Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung des Sinusknotens (SAN) und des atrioventrikulären Knotens (AVN) in murinen Herzen.
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Methodenartikel
Whole-Mount Immunfluoreszenz-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Rekonstruktion des sinus- und atrioventrikulären Knotens in der Maus
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das elektrische Signal, das physiologisch von Schrittmacherzellen im Sinusknoten (SAN) erzeugt wird, wird durch das Reizleitungssystem geleitet, zu dem auch der atrioventrikuläre Knoten (AVN) gehört, um die Erregung und Kontraktion des gesamten Herzens zu ermöglichen. Jede Dysfunktion von SAN oder AVN führt zu Arrhythmien, was auf ihre grundlegende Rolle in der Elektrophysiologie und Arrhythmogenese hinweist. Mausmodelle werden häufig in der Arrhythmieforschung eingesetzt, aber die spezifische Untersuchung von SAN und AVN bleibt eine Herausforderung.
Das SAN befindet sich an der Kreuzung der Crista terminalis mit der oberen Hohlvene und AVN befindet sich an der Spitze des Koch-Dreiecks, das von der Öffnung des Koronarsinus, dem Trikuspidalring und der Sehne von Todaro gebildet wird. Aufgrund der geringen Größe bleibt die Visualisierung durch konventionelle Histologie jedoch eine Herausforderung und ermöglicht nicht die Untersuchung von SAN und AVN in ihrer 3D-Umgebung.
Hier beschreiben wir einen Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Ansatz, der die lokale Visualisierung von markierten Maus-SAN und AVN ermöglicht. Die Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Färbung ist für kleinere Gewebeabschnitte vorgesehen, ohne dass ein manuelles Schneiden erforderlich ist. Zu diesem Zweck wird das Mausherz präpariert, unerwünschtes Gewebe entfernt, gefolgt von Fixierung, Permeabilisierung und Blockierung. Zellen des Leitungssystems innerhalb von SAN und AVN werden dann mit einem Anti-HCN4-Antikörper gefärbt. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und Bildverarbeitung ermöglichen die Differenzierung zwischen Knotenzellen und arbeitenden Kardiomyozyten sowie die eindeutige Lokalisierung von SAN und AVN. Darüber hinaus können zusätzliche Antikörper kombiniert werden, um auch andere Zelltypen, wie z.B. Nervenfasern, zu markieren.
Im Vergleich zur konventionellen Immunhistologie bewahrt die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung die anatomische Integrität des Herzleitungssystems und ermöglicht so die Untersuchung von AVN; Dies gilt insbesondere für ihre Anatomie und die Wechselwirkungen mit den umgebenden Myokard- und Nicht-Myozytenzellen.
Einleitung
Arrhythmien sind häufige Erkrankungen, von denen Millionen von Menschen betroffen sind, und sie sind weltweit die Ursache für eine signifikante Morbidität und Mortalität. Trotz enormer Fortschritte in der Behandlung und Prävention, wie z.B. der Entwicklung von Herzschrittmachern, bleibt die Behandlung von Herzrhythmusstörungen eine Herausforderung, vor allem aufgrund des sehr begrenzten Wissens über die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen 1,2,3. Ein besseres Verständnis sowohl der normalen Elektrophysiologie als auch der Pathophysiologie von Arrhythmien könnte helfen, in....
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Protokoll
Die Tierpflege und alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierschutz- und Ethikkommission der Universität München durchgeführt, und alle an Mäusen durchgeführten Verfahren wurden von der Bayerischen Staatsregierung, München, Deutschland genehmigt (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die für das Experiment benötigten Instrumente. Abbildung 2 zeigt eine Darstellung der groben Herzanatomie.
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Ergebnisse
Durch die Verwendung des oben beschriebenen Protokolls kann die konfokale Mikroskopie-Bildgebung sowohl von SAN als auch von AVN zuverlässig durchgeführt werden. Die spezifische Färbung des Leitungssystems mit fluoreszierenden Antikörpern, die auf HCN4 abzielen, und die Färbung des funktionierenden Myokards mit fluoreszierenden Antikörpern, die auf Cx43 abzielen, ermöglicht die eindeutige Identifizierung von SAN (Abbildung 5, Video 1) und AVN (
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Diskussion
Die Anatomie des Herzens wird traditionell anhand dünner histologischer Schnitte untersucht11. Diese Methoden bewahren jedoch nicht die dreidimensionale Struktur des Leitungssystems und liefern somit nur 2D-Informationen. Das hier beschriebene Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll ermöglicht es, diese Einschränkungen zu überwinden und kann routinemäßig für die SAN- und AVN-Bildgebung verwendet werden.
Im Vergleich zu Standardmethoden wie der konventionellen Immunh.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt vom China Scholarship Council (CSC, an R. Xia), dem Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK; 81X2600255 an S. Clauss, 81Z0600206 an S. Kääb), der Corona-Stiftung (S199/10079/2019 an S. Clauss), dem SFB 914 (Projekt Z01 an H. Ishikawa-Ankerhold und S. Massberg und Projekt A10 an C. Schulz), dem ERA-NET für kardiovaskuläre Erkrankungen (ERA-CVD; 01KL1910 an S. Clauss) und der Heinrich-und-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (an S. Clauss). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Vorbereitung des Manuskripts.
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Materialien
Ziegen Anti-Kaninchen
Isofluran-Verdampfersystem
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anästhesie | |||
| Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Enthält eine Induktionskammer, eine Gasevakuierungseinheit und Aktivkohlefilter | |
| Modifizierte Bain-Schaltung | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Enthält eine Anästhesiemaske für |
| Mäuse Chirurgische Plattform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo Instrumentierung | |||
| Feine Pinzette | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Irisschere | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Federschere | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Gewebezange | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Gewebenadeln | Fine Science Tools | 26007-01 | Könnte 27G-Nadeln als Ersatz verwenden |
| Allgemeine Laborinstrumente | |||
| Orbitalschüttler | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetrührer | IKA | RH basic | |
| Pipette, Volumen 10 & Mikro; L, 100 &Mikro; L, 1000 &Mikro; L | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Mikroskope | |||
| Dissektions-Stereozoom-Mikroskop | VWR | 10836-004 | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 schwarz | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0,2 &Mikro; m Spritzenfilter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm Petrischale | Falcon | 351029 | |
| 27G Nadel | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylen konisches Röhrchen | Falcon | 352070 | |
| 5ml Spritze | Braun | 4606108V | |
| Deckgläser | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Bestandteile aus TEA |
| 16% Formaldehyd Lösung | Thermo Scientific | 28908 | als 4%ige Lösung verwenden |
| Essigsäure | Merck | 100063 | Bestandteile von TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Rinderserum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung | Gibco | 14190-094 | |
| Normales Ziegenserum | Sigma | NS02L | |
| Saccharose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-Base | Roche | TRIS-RO | Bestandteile von TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | verdünnt auf 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0,5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isofluran 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Sauerstoff 5 L | Linde | 2020175 | Enthält einen Druckregler |
| Antikörper | |||
| IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | verdünnt auf 1:200 |
| Ziege Anti-Ratte IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | verdünnt auf 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat (DAPI) | Invitrogen | H3570 | verdünnt auf 1:1000 |
| Kaninchen Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | verdünnt auf 1:200 |
| Ratte Anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | verdünnt auf 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglasring | Selbst entworfenes und 3D-gedrucktes | ||
| Plastilin | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Das Jackson-Labor |
Referenzen
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characte....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
