Methodenartikel
Hefewachstumsphänotypen werden präzise durch hochparallele Zeitraffer-Bildgebung von immobilisierten Zellen gemessen, die zu Mikrokolonien heranwachsen. Gleichzeitig können Stresstoleranz, Proteinexpression und Proteinlokalisierung überwacht werden, wodurch integrierte Datensätze generiert werden, um zu untersuchen, wie ökologische und genetische Unterschiede sowie die Genexpressionsheterogenität unter isogenen Zellen das Wachstum modulieren.
Präzise Messungen der Heterogenität zwischen und innerhalb der Dehnung in mikrobiellen Wachstumsraten sind entscheidend für das Verständnis genetischer und ökologischer Inputs in Stresstoleranz, Pathogenität und anderen Schlüsselkomponenten der Fitness. Dieses Manuskript beschreibt einen mikroskopischen Assay, der pro Experiment etwa 105 Saccharomyces cerevisiae mikrocolonies nachverfolgt. Nach der automatisierten Zeitraffer-Bildgebung von Hefe, die in einer Multiwell-Platte immobilisiert ist, lassen sich die Wachstumsraten von Mikrokolonien mit einer benutzerdefinierten Bildanalysesoftware einfach analysieren. Für jede Mikrokolonie können auch die Expression und Lokalisation fluoreszierender Proteine und das Überleben akuter Belastungen überwacht werden. Dieser Test ermöglicht eine genaue Schätzung der durchschnittlichen Wachstumsraten der Stämme sowie eine umfassende Messung der Heterogenität in Wachstum, Genexpression und Stresstoleranz innerhalb klonaler Populationen.
Wachstumsphänotypen tragen entscheidend zur Hefefitness bei. Die natürliche Selektion kann effizient zwischen Linien unterscheiden, wobei die Wachstumsraten durch die Umkehrung der effektiven Bevölkerungsgröße abweichen, die 108 Individuen1 überschreiten kann. Darüber hinaus ist die Variabilität der Wachstumsraten bei Individuen innerhalb einer Bevölkerung ein evolutionär relevanter Parameter, da er als Grundlage für Überlebensstrategien wie Wetten hedging2,3,4,5,6dienen k....
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1. Vorbereitung randomisierter Platten (vor dem Experimenttag)
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Die Neuheit dieses Protokolls ist, dass die Wachstumsrate für einzelne Zellen innerhalb einer Population berechnet werden kann, indem ihr Wachstum in Mikrokolonien durch Zeitraffer-Bildgebung verfolgt wird (Abbildung 2A). Da Mikrokolonien aufgrund des Vorhandenseins von Concanavalin A viele Stunden planarer wachsen, können ihre Gebiete während des gesamten Experiments verfolgt werden, und eine lineare Anpassung an die Veränderung des natürlichen Protokolls des Gebiets im Laufe der Zeit kann .......
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Das hier beschriebene Protokoll ist ein vielseitiger Test, der es ermöglicht, Zellwachstum und Genexpression gleichzeitig auf der Ebene einzelner Mikrokolonien zu überwachen. Die Kombination dieser beiden Modalitäten ergibt einzigartige biologische Erkenntnisse. Zum Beispiel haben frühere Arbeiten diesen Test verwendet, um eine negative Korrelation zwischen der Expression des TSL1-Gens und der Mikrokolonie-Wachstumsrate in isogenen Wildtypzellen zu zeigen, indem beide gleichzeitig7,<.......
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Die Autoren haben nichts zu verraten.
Wir danken Naomi Ziv, Sasha Levy und Shuang Li für ihre Beiträge zur Entwicklung dieses Protokolls, David Gresham für gemeinsame Ausrüstung und Marissa Knoll für die Hilfe bei der Videoproduktion. Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss der National Institutes of Health R35GM118170 unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| General Materials | |||
| 500 mL Flaschenfilter .22 µ m PES-Sterilisation, geringe Proteinbindung, mit 45 mm Hals | Fisher | CLS431154 | zur Filtration des Mediums |
| BD Falcon*Gewebekulturplatten, Mikrotest u-Boden | Fisher | 08-772-54 | 96-Well-Kulturröhrchen zum Einfrieren von Zellen, Vorzüchten von Zellen und Verdünnungen |
| BD Spritzen ohne Nadel, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Wird zum Filtern von Concanavalin A |
| Costar Sterile Einweg-Reagenzreservoire verwendet | Fisher | 07-200-127 | Reagenzreservoire zum Pipettieren von Lösungen mit Mehrkanalpipetten |
| Costar Schutzrohr-Aluminium-Dichtungsband | Fisher | 07-200-684 | 96-Well-Plattendichtung zum Vorwachsen und Einfrieren |
| von fussel- und antistatischen Tüchern | Fisher | 06-666A | fussel- und antistatisch freie Tücher, um den Boden der Mikroskopplatte frei von Schmutz und Kratzern zu halten |
| Nalgene Spritzenfilter | ThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0,2 μ M Porengröße, 25 mm Durchmesser; zur Filterung von Concanavals |
| A-LösungMedia Components | |||
| Minimal chemisch definierte Medien (MD; 2 % Glukose) | alternative Mikroskopiemedien, die für das Vorwachstum und Wachstum von Hefen während der Mikroskopie verwendet werden | ||
| Synthetische vollständige Medien (SC; 2 % Glukose) | Mikroskopiemedien, die für das Vorwachstum und Wachstum von Hefen während der Mikroskopie | ||
| verwendet werdenHefeextrakt-Pepton-Dextrose (YEPD; 2 % Glukose) mittleres | Zellwachstum vor dem Einfrieren randomisierte Platten | ||
| Mikroskopiematerialien | |||
| Breathe-Easy Dichtungsmembran | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | atmungsaktive Membranen, die zur Versiegelung der Platte während des Mikroskopieexperiments verwendet werden. In diesem Stadium werden atmungsaktive Membranen empfohlen, da sie Kondensation in den Vertiefungen verhindern und bessere Mikroskopiebilder ermöglichen |
| Brooks 96-Well-Mikroskopplatte mit flachem Klarglasboden | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | Mikroskopplatte |
| Concanavalin A aus Canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilisiertes Pulver | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Stellen Sie 5x Concanavalin A-Lösung her und frieren Sie 5 ml 5x Concanavalin A in konischen 50-ml-Röhrchen bei -80 & Grad ein; Verwendete C |
| Stämme | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Haploide Mutationsakkumulationsstämme im Labor, beschrieben in Hall und Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Nachkommen des angestammten Hall and Joseph 2010 Mutationsakkumulationsstamms, transformiert mit YFR054cΔ::Scw11P: :GFP | ||
| Ausrüstung | |||
| Misonix Sonicator S-4000 mit 96-poligem Aufsatz | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E mit Perfect Focus System | Inverses Mikroskop mit automatischem Tisch und Autofokus-System |
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