Summary
I cambiamenti fisiopatologici nel sistema nervoso autonomo cardiaco, specialmente nel suo ramo simpatico, contribuiscono all'insorgenza e al mantenimento delle aritmie ventricolari. Nel presente protocollo, mostriamo come caratterizzare i gangli stellati murini per migliorare la comprensione dei processi molecolari e cellulari sottostanti.
Abstract
Il sistema nervoso autonomo è un importante driver dell'elettrofisiologia cardiaca. Soprattutto il ruolo del suo ramo simpatico è una questione di indagine in corso nella fisiopatologia delle aritmie ventricolari (VA). I neuroni nei gangli stellati (SG) - strutture bilaterali a forma di stella della catena simpatica - sono una componente importante dell'infrastruttura simpatica. L'SG è un obiettivo riconosciuto per il trattamento tramite denervazione cardiaca simpatica in pazienti con VA refrattaria-terapia. Mentre il rimodellamento neuronale e l'attivazione gliale nell'SG sono stati descritti nei pazienti con VA, i processi cellulari e molecolari sottostanti che potenzialmente precedono l'insorgenza dell'aritmia non sono solo sufficientemente compresi e devono essere chiariti per migliorare la modulazione autonomica. I modelli di topo ci permettono di studiare il rimodellamento neuronale simpatico, ma l'identificazione dell'SG murino è una sfida per l'investigatore inesperto. Pertanto, mancano studi biologici cellulari e molecolari approfonditi dell'SG murino per molte malattie cardiache comuni. Qui descriviamo un repertorio di base per la dissezione e lo studio dell'SG nei topi adulti per analisi a livello di RNA (isolamento dell'RNA per analisi dell'espressione genica, ibridazione in situ), livello proteico (colorazione immunofluorescente dell'intero supporto) e livello cellulare (morfologia di base, misurazione delle dimensioni delle cellule). Presentiamo potenziali soluzioni per superare le sfide nella tecnica di preparazione e come migliorare la colorazione attraverso la tempra dell'autofluorescenza. Ciò consente la visualizzazione di neuroni e cellule gliali tramite marcatori stabiliti al fine di determinare la composizione cellulare e i processi di rimodellamento. I metodi qui presentati consentono di caratterizzare l'SG per ottenere ulteriori informazioni sulla disfunzione autonoma nei topi inclini all'AV e possono essere integrati da tecniche aggiuntive che studiano i componenti neuronali e gliali del sistema nervoso autonomo nel cuore.
Introduction
Il sistema nervoso autonomo cardiaco è un equilibrio strettamente regolato di componenti simpatici, parasimpatici e sensoriali che consente al cuore di adattarsi ai cambiamenti ambientali con l'appropriata rispostafisiologica 1,2. Disturbi in questo equilibrio, ad esempio, un aumento dell'attività simpatica, sono stati stabiliti come driver chiave per l'insorgenza e il mantenimento delle aritmie ventricolari (VA)3,4. Pertanto, la modulazione autonoma, ottenuta attraverso la riduzione farmacologica dell'attività simpatica con beta-bloccanti, è stata una pietra miliare nel trattamento dei pazienti con VAper decenni 5,6. Ma nonostante gli interventi farmacologici e cateteri, un numero rilevante di pazienti soffre ancora di VA7 ricorrente.
L'input simpatico al cuore è per lo più mediato attraverso corpi cellulari neuronali nei gangli stellati (SG), strutture bilaterali a forma di stella della catena simpatica, che relè le informazioni attraverso numerosi nervi intratoracici dal tronco encefalicoal cuore 8,9,10. Il nervo che germoglia dall'SG dopo la lesione è associato all'AV e alla morte cardiacaimprovvisa 11,12,sottolineando l'SG come bersaglio per la modulazione autonomica13,14. Una riduzione dell'input simpatico al cuore può essere ottenuta temporaneamente tramite iniezione percutanea di anestetici locali o permanentemente mediante rimozione parziale dell'SG tramite toracoscopia video-assistita15,16. La denervazione cardiaca simpatica presenta un'opzione per i pazienti con VA refrattaria terapeuticacon risultati promettenti 14,16,17. Abbiamo imparato dall'SG estipeato di questi pazienti che il rimodellamento neuronale e neurochimico, la neuro-infiammazione e l'attivazione gliale sono segni distintivi del rimodellamento simpatico che potrebbe contribuire o aggravare la disfunzioneautonomica 18,19. Tuttavia, i processi cellulari e molecolari sottostanti in questi neuroni rimangono oscuri fino ad oggi, ad esempio il ruolo della transdifferenziazione neuronale in un fenotipo colinergico20,21. Studi sperimentali presentano nuovi approcci per trattare l'AV, ad esempio la riduzione dell'attività nervosa simpatica attraverso l'optogenetica22, ma la caratterizzazione approfondita dell'SG è ancora carente in molte patologie cardiache che vanno di pari passo con l'AV. I modelli di topo che imitano queste patologie consentono di studiare il rimodellamento neuronale che potenzialmente precede l'insorgenza delle aritmie12,23. Questi possono essere completati da ulteriori analisi morfologiche e funzionali per la caratterizzazione autonomica del cuore e del sistema nervoso. Nel presente protocollo, forniamo un repertorio di base di metodi che consentono di sezionare e caratterizzare l'SG murino per migliorare la comprensione dell'AV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure riguardanti gli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dello Stato di Amburgo (ORG870, 959) e dall'Agenzia statale per la protezione della natura, dell'ambiente e dei consumatori del Nord Reno-Westfalia (LANUV, 07/11) e conformi alla Guida degli Istituti nazionali di sanità per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (2011). Gli studi sono stati eseguiti utilizzando topi maschi e femmine (di età compresa tra 10 e 24 settimane) C57BL/6 (numero di serie 000664, Jackson Laboratories) e topi omozigoti (db/db) o eterozigoti (db/het; controllo) per la mutazione spontanea del diabete (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, numero di stock 000642, Jackson Laboratories). Gli autori hanno utilizzato i protocolli a portata di mano senza variazioni per topi di età fino a 60 settimane.
1. Posizione e dissezione dei gangli stellati murini
NOTA: Anche se descrizioni e disegni sono per lo più disponibili in specie più grandi, alcune pubblicazioni hanno precedentemente descritto la posizione dell'SG neiratti 24 e topi 25 utilizzando rispettivamente metodi anatomici e linee fluorescenti di reporter.
- Preparare 50 mL di ghiaccio-freddo (3-4 °C) eparinato (20 unità/mL, vedi Tabella dei materiali)salina tamponata con fosfato (PBS). Eseguire la dissezione dell'SG a temperatura ambiente (RT).
- Anestetizzare profondamente il topo per inalazione del 3-5% di isoflurane secondo le linee guida istituzionali e locali. Verificare un'anestesia adeguata per perdita del riflesso di prelievo del pedale. Decapitare i topi o eseguire la lussazione cervicale.
NOTA: Una lussazione cervicale errata può causare rottura della colonna vertebrale e danni dei vasi toracici che portano a sanguinamento che ostacola la preparazione o la rottura della catena simpatica, in modo che SG non sia nella loro posizione corretta. Pertanto, è fondamentale che il personale esperto esegua la lussazione cervicale o decapiti gli animali in sedazione profonda. - Spruzzare la pelle con etanolo e aprire il torace con due incisioni lungo le linee ascellari anteriori usando forbici Mayo e forcette a motivi stretti. Tagliare il diaframma e rimuovere la parte anteriore della gabbia toracica.
- Rimuovere il pacchetto cuore-polmone afferrando l'aorta e la vena cava proprio sopra il diaframma usando le forcelle londinesi e tagliando tutti i vasi e il tessuto connettivo vicino alla colonna vertebrale sottostante con le forbici Strabismus.
- Lavare accuratamente il torace con PBS eparinizzato utilizzando una pipetta monouso in plastica fino a quando non vengono rimosse tutte le tracce di sangue.
- Posizionare il busto sotto il binocolo di preparazione stereomicroscopio e garantire una buona illuminazione nel torace con sorgenti luminose esterne.
- Individuare la prima costola e i muscoli longus colli.
NOTA: L'SG si trova bilateralmente, parallelamente alla colonna vertebrale al ramo tra la prima costola e la colonna vertebrale, in una scanalatura laterale ai muscoli lunghi dei colli24. Il lato piatto dell'SG si trova adiacente ai muscoli longus colli. A seconda della preparazione, parti della catena simpatica potrebbero già essere visibili come fibre bianche e oblique parallele alla colonna vertebrale. Questi possono essere rintracciati lungo l'SG. - Utilizzare delicatamente la punta delle forcep Dumont #5/45 per esporre il tessuto connettivo laterale al muscolo longus colli.
- Ruotare le pinze di 180° e utilizzare il lato piatto per afferrare l'SG ed estrarlo con la pressione minima.
- Ripetere con il secondo SG.
- Posizionare entrambi gli SG in un piatto (diametro 6 cm) riempito con PBS freddo e ispezionare con l'ingrandimento appropriato. Se necessario, rimuovere i vasi in eccesso, il tessuto adiposo e i nervi più grandi.
NOTA: I gangli autonomici sono circondati da una capsula del tessuto connettivo composta da fibre di collagene efibroblasti 26,27. La permeabilità di queste capsule sembra variare tra le specie, diversi tipi di gangli26 e28 anni. Rimuovere il più possibile il tessuto connettivo utilizzando le forcelle Dumont #5/45 e, se necessario, le forbici a molla. - A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, procedere con le sezioni 2, 3 o 5 di questo protocollo.
2. Protocollo immunoistochimica a montaggio intero
NOTA: Questo protocollo è adattato dalle colorazioni cardiache a montaggiointero 4,29. Eseguire fasi di incubazione per ogni singolo SG in un unico pozzo di una piastra da 96 porcili e utilizzare 100 μL (per soluzioni contenenti anticorpi) a 200 μL (per tutte le altre soluzioni) della soluzione per garantire una copertura completa. Controllare regolarmente la copertura e la corretta immersione dell'SG con binocolo. Rimuovere manualmente i liquidi con una pipetta da 200 μL con una punta aggiuntiva di 10 μL sopra la punta di 200 μL. Ciò impedirà l'aspirazione dell'SG nella punta della pipetta. Utilizzare soluzioni preparate al momento e liquidi sterili per prevenire la crescita batterica.
- Fissare SG per l'istologia per 2 ore a RT in paraformaldeide (PFA) /PBS priva di metanolo al 4%.
- Elaborare SG il più rapidamente possibile, ma a questo punto possono essere conservati per 2-4 settimane a 4-6 °C in PBS con azide di sodio 0,02% (w/v).
- Preparare la soluzione di calcio nero Sudan (1% Sudan nero w/v in 100% etanolo) per la riduzione dell'autofluorescenza e il miglioramento del rapporto segnale/sfondo30. Sciogliere per 2-3 ore su un agitatore magnetico a RT.
NOTA: Utilizzare la soluzione stock per un massimo di 6-8 settimane, scartare prima quando appare la sedimentazione. - Preparare sudan soluzione di lavoro nero centrifugando la soluzione stock per 30 minuti a tutta velocità (13.000 x g)per rimuovere i detriti e diluire lo stock in etanolo al 70% a una concentrazione finale dello 0,25% sudan nero.
- Trattare SG con candeggina di Dent per migliorare la permeabilizzazione deglianticorpi 31. Preparare al più fresco la candeggina di Dent mescolando metanolo (MeOH), soluzione di perossido di idrogeno 30% (w/w) in H2O e solfossido di dimetile (DMSO) in un rapporto di 4:1:1. Aggiungere 200 μL per SG e posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 1 h a RT.
- Eseguire una serie meoh discendente per la reidratazione incubando per 10 minuti ciascuno su uno shaker orbitale: 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
- Eseguire la permeabilità incubando SG due volte per 60 minuti ciascuno in PBS/1% Triton-X-100 presso RT.
- Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione dall'SG e aggiungere la soluzione di lavoro nero Sudan. Incubare per 2 ore a RT su uno shaker orbitale.
- Nel frattempo, preparare una soluzione di blocco aggiungendo albumina di siero bovino di grado recettore 5% (BSA) e 0,1% Triton-X-100 in PBS un recipiente da 15 mL e lasciarlo sciogliere su uno shaker a rulli per circa 5-10 minuti. Decantare attraverso un filtro di carta pre-plissettato per rimuovere i detriti.
- Rimuovere il sudan nero con molta attenzione inclinando la piastra e tubazionando con cura dal lato verticale.
NOTA: Non è possibile vedere l'SG in Sudan nero. Utilizzare una forte fonte di luce e lavorare lentamente. Da questo passo in avanti, SG è colorato di nero, migliorando la visibilità. Se a questo punto si vede un tessuto connettivo aggiuntivo che circonda SG, rimuoverlo utilizzando le forcelle Dumont #5/45 e le forbici a molla. - Aggiungere 200 μL di PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) e lavare per 5 minuti a RT su uno shaker orbitale.
- Rimuovere PBS-T aspirarlo con una pipetta e ripetere 2 volte.
- Rimuovere PBS; aggiungere 200 μL di soluzione di blocco e incubare a 4 °C durante la notte su uno shaker orbitale.
- Il giorno successivo, preparare le soluzioni aggiungendo anticorpi primari nella soluzione di blocco. Adattare le concentrazioni di anticorpi dai protocolli stabiliti.
NOTA: Includere un SG come controllo anticorpale senza anticorpo primario (incubato con anticorpo preassorbito di antigene o IgG, se disponibile, o tampone di blocco). - Eseguire l'incubazione primaria degli anticorpi per 36-48 h a 4 °C su uno shaker orbitale. Per le misurazioni delle dimensioni delle cellule e la colorazione dei neuroni simpatici, utilizzare anticorpi contro l'idrossilasi tirosina (vedi Tabella dei materiali per le raccomandazioni anticorpali).
NOTA: Posizionare la piastra da 96 poggia in una camera bagnata (ad esempio, scatola di plastica rivestita con tovaglioli di carta bagnati ddH2O) per evitare l'evaporazione a questo punto. - Rimuovere attentamente la soluzione anticorpale e aggiungere 200 μL di PBS-T. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 30 minuti.
- Rimuovere PBS-T e ripetere il passaggio di lavaggio 5 volte in più.
- Preparare la soluzione di lavoro anticorpale secondaria centrifugando gli anticorpi secondari fluorescenti etichettati Alexa per 1 minuto a piena velocità (13.000 x g ) primadell'uso. Diluire gli anticorpi secondari appropriati in base agli anticorpi primari 1:500 nella soluzione di blocco e aggiungere a SG. Aggiungere 1 μg/mL di bisbenzimide H33342 tricloruro (colorazione hoechst) se si desidera la colorazione nucleare. Incubare per 12-24 ore a 4 °C su uno shaker orbitale.
- Rimuovere attentamente la soluzione anticorpale e aggiungere 200 μL di PBS-T. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 30 minuti.
- Rimuovere PBS-T e ripetere il passaggio di lavaggio 5 volte in più. Per l'ultimo passaggio, utilizzare PBS senza Triton.
- Per l'incorporamento, stendere 50-100 μL di mezzo di montaggio fluorescente (vedi Tabella dei materiali)su uno scivolo di vetro e posizionare sotto il binocolo di preparazione. Utilizzare le forcep Dumont #5/45 per prescippare SG dalla piastra da 96 e rimuovere il liquido in eccesso immergere un'estremità su una carta da filtro (ad esempio, il tampone di essiccazione Whatman) e posizionarlo sulla goccia.
- Utilizzare i forcep Dumont #5/45 per correggere il posizionamento con l'ingrandimento appropriato.
- Posizionare delicatamente un coverslip di vetro (20 mm x 20 mm) accanto all'SG e scendere lentamente.
NOTA: L'uso di un mezzo di montaggio troppo comporterà il movimento dell'SG o l'aggrovigliamento dei nervi. In tal caso, rimuovere rapidamente il coverslip e ripetere i passaggi 2.9-2.21. - Lasciare asciugare gli scivoli al buio durante la notte a RT. Lo stoccaggio dell'esemplare macchiato è possibile per almeno 4-6 settimane a 4 °C.
3. Ibridazione in situ a montaggio intero
NOTA: L'ibridazione in situ a montaggio intero dell'SG è adattata dall'organo del corti32 e dal protocollo commerciale fluorescenza RNA in situ (vedi Tabella dei materiali). Ottenere sonde per i geni di interesse e tamponi e soluzioni dal fornitore. Tutte le fasi di incubazione vengono eseguite a RT, se non menzionate diversamente. Utilizzare PBS sterile. Se sei interessato a macchiare più SG in un unico pozzo, usa almeno 150 μL di tamponi e soluzioni.
- Eseguire la dissezione dell'SG come descritto nei passaggi 1.1-1.13.
- Fissare SG per 1 h in 200 μL di PFA/PBS privo di MeOH al 4% in un pozzo di una piastra da 96 po' posizionata su uno shaker orbitale.
- Lavare SG tre volte per 30 minuti ciascuno nello 0,1% di Tween-20/PBS su uno shaker orbitale.
- Disidratare SG nella serie MeOH/PBS con successiva incubazione in 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS e 100% MeOH per 10 min ciascuno su uno shaker orbitale.
- Conservare SG a -20 °C in 100% MeOH durante la notte.
- Il giorno dopo, preripidi l'incubatore a 40 °C. Controllare la temperatura con un termometro.
- Reidratare SG nella serie MeOH/PBS inversa (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) per 10 min ciascuno.
- Lavare SG tre volte per 5 minuti ciascuno in PBS.
- Nel frattempo, iniziare a preririludere le sonde per incubazione a 40 °C per 10 minuti, seguite da raffreddamento per 10 minuti.
- Incubare SG in 200 μL di Proteasi III per 15 min.
- Facoltativo: eseguire il trattamento nero Sudan per spegnere l'autofluorescenza secondo le sezioni 2.3, 2.4 e 2.8 di questo protocollo se è prevista una successiva colorazione dell'immunofluorescenza.
- Lavare SG in 200 μL dello 0,1% Tween-20/PBS 3x per 5 minuti ciascuno su uno shaker orbitale.
- Facoltativo: se si desidera la co-colorazione con più sonde, diluire la sonda Channel-2 (50x) e Channel-3 (50x) nella sonda Channel-1 (1x).
- Coprire SG con 100 μL di sonda per il gene di interesse e incubare durante la notte a 40 °C con leggera agitazione. Posizionare la piastra di 96 po 'in una camera bagnata a 40 °C per tutte le fasi di incubazione.
NOTA: Includere un SG come controllo negativo, utilizzando una sonda contro un gene batterico (ad esempio, diidro-dipicolinato reduttasi, Dapb) per verificare la presenza di riassiemi di amplificazione non specifici nei passaggi successivi. - Lavare SG nel tampone di lavaggio in dotazione 3 volte per 15 minuti ciascuno su uno shaker orbitale.
- Amp1-3 pre-caldo, HRP-C1 e HRP-Blocker a RT. Se si desidera la co-colorazione con la sonda Channel-2 e/o Channel-2, pre-riscaldare HRP-C2 e HRP-C3.
- Ri-fissare SG per 10 minuti a RT nel 4% PFA/PBS su uno shaker orbitale.
- Lavare SG in 200 μL di tampone di lavaggio in dotazione 3x per 5 minuti ciascuno su uno shaker orbitale a RT.
- Per l'amplificazione, incubare SG con 100 μL di Amp1 per 35 min a 40 °C su uno shaker orbitale.
- Rimuovere con cura qualsiasi liquido e lavare SG in 200 μL di tampone di lavaggio in dotazione 3x per 5 minuti ciascuno a RT su uno shaker orbitale.
- Incubare SG con 100 μL di Amp2 per 35 min a 40 °C su uno shaker orbitale.
- Ripetere il passaggio 3.18.
- Incubare SG con 100 μL di Amp3 per 20 min a 40 °C su uno shaker orbitale.
- Ripetere il passaggio 3.18.
- Incubare SG con 100 μL di Multiplex FL v2 HRP-C1 in dotazione per 20 min a 40 °C su uno shaker orbitale.
- Ripetere il passaggio 3.18.
- Preparare l'anticorpo secondario coniugato da Opale 1:1.000 in 200 μL di tampone TSA in dotazione e incubare SG per 35 minuti a 40 °C su uno shaker orbitale. Proteggere dalla luce durante l'incubazione e da questo passaggio.
- Ripetere il passaggio 3.18.
- Incubare SG in 100 μL di bloccante Multiplex FL v2 HRP in dotazione per 15 minuti a 40 °C su uno shaker orbitale.
- Ripetere il passaggio 3.18.
- Opzionale: per la co-colorazione con sonda Channel-2, ripetere i passaggi 3.25-3.30 con multiplex FL v2 HRP-C2 in dotazione.
- Opzionale: per la co-colorazione con la sonda Channel-3, ripetere i passaggi 3.25-3.30 con multiplex FL v2 HRP-C3 in dotazione.
- In caso di successiva colorazione immunofluorescente, eseguire i passaggi 2.13-2.25 di questo protocollo.
- Incubare in 1% BSA/PBS per 30 minuti su uno shaker orbitale.
- Incubare SG per 30 min in 1 μg/mL di bisbenzimide H33342 tricloruro (colorazione Hoechst) in 1% BSA/PBS se si desidera colorazione nucleare e/o aggiungere l'agglutinina germinale di grano accoppiato alexa (WGA, 1:500) su uno shaker orbitale.
- Ripetere il passaggio 3.18.
- Incorporare come descritto nei passaggi 2.19-2.22.
4. Imaging e analisi dei gangli stellati murini
- Eseguire la microscopia confocale di SG incorporato nella struttura di imaging locale.
- Se sono necessarie misurazioni delle dimensioni delle celle, l'immagine SG macchiata per l'idrossilasi tirosina (vedi Tabella dei materiali) con ingrandimento 200x e prendere 4-6 immagini casuali da ogni SG.
- Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ33 per stimare le dimensioni delle celle (ad esempio, con una tabella a penna, vedere Tabella dei materiali). Utilizzare selezione a mano libera, cerchiare ogni cella e fare clic su Analizza | Misurare per ottenere l'area cellulare. Fare attenzione a includere solo celle intatte e completamente visibili che si trovano ben all'interno dell'SG.
- Utilizzando questo metodo, eseguire la misurazione di circa 100 celle per SG.
- Fare in modo che un investigatore accecato esegua i passaggi 4.2-4.3 se si desidera confrontare SG da topi diversi. Utilizzare una distribuzione di frequenza nel software statistico per visualizzare le differenze di dimensione tra igruppi 34.
5. Analisi molecolari dei gangli stellati murini
NOTA: includi i controlli a seconda del tuo progetto sperimentale. Questo potrebbe essere SG con diversi genotipi e background della malattia e / o altri gangli autonomici, come il simpatico ganglio cervicale superiore (situato nella zona del collo, vedi descrizione dettagliata in Ziegler et al.35) o gangli parasimpatici (come i gangli intracardiaci, vedi Jungen et al.4).
- Preparare un tubo da 2 ml con 500 μL di soluzione di tiocianato di fenolo/guanidina (ad esempio Qiazol) per animale e avere azoto liquido pronto per la glassa d'urto o prendere in considerazione soluzioni commerciali per la protezione dell'RNA (facoltativo, vedi Tabella dei materiali)36. Lavora rapidamente per l'isolamento dell'RNA.
- Eseguire la dissezione dell'SG come descritto nei passaggi 1.1-1.13.
- Immergere immediatamente sia LG direttamente in un unico tubo con soluzione di tiocianato di fenolo/guanidina che tubo shock-gelo in azoto liquido.
- Conservare a -80 °C fino a ulteriore lavorazione.
- Per la lisi tissutale, lasciare che i tubi con SG si scongelino fino a quando la soluzione di tiocianato di fenolo/guanidina non viene liquefatti e aggiungere due perline in acciaio inossidabile da 7 mm. Raffreddare le parti metalliche dell'omogeneizzatore tissutale (mulino a sfera o miscelatore, ad esempio Tissue Lyser II) su ghiaccio secco e centrifuga a 4 °C.
- Tubi di centrifuga a 500 x g per 1 min a 4 °C in modo che SG si trova nella parte inferiore del tubo.
- Mettere i tubi nelle parti metalliche del Tissue Lyser e liscire per 1 minuto a 20 Hz.
- Ripetere i passaggi 5.6 e 5.7 fino a 5 volte fino a quando nessun tessuto intatto è rilevabile.
- Trasferire il liquido in un tubo fresco da 1,5 ml.
- Eseguire l'isolamento dell'RNA con un kit di isolamento dell'RNA basato su colonna (ad esempio, mini kit miRNeasy) secondo le istruzioni del produttore.
- Elute RNA in 20 μL di acqua priva di RNasi e misurare la concentrazione usando uno spettrofotometro.
NOTA: Per escludere la contaminazione dell'RNA purificato con DNA genomico, proponiamo di eseguire una reazione a catena della polimerasi con primer genomici e 1 μL di RNA come modello, invece meno il controllo della transcriptasi inversa. Ciò farà risparmiare una quantità significativa di RNA. Se l'RNA è contaminato, utilizzare primer al contorno esone-introno o primer di fianco dell'introne per la successiva reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale. - Utilizzare 250 ng SG RNA per eseguire la sintesi cDNA e utilizzare protocolli stabiliti. Qui, è stato utilizzato un kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità secondo le istruzioni del produttore.
- Diluire ad una concentrazione finale di 2,5 ng/μL di cDNA ed eseguire una reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale con le sonde appropriate secondo i protocolli stabiliti. Qui, il saggio TaqMan (vedi Tabella dei materiali) è stato eseguito utilizzando 10 ng cDNA per reazione.
NOTA: eseguire il controllo senza modello per ogni gene per escludere risultati falsi positivi. - Normalizza l'espressione genica del tuo gene di interesse su un gene di mantenimento della casa (ad esempio Cdkn1b)per confrontare l'espressione genica relativa tra diversi gruppi di SG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 1 mostra come identificare e sezionare la figura 1A di SG. I muscoli longus colli sinistro e destro mediano dall'SG e la gabbia toracica sono importanti punti di riferimento per l'orientamento. La dissezione viene eseguita lungo le linee tratteggiate tra i muscoli e la prima costola. L'SG e la catena simpatica diventano visibili come strutture bianche (Figura 1C). La figura 1D mostra un ingrandimento della regione tra il muscolo colli longus sinistro e la prima costola, dove si trova l'SG sinistro. La morfologia dell'SG differisce tra gli individui. Spesso consiste in una fusione del cervicale inferiore e il primo al terzo gangli toracico24. Una varietà che lo sperimentatore può aspettarsi in murine SG è raffigurata nella Figura 1E, F, dove vengono fotografati SG sinistro e destro di cinque topi maschi di tipo selvaggio C57Bl6.
La valutazione della panoramica anatomica lorda, così come le analisi cellulari e subcellulari delle cellule nell'SG che innerva il cuore possono essere eseguite con tecniche di montaggio intero a livello proteico e RNA. Una panoramica di un gruppo di disponibilità del gruppo di lavoro è presentata nella figura 2. Le fibre simpatiche del miocardio provengono da corpi cellulari nell'SG. Questi sono visualizzati macchiando con un anticorpo contro l'idrossilasi tirosina (TH). I somi neuronali che esprimono TH sono circondati da fibre nervose che macchiano positive per la colina acetiltransferasi (ChAT). Queste sono molto probabilmente fibre presnaptiche37,38. Un ingrandimento esemplare della co-etichettatura TH e ChAT è presentato nella figura 2A. Le cellule gliali che circondano i corpi cellulari neuronali possono essere visualizzate mediante colorazione per S100B. Questo è raffigurato nella Figura 2B in combinazione con il marcatore neurale PGP9.5. La figura 2C-F mostra analisi esemplari per studiare l'SG a livello subcellulare, utilizzando l'ibridazione in situ a montaggio intero e la co-colorazione immunofluorescente. Le molecole di proteina TH(Figura 2C, rosso) e mRNA di Tubb3 (Figura 2D, bianca) sono espresse in grandi corpi cellulari neuronali, mentre l'mRNA di S100b (Figura 2E, verde) è rilevabile anche nelle cellule glia circostanti. Nell'unione (Figura 2F), è visibile che alcuni neuroni sono negativi per TH ma esprimono Tubb3, mentre gli MRNA S100b possono essere rilevati anche nelle cellule circostanti, come illustrato nell'ingrandimento nella figura 2G.
La figura 3 presenta potenziali analisi quantitative e insidie per lo studiodell'SG murino. I somata neuronali dal controllo (db/het) SG erano 388,8 ± 123,8 μm2 vs. in SG diabetico (db/db) 407,33 ± 139,6 μm2 (Figura 3B, n = 2 SG, 100 cellule per SG per genotipo, P = 0,348, i dati sono stati confrontati utilizzando il test Mann-Whitney). La figura 3C mostra l'espressione di geni di diversi tipi cellulari dell'SG (n = 6-7). La messa in comune di entrambi gli SG da un animale consente misurazioni dell'espressione genica di circa 24 test (12 geni in duplicati). In genere normalizziamo i campioni per Cdkn1b (rilevato a valori Ct di 25,4 ± 0,97) così come il marcatore neuronale Neun/Rbfox3 (32,5 ± 0,7) se è necessario tenere conto di altri tipi cellulari e purezza neuronale della dissezione. I geni che abbiamo trovato utili per caratterizzare i processi molecolari nell'SG includono il gene simpatico Th (22,4 ± 1,6), Chat, che potrebbe indicare la trasferenziazione colinergica (espressa a valori Ct di 30,8 ± 1,3) e Gap43, un marcatore per la germinazione neuronale (rilevabile a valori Ct di 22,4 ± 1,4). I geni espressi in tipo di cellula non neuronale includono S100b (per le cellule gliali, 27,3 ± 1,2), Ki-67 (per le cellule prolifere, 33,0 ± 1,6) e Cd45 (per le cellule immunitarie, 30,2 ± 1,1).
L'SG è circondato da una capsula di tessutoconnettivo 26,visualizzato tramite colorazione ematossilina ed eosina nella figura 3D,E. Occasionalmente, abbiamo osservato incongruenze nella colorazione a base di anticorpi, come dimostrato nella figura 3F, molto probabilmente a causa della rimozione incompleta della capsula. Mentre la colorazione ChAT e TH sono rilevabili solo in alcune parti dell'SG, i nuclei controsostenibili con DAPI sono rilevabili in tutto. La linea tratteggiata nell'immagine unita separa la colorazione riuscita (a destra della linea) dalla colorazione non riuscita (a sinistra della linea).
I dati sono presentati come ± deviazione standard. La significatività statistica è stata definita come un valore P <0,05; l'analisi statistica è stata eseguita utilizzando software commerciale.
Figura 1: Posizione, dissezione e morfologia dei gangli stellati murini. (A) Disegno schematico della posizione dei gangli stellati (SG). (B) Visualizzare nel torace dopo la rimozione della confezione cuore-polmone. È importante notare che l'SG non è immediatamente visibile per la maggior parte del tempo. I muscoli longus colli si trovano lateralmente dalla colonna vertebrale. L'SG si trova lateralmente dai muscoli alla giunzione con la prima costola. Sezionare con cura lateralmente i muscoli (area contrassegnata da linea tratteggiata) per scoprire i gangli. Dopo la dissezione, i gangli (rispettivamente a sinistra e a destra, LSG e RSG) e la catena simpatica possono essere realizzati come strutture bianche e lunghe. (C) Una dissezione esemplare che mostra i gangli e i punti di riferimento anatomici. (D) Ingrandimento dell'LSG. (E) LSG e (F) RSG di tipo selvatico, i topi maschi C57Bl6 (16 settimane) sono stati sezionati e fotografati per mostrare le variazioni di morfologia e dimensioni. La barra di scala rappresenta 1.000 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Visualizzazione di diversi tipi di cellulenei gangli stellati murini attraverso l'immunoistochimica a montaggio intero e l'ibridazione in situ. (A) Panoramica lorda di un ganglio stellato murino (SG) macchiato per il marcatore simpatico tirosina idrossilasi (TH) e colina acetiltransferasi (ChAT). L'ingrandimento mostra corpi cellulari TH-positivi e la presenza di fibre nervose positive chAT, molto probabilmente presnaptiche, che circondano i somi neuronali. (B) Le cellule gliali che ensheathing corpi cellulari neuronali possono essere visualizzati mediante colorazione per S100B, qui in combinazione con il marcatore neuronale PGP9.5. (C,D,E,F) Immagini microscopiche da un supporto intero macchiato SG attraverso una combinazione di immunoistochimica per l'ibridazione TH (rosso) e in situ per Tubb3 (D, bianco) e S100b (E, verde). I nuclei sono controsostenibili con DAPI (blu). (F) L'unione mostra che non tutte le cellule neuronali(Tubb3-positive) sono TH positive. Gli MRNA S100b possono essere rilevati all'interno dei somata neuronali, ma anche delle cellule circostanti, come segnato da una freccia nell'ingrandimento in (G). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi quantitative potenziali e insidie. (A) Le immagini di SG tinte di tirosina-idrossilasi (TH) possono essere utilizzate per misurazioni delle dimensioni delle celle utilizzando ImageJ. (B) Questo è stato eseguito in un modello di topo di diabete (100 cellule per SG, n = 2 SG per genotipo, i dati sono stati confrontati utilizzando il test Mann-Whitney). (C) Geni esemplari espressi nell'SG che potrebbero essere utili per caratterizzare i processi molecolari. Cdkn1b così come il marcatore neuronale Neun/Rbfox3 (per tenere conto della presenza di altri tipi di cellule) possono essere utilizzati per la normalizzazione. L'idrossilasi tirosina (Th) funge da marcatore simpatico, colina acetiltransferasi (Chat) per la transdifferenziazione colinergica, Gap43 per la germinazione neuronale. I geni espressi nei tipi di cellule non neuronali includono S100b (cellule gliali), Ki-67 (cellule prolifere) e Cd45 (cellule immunitarie). (D) La colorazione ematossilina ed eosina di un SG fissato dalla formalina visualizza il tessuto connettivo e le cellule sopra l'ingrandimento SG. (E) dalla zona in scatola. (F) In alcune occasioni, abbiamo osservato un fallimento nella colorazione a base di anticorpi, molto probabilmente a causa della rimozione incompleta della capsula. Mentre la colorazione ChAT (rossa) e TH (verde) è rilevabile solo in alcune parti dell'SG, i nuclei controsostenibili con DAPI (blu scuro) sono rilevabili in tutto. La linea tratteggiata nell'immagine unita separa la colorazione riuscita (a destra della linea) dalla colorazione non riuscita (a sinistra della linea). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La comprensione dei processi cellulari e molecolari nei neuroni e nelle cellule gliali del sistema nervoso simpatico che precedono l'insorgenza dell'AV è di alto interesse, poiché l'arresto cardiaco improvviso rimane la causa più comune di morte intutto il mondo 5. Pertanto, nel manoscritto attuale, forniamo un repertorio di base di metodi per identificare l'SG murino - un elemento murino all'interno di questa rete - ed eseguire analisi successive a livello di RNA, proteine e cellulare.
Una sfida dell'SG murino è la sua dimensione e il numero limitato di celle39. A causa di ciò, diversi modelli animali, come ratti40,cani22emaiali 41 vengono utilizzati per studi sull'SG. Tuttavia, esiste una varietà di modelli di malattia ben consolidati per i fenotipi cardiaci disponibili nei topi e alcuni di questi sono già stati caratterizzati in diversi aspetti dell'innervazione cardiaca e dell'aritmia, come modelli per ildiabete 23,infarto miocardico42o miocardite43. Pertanto, ulteriori studi dell'SG murino sono giustificati per caratterizzare ulteriormente la disfunzione autonoma alla luce dell'AV. Questi possono essere completati da altri approcci per studiare l'innervazione del cuore murino come gli esperimentifunzionali 4,23,44 inclusala stimolazione in vivo dell'SG23.
A causa delle sue piccole dimensioni e della sua posizione all'interno della cavità toracica24, la manipolazione dell'SG murino in vivo è impegnativa, anche se è stata eseguitacon successo 23. Per questo motivo, alcuni studi si concentrano quindi sui gangli cervicali superiori, che si trovano più facilmente nel collo, a monte dell'SG nella catena simpatica dietro la biforcazione carotide in arterie carotide interne edesterne 24,35. La denervazione cardiaca attraverso la rimozione dei gangli cervicali superiori ha dimostrato di attenuare l'infiammazione del miocardio, l'ipertrofia e la disfunzione cardiaca dopo l'infarto del miocardio35. Tuttavia, è importante notare che i gangli cervicali superiori innervate diverse regioni del cuore, in particolare il lato anteriore45. Inoltre, una recente revisione approfondita della letteratura è arrivata alla conclusione che il ruolo dei gangli cervicali nell'innervazione simpatica del cuore rimane poco chiaro negli esseriumani 46. Ciò evidenzia l'importanza di caratterizzare l'SG per gli studi sull'innervazione cardiaca simpatica.
È importante notare che il cuore non è l'unico obiettivo dell'SG. Tra gli altri, ipolmoni 47 e le ghiandole sudoripare nella bipaw48 sono anche innervati da fibre originarie dell'SG, questi ultimi sono un'eccezione alla fisiologia simpatica in quanto esprimono colina acetiltransferasi37. Il blocco temporaneo dell'SG viene studiato per quanto riguarda i processi infiammatori nella lesione polmonare acuta49 o per il trattamento delle vampate di calore e della disfunzione delsonno 50; pertanto, i protocolli in questione potrebbero offrire un repertorio per questioni meccaniche in questi settori. Quando ci si concentra sui modelli di malattie cardiache, si dovrebbe tenere presente per l'interpretazione dei risultati che i neuroni cardiaci non possono essere differenziati per morfologia o proprietà elettrofisiologiche dai neuroni non cardiaci51. Questo può essere ottenuto attraverso il tracciamento retrogrado, quindi la posizione dei neuroni che si proiettano al cuore ha dimostrato di essere situata nelle parti cranio-mediali dell'SG52.
Inoltre, è importante notare che oltre a diversi tipi di neuroni, i gangli simpatici sono fatti di glia ensheathing, le cosiddette cellule gliali satellitari o cellule satellitari contrassegnate dall'espressione del marcatore gliale S100B53. Mentre poco si sa del ruolo di queste cellule nelle patologie cardiovascolari, l'attivazione gliale e l'espressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) è stata descritta in SG da pazienti con aritmie18.
Alcune insidie dovrebbero essere tenute a mente con i metodi presentati: abbiamo osservato incongruenze nella colorazione a base di anticorpi in alcune occasioni e ipotizzato che la rimozione incompleta della capsula del tessuto connettivo che ensheathing l'SG potrebbe essere in difetto, in quanto sono stati descritti per variare in permeabilità tra i diversi tipi di gangli26. La rimozione meccanica della capsula con forcep fini è stata descritta nel ganglio cervicale superiore dei ratti fino al giorno postnatale 1028 e la deseathing è menzionata in letteratura per ratto adulto SG54,55 e topi56. La rimozione della capsula SG potrebbe variare tra l'etàdi 28 anni e , a causa delle differenze di dimensioni, le specie. Nella nostra esperienza, la dissezione fresca, la rimozione del maggior tessuto connettivo possibile utilizzando forcelle fini e una permeabilizzazione approfondita come descritto nel protocollo in questione, sono fattori importanti per una colorazione di successo. Per quanto riguarda la PCR quantitativa in tempo reale, il lavoro rapido e lalisi efficiente sono essenziali. Mettere in comune entrambi gli OSS da un animale ha permesso in modo affidabile l'analisi di un massimo di 12 geni diversi (quando si eseguono duplicati).
Anche se la funzione e l'anatomia grossolana di SG sono state studiate per decenni e ogni singolo cardiomiocita è innervato da fibre simpatiche46, rimangono molte domande aperte. Ad esempio, non è chiaro, perché i neuroni simpatici dell'SG si trasferenziano transitoriamente a un fenotipo colinergico nell'ischemico21 e insufficienza cardiaca non ischemica, nei modelli animali e nei pazienti20. Recentemente, il nostro gruppo ha descritto un ruolo delle cellule gliali positive all'S100B, che sono presenti anche nell'SG murino, sul nervo che germoglia nel sistema nervoso cardiaco29. Se queste cellule sono rilevanti per la germinazione del nervo simpatico dopo la lesione associata all'AV11,12, deve essere chiarito in studi futuri. È importante sottolineare che approcci innovativi, come l'optogenetica52 e le analisi del trascritoma36 possono integrare metodi consolidati come il tracciamento neuronale al fine di approfondire la comprensione del sistema nervoso simpatico e del suo ruolo sull'elettrofisiologia cardiaca.
In conclusione, questo repertorio consente allo sperimentatore inesperto di eseguire una caratterizzazione di base dell'SG nei modelli murini di patologie cardiache. Speriamo che ciò stimoli l'uso, la combinazione e la creazione di nuovi metodi. Questo potrebbe aiutare ad aumentare la comprensione dei processi cellulari e molecolari sottostanti nei neuroni simpatici che potrebbero essere responsabili dell'insorgenza e del mantenimento dell'AV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Hartwig Wieboldt per la sua eccellente assistenza tecnica e l'UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) dell'University Medical Center Hamburg-Eppendorf per aver fornito microscopi e supporto. Questa ricerca è stata finanziata dal DZHK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
References
- Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
- Jänig, W.
- Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
- Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
- Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
- Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
- Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
- Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
- Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
- Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
- Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
- Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
- Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
- Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
- Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
- Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
- Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
- Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
- Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
- Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
- Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
- Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
- Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
- Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I.
- Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
- Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
- Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
- Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
- Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
- Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
- Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
- Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
- Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
- Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
- Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
- Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
- Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
- Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
- Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
- Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
- Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).
