för många vanliga hjärtsjukdomar. Här beskriver vi en grundläggande repertoar för dissekering och studier av SG hos vuxna möss för analyser på RNA-nivå (RNA-isolering för genuttrycksanalyser, in situ-hybridisering), proteinnivå (immunofluorescerande helmonteringsfärgning) och cellnivå (grundläggande morfologi, cellstorleksmätning). Vi presenterar potentiella lösningar för att övervinna utmaningar inom beredningstekniken och hur man kan förbättra färgning genom släckning av autofluorescens. Detta möjliggör visualisering av nervceller samt gliaceller via etablerade markörer för att bestämma cellsammansättning och ombyggnadsprocesser. De metoder som presenteras här gör det möjligt att karakterisera SG för att få ytterligare information om autonom dysfunktion hos möss som är benägna att VA och kan kompletteras med ytterligare tekniker som undersöker neuronala och gliakomponenter i det autonoma nervsystemet i hjärtat.
Introduction
Hjärtaunomiska nervsystemet är en tätt reglerad jämvikt av sympatiska, parasympatiska och sensoriska komponenter som gör det möjligt för hjärtat att anpassa sig till miljöförändringar med lämpligt fysiologisktsvar 1,2. Störningar i denna jämvikt, till exempel en ökning av sympatisk aktivitet, har fastställts som en viktig drivkraft för inälva samt underhåll av ventrikulära arytmier (VA)3,4. Därför har autonom modulering, som uppnås genom farmakologisk minskning av sympatisk aktivitet med betablockerare, varit en hörnsten i behandlingen av patienter med VA iårtionden 5,6. Men trots farmakologiska och kateterbaserade ingrepp lider fortfarande ett relevant antal patienter av återkommande VA7.
Sympatisk input till hjärtat förmedlas mestadels via neuronala cellkroppar i stellate ganglierna (SG), bilaterala stjärnformade strukturer i den sympatiska kedjan, som vidarebefordrar information via många intrathoracic nerver från hjärnstammen till hjärtat8,9,10. Nerv som spirar från SG efter skada är förknippad med VA och plötslighjärtdöd 11,12, betonar SG som ett mål för autonom modulering13,14. En minskning av sympatiska ingång till hjärtat kan uppnås tillfälligt via perkutan injektion av lokala bedövningsmedel eller permanent genom partiell borttagning av SG via videoassisterad thorakoscopy15,16. Hjärt sympatisk denervation presenterar ett alternativ för patienter med terapi-eldfast VA med lovande resultat14,16,17. Vi har lärt oss av explanted SG av dessa patienter att neuronal och neurokemisk ombyggnad, neuro-inflammation och stödjeceller aktivering är kännetecken för sympatisk ombyggnad som kan bidra eller förvärra autonoma dysfunktion18,19. Fortfarande förblir de underliggande cellulära och molekylära processerna i dessa nervceller dunkla hittills, till exempel rollen av neuronal transdifferentiering i en kolinergfenotyp 20,21. Experimentella studier presenterar nya metoder för att behandla VA, till exempel minskningen av sympatisk nervaktivitet via optogenetik22, men djupgående karakterisering av SG saknas fortfarande i många hjärtpatologier som går i hand med VA. Musmodeller som efterliknar dessa patologier gör det möjligt att studera neuronal ombyggnad som potentiellt föregår uppkomsten av arytmier12,23. Dessa kan kompletteras genom ytterligare morfologiska och funktionella analyser för autonom karakterisering av hjärtat och nervsystemet. I det nuvarande protokollet tillhandahåller vi en grundläggande repertoar av metoder som gör det möjligt att dissekera och karakterisera murin SG för att förbättra förståelsen för VA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök som involverar djur godkändes av Djurvårds- och användningskommittén i delstaten Hamburg (ORG870, 959) och Nordrhein-Westfalens statliga myndighet för natur, miljö och konsumentskydd (LANUV, 07/11) och överensstämmer med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011). Studier utfördes med manliga och kvinnliga (i åldern 10-24 veckor) C57BL/6 möss (lagernummer 000664, Jackson Laboratories) och möss homozygous (db/db) eller heterozygous (db/het; kontroll) för diabetes spontan mutation (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, lagernummer 000642, Jackson Laboratories). Författarna har använt protokollen till hands utan variationer för möss i åldern upp till 60 veckor.
1. Plats och dissekering av murin stellate ganglier
OBS: Även om beskrivningar och ritningar mestadels finns tillgängliga i större arter, har vissa publikationer tidigare beskrivit platsen för SG hos råttor24 och möss25 med hjälp av anatomiska metoder respektive fluorescerande reporterlinjer.
- Förbered 50 ml iskall (3-4 °C) hepariniserad (20 enheter/ml, se materialförteckning)fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Utför dissekering av SG vid rumstemperatur (RT).
- Söv musen djupt genom inandning av 3-5% isofluran enligt de institutionella och lokala riktlinjerna. Kontrollera adekvat anestesi genom förlust av pedaluttagsreflex. Halshugg möss eller utför livmoderhalsförskjutning.
OBS: Felaktig förskjutning av livmoderhalsen kan leda till brott i ryggraden och skador på bröstkärl som leder till blödning som hindrar preparatet eller avskiljningen av den sympatiska kedjan, så att SG inte är i rätt position. Därför är det viktigt att erfaren personal utför livmoderhalsförskjutning eller halshugger djur i djup sedering. - Spraya huden med etanol och öppna bröstkorgen med två snitt längs de främre axillärlinjerna med Mayosax och smala mönstertångar. Skär membranet och ta bort bröstkorgens framsida.
- Ta bort hjärt-lungförpackningen genom att greppa aortan och vena cava precis ovanför membranet med London tång och skära alla kärl och bindväv nära ryggraden nedan med Strabismus sax.
- Spola bröstkorgen noggrant med hepariniserad PBS med en engångspipett i plast tills alla spår av blod avlägsnas.
- Placera bålen under stereomikroskopberedningskärl och se till att bröstkorgen är bra med externa ljuskällor.
- Hitta det första revbenet och longus colli-musklerna.
OBS: SG är placerade bilateralt, parallellt med ryggraden vid grenen mellan det första revbenet och ryggraden, i ett spår lateralt till longus collimusklerna 24. SG: s platta sida ligger intill longus colli-musklerna. Beroende på preparatet kan delar av den sympatiska kedjan redan vara synliga som vita, sneda fibrer parallellt med ryggraden. Dessa kan spåras längs med SG. - Använd försiktigt spetsen på Dumont #5/45 tång för att exponera bindväven i sidled för longus colli-muskeln.
- Vrid tången med 180° och använd den plana sidan för att greppa SG och dra ut den med minimalt tryck.
- Upprepa med den andra SG.
- Placera både SG i en skål (6 cm diameter) fylld med kall PBS och inspektera med lämplig förstoring. Om det behövs, ta bort överflödiga kärl, fettvävnad och större nerver.
OBS: Autonoma ganglier är omgivna av en bindväv kapsel bestående av kollagenfibrer och fibroblaster26,27. Permeabiliteten hos dessa kapslar verkar variera mellan arter, olika typer av ganglier26 och ålder28. Ta bort så mycket bindväv som möjligt med Dumont #5/45 tång och vid behov fjädersax. - Beroende på experimentets mål fortsätter du med avsnitt 2, 3 eller 5 i det här protokollet.
2. Hela mount immunohistokemi protokoll
OBS: Detta protokoll är anpassat från hjärt hela mount färgningar4,29. Utför inkubationssteg för varje enskild SG i en brunn på en 96-brunnsplatta och använd 100 μL (för antikroppshaltiga lösningar) till 200 μL (för alla andra lösningar) av lösningen för att säkerställa fullständig täckning. Kontrollera regelbundet täckningen och korrigera nedsänkningen av SG med kikare. Ta bort vätskor manuellt med en 200 μL-pipett med ytterligare 10 μL spets ovanpå 200 μL-spetsen. Detta förhindrar att SG:en aspiration i pipettspetsen. Använd nyberedda lösningar och sterila vätskor för att förhindra bakterietillväxt.
- Fixa SG för histologi i 2 h på RT i 4% metanolfri paraformaldehyd (PFA)/PBS.
- Bearbeta SG så snabbt som möjligt, men de kan lagras i 2-4 veckor vid 4-6 °C i PBS med 0,02% (w/v) natriumazid vid denna tidpunkt.
- Förbered Sudan svart lagerlösning (1% Sudan svart w/ v i 100% etanol) för minskning av autofluorescens och förbättring av signal till bakgrundsförhållande30. Lös upp i 2-3 timmar på en magnetomrörare på RT.
OBS: Använd stamlösningen i högst 6-8 veckor, kassera tidigare när sedimentering uppträder. - Förbered Sudans svarta arbetslösning genom att centrifugera stamlösningen i 30 minuter med full hastighet (13 000 x g) för att avlägsna skräp och späda ut beståndet i 70% etanol till en slutlig koncentration på 0,25% Sudan svart.
- Behandla SG med Dents blekmedel för att förbättra antikroppspermeabilisering31. Förbered dentens blekmedel genom att blanda metanol (MeOH), väteperoxidlösning 30% (w/w) i H2O och dimetylsulfoxid (DMSO) i ett förhållande av 4:1:1. Tillsätt 200 μL per SG och placera plattan på en orbital shaker i 1 timme vid RT.
- Utför en fallande MeOH-serie för rehydrering genom att inkubera i 10 minuter vardera på en orbital shaker: 100% MeOH, 75% MeOH / PBS, 50% MeOH / PBS, 25% MeOH / PBS.
- Utför permeabilisering genom att inkubera SG två gånger i 60 min vardera i PBS/1% Triton-X-100 på RT.
- Ta bort permeabiliseringslösningen från SG och lägg till Sudan svart arbetslösning. Inkubera i 2 h på RT på en orbital shaker.
- Under tiden bered en blockerande lösning genom att tillsätta 5% receptorkvalitet bovint serumalbumin (BSA) och 0,1% Triton-X-100 i PBS ett 15 ml kärl och låt det lösas upp på en rullskakapparat i cirka 5-10 min. Dekanteras genom ett förkat pappersfilter för att ta bort skräp.
- Ta bort Sudan svart mycket försiktigt genom att luta plattan och försiktigt pipetting från den upprättstående sidan.
OBS: Det är inte möjligt att se SG i Sudan svart. Använd en stark ljuskälla och arbeta långsamt. Från detta steg är SG färgade svarta, vilket förbättrar synligheten. Om någon extra bindväv ses som omger SG vid denna tidpunkt, ta bort den med Dumont #5/45 tång och fjädersax. - Tillsätt 200 μL PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) och tvätta i 5 minuter på RT på en orbital shaker.
- Ta bort PBS-T genom att aspirera på den med en pipett och upprepa 2 gånger.
- Ta bort PBS; tillsätt 200 μL blockeringslösning och inkubera vid 4 °C över natten på en orbital shaker.
- Nästa dag, förbered lösningar genom att lägga till primära antikroppar i blockeringslösningen. Anpassa antikroppskoncentrationerna från etablerade protokoll.
OBS: Inkludera en SG som antikroppskontroll utan primär antikropp (inkuberad med antigenpreabsorberad antikropp eller IgG, om sådan finns, eller blockeringsbuffert). - Utför primär antikroppsinkubation i 36-48 timmar vid 4 °C på en orbital shaker. För cellstorleksmätningar och färgning av sympatiska nervceller, använd antikroppar mot tyrosinhydroxilas (se Materialförteckning för antikroppsrekommendationer).
OBS: Placera 96-brunnsplattan i en våt kammare (t.ex. plastlåda fodrad med ddH2O-våta pappershanddukar) för att förhindra avdunstning vid denna punkt. - Ta försiktigt bort antikroppslösningen och tillsätt 200 μL PBS-T. Placera plattan på en orbital shaker i 30 min.
- Ta bort PBS-T och upprepa tvättsteget ytterligare 5 gånger.
- Förbered den sekundära antikroppsarbetslösningen genom att centrifugera fluorescerande Alexa-märkta sekundära antikroppar i 1 min med full hastighet (13 000 x g)före användning. Späd ut lämpliga sekundära antikroppar enligt de primära antikropparna 1:500 i blockeringslösningen och tillsätt till SG. Tillsätt 1 μg/ml bisbenzimid H33342 trikydroklorid (Hoechst-färgning) om nukleär färgning önskas. Inkubera i 12-24 timmar vid 4 °C på en orbital shaker.
- Ta försiktigt bort antikroppslösningen och tillsätt 200 μL PBS-T. Placera plattan på en orbital shaker i 30 min.
- Ta bort PBS-T och upprepa tvättsteget ytterligare 5 gånger. För det sista steget, använd PBS utan Triton.
- För inbäddning, sprid 50-100 μL fluorescerande monteringsmedium (se Materialförteckning)på en glasrutschbana och placera under beredningskärl. Använd Dumont #5/45 tång för att plocka upp SG från 96-brunnsplattan och ta bort överflödig vätska genom att doppa ena änden på ett filterpapper (t.ex. Whatman torkplatta) och placera den på droppen.
- Använd Dumont #5/45 tång för att korrigera positionering med lämplig förstoring.
- Placera försiktigt ett glaslock (20 mm x 20 mm) bredvid SG och gå långsamt ner.
OBS: Om du använder för mycket monteringsmedium kommer SG att föras i rörelse eller nervkittlande. Om det händer, ta snabbt bort täckglaset och upprepa steg 2.9-2.21. - Låt rutschkanorna torka i mörkret över natten vid RT. Förvaring av det färgade provet är möjligt i minst 4-6 veckor vid 4 °C.
3. Hel montering in situ hybridisering
OBS: Helmontering i situ-hybridisering av SG är anpassad från organet i corti32 och det kommersiella RNA fluorescens in situ-protokollet (se Materialförteckning). Få sonder för gener av intresse och buffertar och lösningar från leverantören. Alla inkubationssteg utförs på RT, om inte annat anges. Använd steril PBS. Om du är intresserad av att färga flera SG i en brunn, använd minst 150 μL buffertar och lösningar.
- Utför dissekering av SG enligt beskrivningen i steg 1.1-1.13.
- Fixera SG i 1 h i 200 μL på 4% MeOH-fri PFA/PBS i en brunn av en 96-brunnsplatta placerad på en orbital shaker.
- Tvätta SG tre gånger i 30 min vardera i 0,1% interpolering-20/PBS på en orbital shaker.
- Dehydrera SG i MeOH/PBS-serien genom efterföljande inkubation i 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS och 100% MeOH i 10 min vardera på en orbital shaker.
- Förvara SG vid -20 °C i 100% MeOH över natten.
- Nästa dag, förvärm inkubatorn till 40 °C. Kontrollera temperaturen med en termometer.
- Rehydrera SG i omvänd MeOH/PBS-serie (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) i 10 min vardera.
- Tvätta SG tre gånger i 5 minuter vardera i PBS.
- Under tiden, börja förvärma sonderna genom inkubation vid 40 °C i 10 min, följt av kylning i 10 min.
- Inkubera SG i 200 μL Protease III i 15 min.
- Valfritt: Utför sudanesisk svart behandling för att släcka autofluorescens enligt avsnitten 2.3, 2.4 och 2.8 i detta protokoll om efterföljande immunofluorescensfärgning planeras.
- Tvätta SG i 200 μL på 0,1% interpolering-20/PBS 3x i 5 min vardera på en orbital shaker.
- Tillval: Om kofärgning med flera sonder önskas, späd Kanal-2 (50x) och Channel-3-sond (50x) i Channel-1-sond (1x).
- Täck SG med 100 μL sond för genen av intresse och inkubera över natten vid 40 °C med liten agitation. Placera 96-brunnsplattan i en våt kammare vid 40 °C för alla inkubationssteg.
OBS: Inkludera en SG som negativ kontroll, med hjälp av en sond mot en bakteriegen (t.ex. dihydro-dipicolinate reduktas, Dapb) för att kontrollera om det finns icke-specifik bindning av amplifieringsreagenser i senare steg. - Tvätta SG i medföljande tvättbuffert 3x i 15 min vardera på en orbital shaker.
- Förvärmd Amp1-3, HRP-C1 och HRP-Blocker till RT. Om du vill ha samfärgning med Channel-2- och/eller Channel-2-sonden, förvärmd HRP-C2 och HRP-C3.
- Fixera SG igen i 10 minuter på RT i 4% PFA/PBS på en orbital shaker.
- Tvätta SG i 200 μL medföljande tvättbuffert 3x i 5 minuter vardera på en orbital shaker vid RT.
- För förstärkning, inkubera SG med 100 μL Amp1 i 35 min vid 40 °C på en orbital shaker.
- Ta försiktigt bort eventuell vätska och tvätta SG i 200 μL medföljande tvättbuffert 3x i 5 minuter vardera vid RT på en orbital shaker.
- Inkubera SG med 100 μL Amp2 i 35 min vid 40 °C på en orbital shaker.
- Upprepa steg 3.18.
- Inkubera SG med 100 μL Amp3 i 20 min vid 40 °C på en orbital shaker.
- Upprepa steg 3.18.
- Inkubera SG med 100 μL medföljer Multiplex FL v2 HRP-C1 i 20 min vid 40 °C på en orbital shaker.
- Upprepa steg 3.18.
- Förbered Opal-konjugerad sekundär antikropp 1:1,000 i 200 μL levererad TSA-buffert och inkubera SG i 35 min vid 40 °C på en orbital shaker. Skydda mot ljus vid inkubation och från detta steg på.
- Upprepa steg 3.18.
- Inkubera SG i 100 μL medföljande Multiplex FL v2 HRP-blockerare i 15 min vid 40 °C på en orbital shaker.
- Upprepa steg 3.18.
- Tillval: Upprepa steg 3.25-3.30 med medföljande Multiplex FL v2 HRP-C2 för samfärgning med Channel-2-sond.
- Tillval: Upprepa steg 3.25-3.30 med medföljande Multiplex FL v2 HRP-C3 för samfärgning med Channel-3-sond.
- Vid efterföljande immunofluorescerande färgning, utför steg 2.13-2.25 i detta protokoll.
- Inkubera i 1% BSA/PBS i 30 min på en orbital shaker.
- Inkubera SG i 30 min i 1 μg/ml bisbenzimid H33342 tyldroklorid (Hoechst-färgning) i 1% BSA/PBS om kärnfärgning önskas och/eller tillsätt Alexa-kopplade veteglutinin (WGA, 1:500) på en orbital shaker.
- Upprepa steg 3.18.
- Bädda in enligt beskrivningen i steg 2.19-2.22.
4. Bildbehandling och analyser av murin stellate ganglier
- Utför konfokal mikroskopi av inbäddad SG i den lokala bildanläggningen.
- Om cellstorleksmätningar krävs, bild SG färgas för tyrosinhydroxilas (se Materialförteckning)vid 200x förstoring och ta 4-6 slumpmässiga bilder från varje SG.
- Analysera bilder med ImageJ33-programvara för att uppskatta cellstorleken (t.ex. med en penntabell, se Materialförteckning). Använd fri handmarkering, cirkla varje cell och klicka på Analysera | Mät för att erhålla cellområde. Var noga med att endast inkludera intakta, fullt synliga celler som ligger väl inom SG.
- Använd den här metoden för att mäta cirka 100 celler per SG.
- Se till att en blind utredare utför steg 4.2-4.3 om du vill jämföra SG från olika möss. Använd en frekvensfördelning i statistisk programvara för att visualisera storleksskillnader mellan grupper34.
5. Molekylära analyser av murin stellate ganglier
Inkludera kontroller beroende på din experimentella design. Detta kan vara SG med olika genotyper och sjukdom bakgrund och/eller andra autonoma ganglier, såsom sympatisk överlägsen massundersökning ganglion (ligger i halsområdet, se detaljerad beskrivning i Ziegler et al.35) eller parasympatiska ganglier (såsom intracardiac ganglier, se Jungen et al.4).
- Bered ett 2 ml-rör med 500 μL fenol/guanidin tiocyanatlösning (t.ex. Qiazol) per djur och ha flytande kväve redo för stötdämpare eller överväga kommersiella lösningar för skydd av RNA (valfritt, se Materialförteckning)36. Arbeta snabbt för RNA-isolering.
- Utför dissekering av SG enligt beskrivningen i steg 1.1-1.13.
- Sänk omedelbart ner både SG direkt i ett rör med fenol/guanidin tiocyanatlösning och stötfroströr i flytande kväve.
- Förvara vid -80 °C tills vidare bearbetning.
- För vävnadslys, låt rör med SG tina tills fenol/ guanidin tiocyanatlösning är liquified och tillsätt två 7 mm rostfritt stål pärlor. Kyl ner metalldelarna i vävnadshom homogenisatorn (kul- eller blandarkvarn, t.ex.
- Centrifugrör vid 500 x g i 1 min vid 4 °C så att SG är längst ner på röret.
- Sätt rör i metalldelarna på Tissue Lyser och lysa i 1 min vid 20 Hz.
- Upprepa steg 5.6 och 5.7 upp till 5 gånger tills ingen intakt vävnad kan detekterbaras.
- Överför vätskan till ett friskt 1,5 ml-rör.
- Utför RNA-isolering med ett kolumnbaserat RNA-isoleringskit (t.ex. miRNeasy mini kit) enligt tillverkarens instruktioner.
- Elute RNA i 20 μL RNase-fritt vatten och mät koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer.
OBS: För att utesluta förorening av det renade RNA med genomiskt DNA föreslår vi att utföra en polymeraskedjereaktion med genomiska primers och 1 μL RNA som mall, istället minus omvänd transkriptaskontroll. Detta kommer att spara en betydande mängd RNA. Om RNA är kontaminerat, använd exon-introngränsprimrar eller intron flankerande primers för efterföljande kvantitativa polymeraskedjereaktion i realtid. - Använd 250 ng SG RNA för att utföra cDNA-syntes och använda etablerade protokoll. Här användes ett cDNA-backkriberingskit med hög kapacitet enligt tillverkarens instruktioner.
- Späd till en slutlig koncentration på 2,5 ng/μL cDNA och utför kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid med lämpliga sonder enligt de fastställda protokollen. Här utfördes TaqMan Assay (se Table of Materials)med 10 ng cDNA per reaktion.
OBS: Utför ingen mallkontroll för varje gen för att utesluta falska positiva resultat. - Normalisera genuttryck av din gen av intresse på en hushållningsgen (t.ex. Cdkn1b) för att jämföra relativa genuttryck mellan olika grupper av SG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visualiserar hur man identifierar och dissekerar SG. Figur 1A visar en schematisk ritning av platsen, medan figur 1B presenterar vyn i bröstkorgen efter avlägsnandet av hjärt-lungpaketet. Vänster och höger longus colli muskler mediala från SG och revben bur är viktiga landmärken för orientering. Dissekering utförs längs de prickade linjerna mellan musklerna och det första revbenet. SG och den sympatiska kedjan blir synliga som vita strukturer (Figur 1C). Figur 1D visar en förstoring av regionen mellan den vänstra longus colli muskeln och det första revbenet, där den vänstra SG ligger. SG: s morfologi skiljer sig mellan individer. Det består ofta av en fusion av den sämre livmoderhalsen och den första till den tredje bröstganglierna 24. Någon sort som experimenteraren kan förvänta sig i murin SG avbildas i figur 1E, F, där vänster och höger SG av fem manliga C57Bl6 vilda möss fotograferas.
Utvärdering av brutto anatomisk översikt, liksom cellulära och subcellulära analyser av celler i SG innervating hjärtat kan utföras av hela montering tekniker på protein och RNA nivå. En översikt över en allmängittrare presenteras i figur 2. Myokardiska sympatiska fibrer härstammar från cellkroppar i SG. Dessa visualiseras genom färgning med en antikropp mot tyrosinhydroxilas (TH). TH-uttrycker neuronal somata är omgiven av nerv fibrer färgning positiva för kolin acetyltransferas (ChAT). Dessa är troligtvis presynaptiska fibrer37,38. En exemplarisk förstoring från sammärkningen av TH och ChAT presenteras i figur 2A. Gliaceller som omger neuronala cellkroppar kan visualiseras genom färgning för S100B. Detta avbildas i figur 2B i kombination med neuralmarkören PGP9.5. Figur 2C-F visar exemplariska analyser för att studera SG på subcellulär nivå, med hjälp av helfäste i situ hybridisering och immunofluorescerande co-staining. Proteinet TH (Figur 2C,röd) och mRNA-molekyler av Tubb3 (Figur 2D, vit) uttrycks i stora neuronala cellkroppar, medan mRNA av S100b (Figur 2E, grön) också kan detekteras i omgivande gliaceller. I sammanslagningen (Figur 2F) är det synligt att vissa nervceller är negativa för TH men uttrycker Tubb3, medan S100b mRNAs också kan detekteras i omgivande celler, som avbildas i förstoringen i figur 2G.
Figur 3 presenterar potentiella kvantitativa analyser och fallgropar för att studera murin SG. Bilder från TH-färgade SG (Figur 3A) kan användas för cellstorleksmätningar som utfördes exemplariskt för en musmodell av diabetes. Neuronal somata från kontroll (db/het) SG var 388,8 ± 123,8 μm2 jämfört med i diabetesSG (db/db) 407,33 ± 139,6 μm2 (Figur 3B, n = 2 SG, 100 celler per SG per genotyp, P = 0, 348, data jämfördes med Mann-Whitney-testet). Figur 3C visar uttrycket av gener från olika celltyper av SG (n = 6-7). Poolning av båda SG från ett djur möjliggör genuttrycksmätningar av cirka 24 analyser (12 gener i dubbletter). Vi normaliserar vanligtvis prover för Cdkn1b (detekteras vid Ct-värden på 25,4 ± 0,97) samt neuronal markör Neun / Rbfox3 (32,5 ± 0,7) om det är nödvändigt att ta hänsyn till andra celltyper och neuronal renhet i dissekeringen. Gener som vi fann användbara för att karakterisera molekylära processer i SG inkluderar den sympatiska genen Th (22.4 ± 1.6), Chat, som kan indikera kolinerg transdifferentiering (uttryckt vid Ct-värden på 30,8 ± 1,3) och Gap43, en markör för neuronal groddning (detekterbar vid Ct-värden på 22,4 ± 1,4). Gener uttryckta i icke-neuronal celltyp inkluderar S100b (för gliaceller, 27,3 ± 1,2), Ki-67 (för prolifererande celler, 33,0 ± 1,6) och Cd45 (för immunceller, 30,2 ± 1,1).
SG är omgiven av en kapsel med bindväv26, visualiserad via hematoxylin och eosinfärgning i figur 3D,E. Ibland observerade vi inkonsekvenser i antikroppsbaserad färgning som visas i figur 3F, troligtvis på grund av ofullständigt avlägsnande av kapseln. Medan ChAT- och TH-färgning endast kan detekteras i vissa delar av SG, kan nuklei som kontrast med DAPI detekteras hela tiden. Den prickade linjen i den sammanfogade bilden separerar lyckad färgning (höger om linjen) från misslyckad färgning (vänster om linjen).
Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Statistisk signifikans definierades som ett P-värde <0,05. statistisk analys utfördes med hjälp av kommersiell programvara.
Bild 1: Plats, dissekering och morfologi för murine stellate ganglier. (A) Schematisk ritning av platsen för stellate ganglier (SG). B)Se in i bröstkorgen efter avlägsnande av hjärt-lungförpackningen. Det är viktigt att notera att SG inte är omedelbart synliga för det mesta. Longus colli musklerna ligger lateralt från ryggraden. SG ligger lateralt från musklerna vid korsningen med det första revbenet. Dissekera försiktigt lateralt till musklerna (område märkt med prickad linje) för att avslöja ganglierna. Efter dissekering kan ganglier (vänster respektive höger, LSG respektive RSG) och den sympatiska kedjan göras ut som vita, långa strukturer. C)En exemplarisk dissekering som visar ganglierna och anatomiska landmärken. D)Förstoring av LSG. (E)LSG och (F) RSG från vild typ, manliga C57Bl6 möss (16 veckor) dissekerades och fotograferades för att visa variationerna i morfologi och storlek. Skalstången representerar 1 000 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Visualisering avolika celltyper i murin stellate ganglier via hela berget immunohistokemi och in situ hybridisering. (A) Grov översikt över en murin stellate ganglion (SG) färgas för den sympatiska markör tyrosinhydroxilas (TH) och kolin acetyltransferas (ChAT). Förstoringen visar TH-positiva cellkroppar och närvaron av ChAT-positiva, troligen presynaptiska, nervfibrer som omger neuronal somata. (B) Gliaceller som omuppvärmer neuronala cellkroppar kan visualiseras genom färgning för S100B, här i kombination med neuronalmarkören PGP9.5. (C,D,E,F) Mikroskopiska bilder från ett SG-färgat helt fäste via en kombination av immunohistokemi för TH (röd) och in situ hybridisering för Tubb3 (D, vit) och S100b (E, grön). Atomkärnor kontras med DAPI (blå). (F) Sammanslagningen visar att inte alla neuronala (Tubb3-positiva) celler är TH-positiva. S100b mRNAs kan detekteras inom neuronal somata, men också omgivande celler, som markeras med en pil i förstoringen i (G). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Potentiella kvantitativa analyser och fallgropar. (A) Bilder från tyrosinhydroxilas (TH)-färgade SG kan användas för cellstorleksmätningar med ImageJ. (B) Detta utfördes i en musmodell av diabetes (100 celler per SG, n = 2 SG per genotyp, data jämfördes med Mann-Whitney test). (C) Exemplariska gener uttryckta i SG som kan vara användbara för karakterisering av molekylära processer. Cdkn1b samt neuronalmarkören Neun/Rbfox3 (för att ta hänsyn till förekomsten av andra celltyper) kan användas för normalisering. Tyrosinhydroxilas (Th) fungerar som en sympatisk markör, kolin acetyltransferas (Chatt) för kolinerg transdifferentiering, Gap43 för neuronal spirande. Gener uttryckta i icke-neuronala celltyper inkluderar S100b (gliaceller), Ki-67 (prolifererande celler) och Cd45 (immunceller). D)Hematoxylin och eosinfärgning av en formalin-fast SG visualiserar bindväv och celler ovanpå SG. (E) Förstoring från det boxade området. (F) Vid vissa tillfällen observerade vi misslyckande vid antikroppsbaserad färgning, troligen på grund av ofullständigt avlägsnande av kapseln. Medan ChAT (röd) och TH (grön) färgning endast kan detekteras i vissa delar av SG, kan nuklei kontrastained med DAPI (mörkblå) detekteras hela tiden. Den prickade linjen i den sammanfogade bilden separerar lyckad färgning (höger om linjen) från misslyckad färgning (vänster om linjen). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förståelsen av cellulära och molekylära processer i nervceller och gliaceller i det sympatiska nervsystemet som föregår uppkomsten av VA är av stort intresse, eftersom plötsligt hjärtstillestånd fortfarande är den vanligaste dödsorsaken i världen5. Därför tillhandahåller vi i det nuvarande manuskriptet en grundläggande repertoar av metoder för att identifiera murin SG – ett murinelement i detta nätverk – och utföra efterföljande analyser på RNA-, protein- och cellnivå.
En utmaning med murin SG är dess storlek och det begränsade antalet celler39. På grund av detta används olika djurmodeller, såsom råttor40,hundar22, och grisar41 för studier på SG. Fortfarande finns det en mängd väletablerade sjukdomsmodeller för hjärt fenotyper tillgängliga hos möss och några av dessa har redan karakteriserats i olika aspekter av hjärt innervation och arytmi, såsom modeller för diabetes23,hjärtinfarkt42, eller hjärtmuskelinflammation43. Därför är ytterligare studier av murine SG motiverade att ytterligare karakterisera autonoma dysfunktion i ljuset av VA. Dessa kan slutföras genom andra metoder för att studera innervation av murinhjärtat såsom funktionella experiment4,23,44 inklusive in vivo-stimulering av SG23.
På grund av sin lilla storlek och dess läge inom brösthålan24är manipulering av murin SG in vivo utmanande, även om den har utförts framgångsrikt23. Av denna anledning fokuserar vissa studier därför på de överlägsna massundersökning ganglierna, som ligger mer accessibly i nacken, uppströms SG i den sympatiska kedjan bakom halsartären bifurcation i inre och yttre halsartärer24,35. Hjärt denervation via avlägsnande av överlägsen massundersökning ganglier har visat sig dämpa skador inflammation, hypertrofi och hjärt dysfunktion efter hjärtinfarkt35. Det är dock viktigt att notera att de överlägsna livmoderhalscancer ganglierna innervate olika regioner i hjärtat, mest framträdande den främre sidan45. Dessutom kom en nyligen djupgående litteraturöversikt till slutsatsen att livmoderhalscancer gangliers roll på sympatisk innervation av hjärtat fortfarande är oklar hos människor46. Detta belyser vikten av att karakterisera SG för studier av hjärt sympatisk innervation.
Det är viktigt att notera att hjärtat inte är det enda målet för SG. Bland annat är lungor47 och svettkörtlar i framfas48 också innervated från fibrer med ursprung i SG, de senare är ett undantag från sympatisk fysiologi som de uttrycker kolin acetyltransferas37. Tillfällig blockad av SG studeras med avseende på inflammatoriska processer vid akut lungskada49 eller för behandling av värmevallningar och sömndysfunktion50; De protokoll som finns till hands kan därför erbjuda en repertoar för mekanistiska frågor på dessa områden. När man fokuserar på hjärtsjukdomsmodeller bör det hållas i åtanke för tolkning av resultat att hjärtneuroner inte kan differentieras genom morfologi eller elektrofysiologiska egenskaper från icke-hjärtneuroner51. Detta kan uppnås genom bakåtsträvande spårning, därmed visade sig platsen för nervceller som projicerar till hjärtat vara belägen i de kranio-mediala delarna av SG52.
Dessutom är det viktigt att notera att förutom olika typer av neuroner består sympatiska ganglier av ensheathing glia, så kallade satellitgliaceller eller satellitceller markerade med uttryck av gliamarkören S100B53. Medan lite är känt om dessa cellers roll i kardiovaskulära patologier, har gliaaktivering och uttryck för det gliaflimmersyraproteinet (GFAP) beskrivits i SG från patienter medarytmier 18.
Vissa fallgropar bör hållas i åtanke med de presenterade metoderna: vi observerade inkonsekvenser i antikroppsbaserad färgning vid vissa tillfällen och antog att ofullständigt avlägsnande av bindvävskapseln som omstöper SG kan vara fel, eftersom de har beskrivits variera i permeabilitet mellan olika typer av ganglier26. Mekaniskt avlägsnande av kapseln med fina tång har beskrivits i överlägsen massundersökning ganglion av råttor upp till postnatal dag 1028 och desheathing nämns i litteraturen för vuxna råtta SG54,55 och möss56. Avlägsnandet av SG-kapseln kan variera mellan28 års ålder och – på grund av storleksskillnader – arter. Enligt vår erfarenhet är färsk dissekering, avlägsnande av så mycket bindväv som möjligt med hjälp av fina tångar och noggrann permeabilisering som beskrivs i protokollet till hands viktiga faktorer för framgångsrik färgning. När det gäller kvantitativ PCR i realtid är snabbt arbete och effektiv lysis avgörande. Sammanslagning av båda SGs från ett djur på ett tillförlitligt sätt tillåtet för analys av upp till 12 olika gener (vid utförande av dubbletter).
Även om SG:s funktion och bruttoanatomi har studerats i årtionden nu och varje kardiomyocyt är innervated av sympatiskafibrer 46, kvarstår många öppna frågor. Till exempel är det fortfarande oklart, varför sympatiska nervceller i SG transdifferentierar tillfälligt till en kolinerg fenotyp iskandinaviska 21 och icke-skandinavisk hjärtsvikt, i djurmodeller samt hos patienter20. Nyligen beskrev vår grupp en roll av S100B-positiva gliaceller, som också finns i murin SG, på nerv som spirar i hjärtnervsystemet29. Huruvida dessa celler är relevanta för sympatisk nervgrodd efter skada i samband med VA11,12, måste klargöras i framtida studier. Viktigt är att innovativa metoder, såsom optogenetik52 och transkriptomanalyser36, kan komplettera etablerade metoder som neuronal spårning för att fördjupa förståelsen för det sympatiska nervsystemet och dess roll på hjärtelektrofysiologi.
Sammanfattningsvis tillåter denna repertoar den oerfarna prövaren att utföra en grundläggande karakterisering av SG i murinmodeller av hjärtpatologier. Vi hoppas att detta kommer att stimulera användningen, kombinationen och skapandet av nya metoder. Detta kan bidra till att öka förståelsen för de underliggande cellulära och molekylära processerna i sympatiska nervceller som kan vara ansvariga för uppkomsten och underhållet av VA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Hartwig Wieboldt för hans utmärkta tekniska hjälp och UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) vid University Medical Center Hamburg-Eppendorf för att tillhandahålla mikroskop och stöd. Denna forskning finansierades av DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
References
- Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
- Jänig, W.
- Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
- Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
- Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
- Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
- Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
- Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
- Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
- Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
- Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
- Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
- Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
- Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
- Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
- Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
- Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
- Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
- Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
- Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
- Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
- Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
- Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I.
- Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
- Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
- Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
- Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
- Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
- Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
- Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
- Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
- Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
- Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
- Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
- Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
- Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
- Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
- Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
- Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
- Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).
