Schaffung und Pflege einer lebenden Biobank - Wie wir es tun

In den letzten Jahren führte das angesammelte Wissen über die morphologischen, klinischen und genetischen Eigenschaften von Krebs zur Empfängnis als heterogene, individuelle Krankheit. Folglich hat die mutationale Charakterisierung von Neoplasmen neben klinischen und pathologischen Merkmalen an Bedeutung für die klinische Entscheidungsfindung gewonnen und viele gezielte Therapien wurden für verschiedene molekulare Veränderungen entwickelt. Zum Beispiel kann die Wirksamkeit von Cetuximab in der Darmkrebsbehandlung durch die Analyse des KRAS- und PIK3CA-Mutationsstatus ¹vorhergesagt werden. Die Präzisionsmedizin zielt auf einen maßgeschneiderten Ansatz ab, um bei jedem Patienten die höchste Behandlungsreaktion zu bieten und Toxizität von inefficacious Therapien zu vermeiden². Biobanken enthalten Gewebe, Blut und andere biologische Materialien von Krebspatienten, die mit den klinischen Daten verknüpft sind und somit ein hervorragendes Werkzeug für die translationale Krebsforschung sind. Aufgrund der großen Anzahl klinischer Proben ermöglichen Biobanken den Nachweis seltener, aber potenziell medikamentöser Mutationen, was dem einzelnen Patienten neue Behandlungsmöglichkeiten bietet³.

Um ein möglichst breites onkologisches Forschungsspektrum abzudecken, haben wir unsere Aktivität bei der Probenentnahme nicht allein eingeschränkt, sondern uns auf die Etablierung von vom Patienten abgeleiteten Krebszelllinien und Xenografts (PDX) konzentriert. Traditionelle 2D-Zelllinien bleiben der Eckpfeiler der In-vitro-Forschung und sind die erste Wahl für groß angelegte Arzneimittelscreenings^4,5. Darüber hinaus ist die Zelllinienanalyse oft einfacher, billiger und leichter verfügbar. Da patientenabgeleitete periphere Blutlymphozyten (PBL) zur Verfügung stehen, kann auch die Tumorimmunologie in vitro⁶untersucht werden. Die Mehrheit der neu entwickelten Medikamente mit vielversprechender präklinischer Wirksamkeit in zellbasierten In-vitro- oder In-vivo-Experimenten haben jedoch enttäuschende Ergebnisse in klinischen Studien gezeigt⁷. Im Gegensatz dazu haben präklinische Studien auf basis von PDX in vivo-Studien die klinische Aktivität antineoplastischer Wirkstoffe viel getreuer widergespiegelt⁸. Da PDX-Gewebe die histologischen und molekularen Eigenschaften des Spendertumors genau widerspiegelt, sind PDX-Modelle eine gute Möglichkeit, die oft sehr begrenzten Mengen an lebensfähigem Tumorgewebe zu vermehren, um die Integrität einer Biobank zu erhalten und den Austausch von Proben zwischen Forschungsgruppen und Institutionen zu ermöglichen. Darüber hinaus können Aus PDX-Gewebe gewonnene Krebszelllinien deutlich einfacher festgestellt werden als primäre Krebszelllinien⁹. In den letzten Jahren hat unsere Arbeitsgruppe eine umfassende integrierte Biobank für Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs eingerichtet, indem der Arbeitsablauf für alle betreffenden biologischen Proben schrittweise standardisiert und optimiert wurde (Abbildung 1).

Abbildung 1:Workflow und Organisation der Biobank Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die folgende Studie wurde vom institutionellen Gutachterausschuss des Universitätsklinikums Rostock genehmigt (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 und A 2019-0222). Darüber hinaus wurden alle veterinärrelevanten Verfahren vom Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern unter den Kennzeichen LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 und 7221.3-1-007/19 genehmigt.

1. Experimentelle Voraussetzungen

1. Erfüllen Sie mehrere wichtige Rahmenbedingungen, um eine Biobank zu gründen und zu unterhalten.
   1. Nutzen Sie eine Klinik mit einer chirurgischen Abteilung und einer ausreichenden Anzahl onkologischer Resektionen zusammen mit einem gut ausgestatteten Labor und ausreichend akademischem Personal. Eine gute Infrastruktur und eine feste Verbindung mit einer kooperierenden Pathologieabteilung sind weitere Voraussetzungen.
   2. Für die In-vivo-Forschung verwenden Sie eine Tieranlage mit Fürdenten, die für immundefizienten Mäusen geeignet sind.
   3. Erhalten Sie eine Genehmigung für jede Forschung über patientenabgeleitetes Material von einer Ethikkommission des Gesundheitswesens. Die Genehmigung für in vivo Forschung enthin von der zuständigen Behörde gemäß den örtlichen gesetzlichen Vorschriften.

2. Probensammlung

1. Am Tag vor der Operation
   1. Bewerten Sie alle Patienten mit resezierbarem Dickdarm- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs und/oder entsprechenden Metastasen für die Biobanking-Berechtigung. Vermeiden Sie Fälle mit neoadjuvanter Vorbehandlung, sehr kleinen Tumoren, Tumoren von ungewisser Würde oder Läsionen, die teilweise zuvor endoskopisch reseciert wurden.
   2. Erhalten Sie eine schriftliche Genehmigung der Teilnahme des Patienten während der informierten Einwilligungsdiskussion über den chirurgischen Eingriff. Informieren Sie rechtzeitig alle beteiligten Chirurgen, das Laborteam sowie den Pathologen.
2. Stichprobenerfassung
   1. Informieren Sie alle Betreuer im Operationssaal (OR) unmittelbar vor Beginn des chirurgischen Eingriffs über die Gewebeentnahme für die Biobank.
      HINWEIS: Es ist entscheidend, dass das Gewebe nicht in Formalin fixiert werden darf. Wenn das Gewebe in Formalin getaucht wird, wird es für integriertes Biobanking ungeeignet.
   2. Zeichnen Sie 40 ml heparinisiertes Blut (2 x 20 ml Spritze) sowie ein Standard-7,5 ml Serumrohr unmittelbar nach der Anästhesieinduktion und übertragen Sie schnell ins Labor zur PBL-Isolierung und Serumverarbeitung (siehe Schritt 3-4).
   3. Bewahren Sie das resezierte Exemplar direkt vom Operationstisch ab, legen Sie es in einen geeigneten Behälter und bringen Sie es in die pathologische Abteilung. Notieren Sie den Zeitpunkt der Ablösung von der Zirkulation, Resektion und Ankunft in der Pathologie.
      HINWEIS: Die Eignung der Probe für das Bio-Banking sollte vom kooperierenden Pathologen beurteilt werden, der eine Scheibe Tumor und nicht-bösartiges Gewebe seziert. Verbrauchen Sie keine Teile des Exemplars selbst, die den nachfolgenden pathologischen Bericht beeinträchtigen könnten.
   4. Legen Sie beide Gewebeteile in ein separates 15 bis 50 ml Polypropylenrohr mit 10 bis 30 ml Gewebespeicherlösung (oder DPBS) auf Eis. Notieren Sie sich den Zeitpunkt des Eingangs und übertragen Sie die Proben sofort ins Labor.
      HINWEIS: Die folgenden Protokollschritte 3-6 müssen in einem laminaren Durchflussschrank unter strengen sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Verwenden Sie alle Flüssigkeiten bei Raumtemperatur.

3. Serumverarbeitung

1. Zentrifugieren Sie das 7,5 ml Serumrohr bei 1128 x g und 4 °C für 15 min in einer vorgekühlten Zentrifuge.
2. Aliquot 1 ml Serum pro Röhre in vorbeschrifteten Kryoröhren und einfrieren in flüssigem Stickstoff.

4. Isolierung von PBL durch Dichtegradientenzentrifugation

HINWEIS: Arbeiten Sie parallel mit jeder der beiden 20 ml Spritzen.

1. Füllen Sie 20 ml heparinisiertes Blut in ein 50 ml Polypropylen-Rohr und fügen Sie 15 ml DPBS hinzu.
2. Nehmen Sie 15 ml Pancoll mit einer serologischen Pipette, legen Sie die Pipette vorsichtig bis zum Boden des Polypropylenrohrs ein und lassen Sie das Pancoll sehr langsam los, um eine Schicht unter der Blut-/DBPS-Säule zu bilden.
3. Zentrifuge bei 375 x g für 15 min ohne Bremse.
4. Aspirieren und übertragen Sie die undurchsichtige Interphasenschicht zwischen der mittleren und oberen Säule beider Proben in ein frisches 50 ml Polypropylenrohr und füllen Sie sie mit DPBS auf 50 ml.
5. Zentrifuge bei 270 x g für 15 min mit Bremse.
6. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Zellpellet in 4,5 ml Gefriermedium wieder auf.
7. Aliquot 1,5 ml der Suspension pro Kryotube, die Rohre fest schließen und in einen Gefrierbehälter legen, der für langsames Einfrieren geeignet ist, und bei -80 °C lagern.

5. Gewebeverarbeitung

HINWEIS: Beginnen Sie mit der Erzeugung von Snap-Gefrorenen Proben von Tumor und gesundem Gewebe, um die Integrität von Nukleinsäuren zu erhalten.

1. Tumorgewebe-Probe
   1. Übertragen Sie die Tumorprobe mit mehreren ml Gewebespeicherlösung aus dem Polypropylenrohr auf eine Petrischale. Spülen Sie bei Bedarf mit DPBS. Vermeiden Sie es, die Probe zu berühren und verwenden Sie zwei sterile Skalpelle, um das Gewebe zu behandeln. Vermeiden Sie die Austrocknung zu jeder Zeit.
   2. Wiegen Sie die Tumorprobe auf einer praktischen Skala in einer separaten Schale und notieren Sie das Gewebegewicht.
   3. Bewerten Sie Größe, Form und Gewebequalität des Tumorgewebes vor dem Schneiden. Ziel ist es, mindestens ein Stück von der Größe eines Pinheads für das Einfrieren von Druckknöpfen und vier Würfel von ca. 30 mm³ (Kantenlänge 3 x 3x 3 mm) für die lebenswichtige Kryokonservierung zu erhalten. Generieren Sie so viele 30 mm^3-Würfel in Vierbeinern wie möglich und generieren Sie ein Stück für Daseinfrieren pro 5 Vierlinge. Berücksichtigen Sie auch, dass nekrotische Portionen abgeschnitten werden müssen, so dass die Würfel nur aus lebenswichtigem Gewebe bestehen.
   4. Generieren Sie Scheiben von 3 mm Dicke. Nekrotische Portionen abschneiden, sich als gelartige oder flüssige Masse unterscheiden, und schneiden Sie die Scheiben in Würfel der beiden gewünschten Größen.
      HINWEIS: Entsorgen Sie an dieser Stelle kein Gewebe.
   5. Snap-Einfrieren
      1. Etikettieren Sie Kryoröhren entsprechend (siehe Schritt 7.7).
      2. Legen Sie ein kleines Gewebestück pro vorbeschrifteten Kryotube. Die Proben sofort für einige Minuten in flüssigen Stickstoff untertauchen und anschließend bei -80 °C lagern.
   6. Kryokonservierung von lebenswichtigem Gewebe
      1. Kryoröhren entsprechend etikettieren (siehe Schritt 7.7) und jeweils mit 1,5 ml Gefriermedium füllen. Stellen Sie den Gefrierbehälter neben die Bank.
         HINWEIS: Führen Sie die nächsten Schritte so schnell wie möglich aus. Da das DMSO im Gefriermedium zytotoxische Eigenschaften hat, sollte die Zeit, in der das Gewebe ohne ordnungsgemäße Kühlung in ein Gefriermedium getaucht wird, 2 Minuten nicht überschreiten.
      2. Die 30 mm³ Würfel in Vierern anrichten. Nekrotisches Gewebe und andere Reste an den Rand der Schale schieben, aber nicht entsorgen.
      3. Die Würfel mit der Skalpellklinge schaufeln und 4 Würfel pro Kryotube übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Tumorstücke vollständig in Gefriermedium getaucht sind. Schließen Sie die Rohre fest und legen Sie sie in einen Gefrierbehälter, der für langsames Einfrieren geeignet ist, und lagern Sie sie in einem -80 °C Gefrierschrank.
      4. Kryoröhren in ein geeignetes Lagersystem für die Langzeitlagerung bei -140 °C oder niedriger übertragen. Die Dokumentation im Laborinventarmanagementsystem ist obligatorisch.
2. Gesunde Gewebeprobe: Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1. bis 5.1.6.4 für die gesunde Gewebeprobe.

6. Primäre Zellkultur

1. Zerlegen Sie die Reste des Tumorgewebes, einschließlich des nekrotischen Schrotts, in der Petrischale mit den Skalpellen so klein wie möglich.
2. Legen Sie ein steriles Zellsieb (100 m Porengröße) auf ein 50 ml Polypropylenrohr.
3. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um 5-10 ml DPBS zur Petrischale hinzuzufügen, die Gewebereste und Pipetten nach oben und unten zu schweben, um eine Suspension zu erzeugen.
4. Übertragen Sie die Suspension mit der Pipette auf das Zellsieb.
5. Wiederholen Sie die Schritte 6.3-6.4, bis alle Gewebereste aus der Petrischale gelöst sind.
6. Verwenden Sie den Kolben einer 20 ml Einwegspritze, um die Zell- und Gewebesuspension durch das Zellsieb zu drücken.
7. Spülen Sie mit 5-10 ml frischem DPBS, entsorgen Sie das Zellsieb und schließen Sie das Rohr richtig.
8. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 180 x g für 5-10 Minuten.
9. Bereiten Sie eine Kollagen-I vorbeschichtet 6 Well Platte mit 1,5 ml Medium pro Brunnen.
10. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in 3 ml DPBS oder Medium aus und fügen Sie jedem Bohrwert 500 l der Suspension hinzu. Legen Sie die Platte in den Inkubator (100% Luftfeuchtigkeit, 5% CO₂, 37 °C)
11. Überwachen Sie die Platte täglich auf Zellwachstum und Kontamination.
    HINWEIS: Eine weitere Zellkultivierung bis zur Etablierung einer permanenten Zelllinie wird hier nicht beschrieben.

7. PDX-Generation

1. Führen Sie in vivo-Experimente nur von entsprechend qualifizierten Personen durch, die den Anforderungen der zuständigen Behörde Ihrer Gerichtsbarkeit entsprechen.
2. Hausimmundefizienten mäuse unter spezifisch-pathogenfreien (SPF) Bedingungen, die die Anforderungen des verwendeten Mausstamms erfüllen. Die hygienischen Maßnahmen umfassen individuell belüftete Käfige, autoklavierte Lebensmittel, Wasser und Nistmaterial sowie ein Sicherheitsluftschloss und das Tragen persönlicher Schutzausrüstung.
3. Autoklaven Sie alle Instrumente im Voraus und verwenden Sie nur einen Satz Von Instrumenten für jeden Tumorfall, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Behandeln Sie das Tumorgewebe so aseptisch wie möglich. Alle nachstehend genannten Kunststoffgegenstände sollten steril, einwegig und nach jeder Operation entsorgt werden.
   HINWEIS: Die PDX-Generation wird durch die Methode des Einfrierens von vier Tumorgewebestücken pro Kryotube bestimmt und benötigt immer zwei Mäuse pro Probe, was idealerweise zu vier PDX-Tumoren führt.
4. Wählen Sie den gewünschten Primärtumor zur Entransplantation über das Laborinventarmanagementsystem und übertragen Sie die Probe (vital erhaltenes Tumorgewebe) aus dem Hauptspeicherbehälter in einen tragbaren Flüssigstickstoffbehälter (Zwischenlagerung bei -80 °C auf Trockeneis ist ebenfalls bequem).
5. Vor dem Betreten des SPF-Abschnitts (Scrubs, Clogs, Schürze, Haarschutz, OP-Maske und Überschuhe) werden persönliche Schutzausrüstungen angeschnallt, um ihre Hände und alle Geräte zu desinfizieren.
6. Matrigel-Einweichen
   1. Entfernen Sie das Kryotube aus dem flüssigen Stickstoffbehälter und warten Sie auf das Auftauen der Probe.
   2. Beschriften Sie ein 50 ml Polypropylenrohr und füllen Sie es mit 35 ml DPBS.
   3. Kippen Sie das Kryotube nach oben und unten und übertragen Sie den Inhalt sofort auf das Polypropylenrohr, sobald das Gewebe-Medium-Slush verschoben werden kann. Spülen Sie die Tumorgewebestücke vorsichtig ab, entsorgen Sie das Hauptvolumen aus dem Rohr in einem separaten Gefäß, schließen Sie den Deckel und legen Sie das Rohr nach oben, so dass sich die vier Gewebestücke im Deckel sammeln.
   4. Legen Sie eine Petrischale auf den Kühlakkumulator und legen Sie 100 L Matrigel als einzelnes Tröpfchen in die Mitte. Verwenden Sie anatomische Zangen, um die Tumorstücke in das Matrigel zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass jedes Stück vollständig mit Matrigel bedeckt ist. 10 Minuten bei 4 °C inkubieren.
7. Mausanästhesie (2 Mäuse pro Probe, parallel arbeiten)
   1. Bereiten Sie einen 3:1-Lagerbestand einer Ketamin (100 mg/ml) und Xylazin (20 mg/ml) Anästhesielösung vor. Die empfohlene Dosis beträgt 90/6 mg/kg Körpergewicht.
   2. Wiegen Sie die Maus und ziehen Sie die notwendige Anästhesielösung in eine Einweg-Insulinspritze.
   3. Legen Sie die Maus auf das Gitter des Käfigs, ziehen Sie ihren Schwanz sanft mit einer Hand, um eine Vorwärtsbewegung zu induzieren und gleichzeitig krabbeln den Hals mit einem Prise Griff der anderen Hand. Heben Sie die Maus des Gitters und drehen Sie die halte Hand, so dass der Rücken des Tieres auf Ihrer Handfläche ruht. Immobilisieren Sie eines der Hinterbeine mit Ihrem Pinky und injizieren Sie die Betäubungsmittel intraperitoneal. Setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig und warten Sie auf die Induktion von Betäubungsmitteln.
   4. Legen Sie die anästhesierte Maus auf die Heizplatte und bedecken Sie die Augen mit Salbe, um Hornhautschäden zu vermeiden. Es wird die Tiefe der Anästhesie durch sanftes Kneifen des Hinterfußes der Maus mit chirurgischer Zange untersucht.
      HINWEIS: Bewegungsfehlende weisen auf eine tiefe Narkose hin. Jede Art von Bewegung erfordert entweder mehr Zeit für das Erreichen der gewünschten Narkotikertiefe oder eine zusätzliche Dosis an Anästhetika.
8. Chirurgischer Eingriff
   1. Bilden Sie eine Hautfalte, indem Sie den Hals der Maus kneifen und injizieren Sie den Mikrochip subkutan mit dem Applikator (Siehe Schritt 9 für Programmierdetails)
   2. Rasieren Sie die Flanken der Maus, wenn nötig (NMRI^nu/nu Mäuse müssen nicht rasieren), povidon-jod mit einem Wattestäbchen auftragen und chirurgischen Drap verwenden, um ein steriles Feld zu erstellen.
   3. Heben Sie die Haut der Flanke mit chirurgischen Zangen, machen Sie einen kleinen Schnitt von ca. 4 mm und bilden Sie eine kleine subkutane Tasche durch stumpfe Vorbereitung mit Schere.
   4. Legen Sie ein Tumorstück in jede Tasche und legen Sie es am hinteren Ende.
   5. Schneiden Sie das Ende einer 100-L-Pipette-Spitze ab und saugen Sie das restliche Matrigel aus der Petrischale ab und tragen Sie es gleichmäßig in jede Hauttasche auf.
   6. Schließen Sie die Wunden mit einfachen unterbrochenen Nähten und wenden Sie Spray-Dressing auf.
9. Scannen Sie den Mikrochip und überprüfen Sie die Gültigkeit von Maus- und Tumor-ID.
10. Bereiten Sie einen neuen Käfig mit frischer Bettwäsche und Nistmaterial sowie einem nagenden Stock vor. Falten Sie ein "Kissen" aus Papiertüchern und legen Sie die Maus mit erhöhtem Kopf unter eine Infrarot-Wärmelampe.
11. 0,25 ml Trimethoprim/Sulfamethoxazol (400 mg/80 mg) mit 100 ml Trinkwasser verrühren und über die Trinkflasche verabreichen. Beachten Sie, dass eine Maus etwa 150 ml pro kg Körpergewicht täglich verbraucht.
    HINWEIS: Da das subkutane PDX-Modell weder mit postoperativen Schmerzen, weder während des Wundheilungsprozesses noch während des Tumorauswachsens, verbunden ist, ist keine postoperative Analgesie erforderlich. Bitte beachten Sie, dass die Tierschutzrichtlinien Ihrer Institution/Behörde abweichen können.
12. Überwachung von Versuchstieren
    1. Überwachen Sie die Mäuse täglich auf Anzeichen von Not. Dies kann an qualifizierte Tierpfleger delegiert werden.
    2. Halten Sie die postoperative Antibiotika-Behandlung mit der oben genannten Dosierung für 4 Wochen. Ersetzen Sie die Antibiotika-Mischung zweimal pro Woche.
    3. Messen Sie die Tumorgröße mindestens einmal pro Woche, idealerweise täglich, mit einem Bremssattel (Tumorvolumen = 0,52 x Länge x Breite x Höhe [mm³]) und notieren Sie sich in der Datenbank.

8. PDX Ernte und Verarbeitung

1. Ernte und Verarbeitung des PDX-Tumors, wenn:
   Die Tumorgröße erreicht das Zielvolumen von 1.500 mm³.
   Das tumortragende Tier zeigt Anzeichen von Not und/oder Krankheit und eine Behandlung ist sinnlos.
   Der Tumor wird ulzeriert oder dringt in die Haut der Maus ein.
2. Lesen Sie den Mikrochip aus, um den richtigen PDX zu identifizieren.
3. Euthanisieren Sie die Maus nach einer legalen Methode(abhängig von nationalen Richtlinien) wie z.B. CO2-Asphyxierung oder Ketamin/Xylazin-Injektion, gefolgt von zervikaler Dislokation.
4. Heben Sie die Haut mit chirurgischen Zangen an den Flanken und Incise mit Metzenbaum Schere ein paar Millimeter vom Tumor entfernt.
5. Lösen Sie die Haut über dem Tumor durch stumpfe Vorbereitung, dann greifen Sie den Tumor vorsichtig mit anatomischen Zangen und lösen Sie den Tumor von der oberflächlichen Faszien des Körpers.
6. Spülen Sie den Tumor mit DPBS, legen Sie ihn in eine Petrischale und entfernen Sie das angrenzende Bindegewebe.
7. Führen Sie an dieser Stelle eine der folgenden Optionen aus:
   1. Schneiden Sie 30 mm³ Würfel und erstellen Sie neue PDX (Weiter mit Protokoll an Punkt 7.7.4).
   2. Schneiden Sie den Tumor in Scheiben, die dann auf Histologiekassetten übertragen und in 4% Formaldehyd für die spätere Paraffineinbettung konserviert werden.
   3. Bewahren Sie den Tumor in einem Rohr mit Gewebespeicherlösung auf, um ihn der Biobank hinzuzufügen (Weiter mit Protokoll in Schritt 3)und/oder erstellen Sie PDX-abgeleitete Zelllinien (Weiter mit Protokoll in Schritt 4.)

9. Biobank und Datenmanagement

1. Weisen Sie jedem Tumorfall gemäß Tabelle 1eine interne ID zu.

Tabelle 1: Definition der Stichproben-ID.

2. Bewahren Sie die Einwilligung des Patienten in elektronischer und Papierform zusammen mit der Tumor-ID auf.
3. Sammeln Sie so viele klinische Daten wie möglich und speichern Sie sie anonymisiert und separat.
4. Verwenden Sie eine Datenverwaltungssoftware (z. B. Freezerworks) oder andere und erstellen Sie eine Schnittstelle mit einer Etikettendrucksoftware, um temperaturbeständige, selbstklebende Barcode-Etiketten zu erzeugen.
5. Fügen Sie eine neue Probe hinzu, indem Sie die Datenverwaltungssoftware öffnen, den Probentyp definieren und die folgenden Informationen aufzeichnen: Tumor-ID, Gewebetyp, Gefriermethode, Datum, verantwortlicher Mitarbeiter, Durchgangsnummer, Maus-ID und Mausdehnung.
6. Weisen Sie die Proben bestimmten Positionen im Lagertank zu.
7. Ablaufverfolgung und Überwachung von PDX (Gilt für Schritt 7-8)
   1. Verwenden Sie eine MS Access-Datenbank (oder ein ähnliches System) auf einem tragbaren, Bluetooth-fähigen Gerät (Laptop oder Tablet), um Die Tumor-ID, das Datum der Implantation, das Datum der Euthanasie, das Alter und die Belastung der Maus sowie das Tumorwachstum im Laufe der Zeit aufzuzeichnen.
   2. Schließen Sie den Mikrochip-Reader an das Gerät an und lesen Sie den Mikrochip vor der Implantation aus.
   3. Weisen Sie jeder Maus eine bestimmte ID zu. Wir verwenden das folgende Schema: (siehe Tabelle 2 unten)
   4. Zeichnen Sie die ID nach der Implantation zusammen mit den Mausmerkmalen in der Datenbank auf.
   5. Lesen Sie den Mikrochip erneut aus und prüfen Sie, ob die Spezifikationen des Mikrochips, der Datenbank und des Kryotube-Etiketts konsistent sind.
   6. Erstellen Sie entsprechend eine Beschriftung für jeden Mauskäfig.
      HINWEIS: Um eine physische Unterstützung zu erstellen, kleben Sie die Kryotube-Etiketten mit den entsprechenden Mikrochip-Etiketten in ein Booklet und Notendatum und Mausdehnung.
   7. Um das Tumorwachstum des einzelnen PDX zu überwachen, scannen Sie den Mikrochip der Maus mit dem mit dem Datenbankgerät verbundenen Lesegerät, um die mit dem Sättel gemessene Tumorgröße jede Woche zu identifizieren und aufzuzeichnen.
   8. Planen Sie den idealen Zeitpunkt der PDX-Ernte, indem Sie die Wachstumskurve des Tumors analysieren.

Tabelle 2: Definition der PDX-ID.

In unseren Händen betrug die Etablierungsrate der primären Zellkulturen (Abbildung 2A & B) 12,9 % in einer großen Serie9. Die meisten Versuche, erweiterbare Tumorzellen von frischen chirurgischen resektierten Proben zu isolieren, scheiterten an einem Mangel an Wachstum oder frühzeitiger Kontamination. Die Zelllinieneinrichtung wurde nach 3 Passagen mit stetigem Wachstum unter Standardkulturbedingungen (DMEM, 10% FCS, Standardkulturgefäß) und Validierung der epitheliaalen Differenzierung mittels FACS-Analyse10als erfolgreich angesehen. Zelllinien, die von PDX-Tumoren abgeleitet wurden (Abbildung 2C & D) zeigten eine höhere Etablierungsrate von 23,6 %, was auch auf die Möglichkeit sich wiederholender Versuche im Gegensatz zu primären resektierten Tumoren9zurückzuführen ist. Einige Mischkulturen (Abbildung 2E) können jedoch nicht von fibroblastischem Wachstum befreit werden oder gehen sogar durch fibroblastisches Überwuchern verloren (Abbildung 2F).

Abbildung 2:Zellkultur. Primäre Krebszelllinien, abgeleitet aus einer Metastasierung des Dickdarmkrebsfalls HROC313, Durchgang 21 (A) und Bauchspeicheldrüsenkrebs Fall HROP88, Durchgang 5 (B). PDX-abgeleitete Krebszelllinien des Dickdarms PDX HROC285 T0 M2 (D) und der Bauchspeicheldrüse PDX HROP10 T5 M2, Durchgang 4 (E). Gemischte Kultur von Fibroblasten und Krebszellen aus Bauchspeicheldrüsenkrebs HROP75, Durchgang 8 (C) und fibroblastischem Überwucherung (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Angesichts von Änderungen im PDX-Generierungsprotokoll, verwendeten Mausstämmen und auch Experimentatoren über mehrere Jahre sowie großer Unterschiede in der Menge an Tumorgewebe, die für die Engraftierung zur Verfügung stehen, ist es nicht trivial, die Gesamterfolgsrate der PDX-Generation zu erhalten. In einer sehr aktuellen Reihe von PDX-Generierungsexperimenten, die von zwei Forschern (S.M. und F.B. durchgeführt wurden), wurden primäre Auswuchsraten von 63% für kolorektales PDX (eine beispielhafte Histologie kann aus Abbildung 3Adargestellt) und 48% für Bauchspeicheldrüsen-PDX (Abbildung 3B) beobachtet. Das Wachstum von murinen oder menschlichen Lymphomen an der Implantationsstelle ist relativ selten, kann aber erfolgreiches PDX-Auswuchs imitieren (Abbildung 3C). Neben der histopathologischen Untersuchung wurde die Übereinstimmung zwischen PDX-Modellen und ihren Spenderpatienten regelmäßig durch eine kurze Tandem-Wiederholungsanalyse (STR) bestätigt (Abbildung 3D). Bis heute umfasst die Biobank >50 primäre und >50 sekundäre kolorektale, 3 primäre und 6 sekundäre Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien sowie >150 kolorektalen und 19 Pankreas-PDX-Modellen.

Abbildung 3: Repräsentativer histologischer Vergleich von kolorektaler (A) und Pankreas-PDX (B). Humanes Lymphom an der Implantationsstelle, das PDX-Auswuchs (C) imitiert. Genetische Identitätsprüfung eines PDX-Modells (HROC430 T1 M2) am ursprünglichen Patiententumorgewebe (HROC430Tu) durch kurze Tandem-Wiederholungsanalyse (STR). Vergleich der neun STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (FAM Farbstoff) und D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX Farbstoff) mit Multiplex-PCR mit fluoreszierenden Primern nach kapillarer Elektrophorese bestätigte genetische Konkordanz des PDX und des Tumors (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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