Methodenartikel

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

DOI:

10.3791/62067

⸱

23. Dezember 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Malopolska Centre of Biotechnology, Jagiellonian University, 2Microbiology Department Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 3Department of Cardiac, Vascular and Endovascular Surgery and Transplantology, The Medical University of Silesia in Katowice, 4Silesian Centre for Heart Diseases

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Manuskript enthält ein Protokoll für die In-situ-Hybridisierungs-Kettenreaktion (HCR) in Verbindung mit Immunfluoreszenz zur Visualisierung des schweren akuten Atemwegssyndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in Zelllinie und dreidimensionalen (3D) Kulturen des menschlichen Atemwegsepithels. Die Methode ermöglicht eine hochspezifische und sensible Visualisierung viraler RNA, indem sie sich auf HCR stützt, die durch Diesonlokalisierung initiiert werden. Split-Initiator-Sonden helfen, das Signal durch fluoreszierend markierte Verstärker zu verstärken, was zu einer vernachlässigbaren Hintergrundfluoreszenz in der konfokalen Mikroskopie führt. Etikettierverstärker mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen erleichtern die gleichzeitige Erkennung verschiedener Targets. Dies wiederum ermöglicht die Kartierung der Infektion in Geweben, um die virale Pathogenese und Replikation auf einzelzellarer Ebene besser zu verstehen. Die Kopplung dieser Methode mit der Immunfluoreszenz kann ein besseres Verständnis der Wirts-Virus-Wechselwirkungen erleichtern, einschließlich einer Abwechslung des Wirtsepigenoms und der Immunantwortwege. Dank der sensiblen und spezifischen HCR-Technologie kann dieses Protokoll auch als Diagnosetool verwendet werden. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Technik leicht modifiziert werden kann, um den Nachweis von RNA zu ermöglichen, einschließlich nicht-kodierender RNAs und RNA-Viren, die in der Zukunft entstehen könnten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SARS-CoV-2 ist ein neuartiges humanes Betacoronavirus, das Ende 2019 auftauchte und wenige Monate später eine beispiellose Pandemie verursachte. Da das Virus neu in der Wissenschaft ist, bleibt ein Großteil seiner Biologie und seiner Auswirkungen auf Wirtszellen unbekannt. Daher ist die Kartierung der Virus-Zell- und -Gewebetropismus während der Infektion wichtig, wenn ihre grundlegenden biologischen Eigenschaften und ihre Auswirkungen auf den Wirt zu verstehen sind. Mehrere Techniken werden verwendet, um das Zusammenspiel von Virus-Host zu untersuchen, einschließlich biochemischer, biologischer und physikalischer Assays. In-situ-Hybridisierung ist eine gängige Methode, die markierte komplementäre DNA,RNA oder modifizierte Nukleinsäuresonden verwendet, die sich auf bestimmte DNA- oder RNA-Sequenzen in einer Zelle oder einem Gewebe lokalisieren.

Es wurde eine neue RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungsmethode (RNA-FISH) entwickelt, die Modifikationen zur Erhöhung der Empfindlichkeit durch Verstärkung des Signal-Rausch-Verhältnisses über ein HCR1enthält. HCR ermöglicht die Untersuchung der RNA-Lokalisierung auf einzelliger Ebene. Aufgrund ihrer hohen Spezifität, Empfindlichkeit und Auflösung ist diese Methode nicht nur für wissenschaftliche Grundlagenstudien nützlich, sondern auch für Applikationsprojekte, z. B. Diagnostik. Kürzlich wurde die Machbarkeit dieser Methode für den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA demonstriert, die lokalisiert ist, um Ciliated-Zellen in vollständig differenzierten 3D-Human-Atemwegsepithel-Kulturen (HAE)-Kulturen2. HAE-Kulturen stellen eines der fortschrittlichsten Werkzeuge zur Untersuchung von Virusinfektionen im Kontext der Mikroumgebung "natürliche Infektion"3,4dar.

Mehrere Berichte über humane Coronaviren (HCoV), einschließlich SARS-CoV-2, unterstreichen die Bedeutung epigenetischer Modifikationen in Bezug auf HCoV-Infektion und Pathophysiologie [überprüft in 5], z. B. das Methylierungsmuster des Gens, das das Angiotensin-convertierende Enzym 2 (ACE-2)-Rezeptor6,7kodiert. Interessanterweise identifizierte das massenspektrometrische Screening mehrere epigenetische Faktoren, die mit dem SARS-CoV-2-Proteom8interagieren. Genauer gesagt bindet das nichtstrukturelle Protein 5 (NSP5) an den epigenetischen Regulator, Histondeacetylase 2, und das katalytisch inaktive NSP5 (C145A) interagiert mit tRNA-Methyltransferase 1 (24). Zusätzlich wird die NSP16-Methyltransferase-Aktivität durch den Methyltransferase-Inhibitor Sinefungin9blockiert. Die genaue Rolle dieser epigenetischen Faktoren bei COVID-19 bleibt jedoch unklar. Die Replikation von HCoV erfolgt im Zytoplasma der infizierten Zelle und löst Entzündungsreaktionen aus, die durch epigenetische Modifikationen reguliert werden10.

Zum Beispiel verfeinert HCoV-229E die Atomfaktor-Kappa B-Signalisierung und programmiert die hostzelluläre Chromatinlandschaft tiefgreifend um, indem die Acetylierung von H3K36 und H4K5 in bestimmten Regionen erhöht wird11. Die mit dem Middle East respiratorische Syndrom zusammenhängende Coronavirus-Infektion erhöht den Gehalt an H3K27me3 und erschöpft H3K4me3 in den Promotorregionen von Teilmengen spezifischer interferonempfindlicher Gene12. Zusätzlich löst virale RNA Immunreaktionen aus, wie bei den Flaviviren13, Retroviren14,15und Coronaviren16nachgewiesen. Die epigenetischen Marker auf viraler RNA können eine Rolle bei der Erkennung durch zelluläre Sensoren spielen, wie für die m7A-Methylierung des humanen Immundefizienzvirus-1-RNA17gezeigt. Es bleiben jedoch Fragen: Welche Auswirkungen hat SARS-CoV-2 RNA auf die Immunantwort, und sind epigenetische Markierungen beteiligt?

Hier wurde eine optimierte RNA-FISH-Methode in Verbindung mit der Immunfluoreszenzanalyse von Zelllinien und 3D-Geweben (voll differenzierte se) beschrieben. Obwohl zytologische Methoden wie FISH und Immunfluoreszenz weit verbreitet sind, wurde diese auf HCR basierende In-situ-Hybridisierungsmethode der neuen Generation nie für den Virennachweis verwendet (außer in einer kürzlich veröffentlichten Publikation)2. Im Allgemeinen erfordern Immunfärbung und FISH die folgenden Schritte: Permeabilisierung, um das Eindringen von Sonden oder Antikörpern zu ermöglichen; Fixierung, bei der zelluläres Material fixiert und konserviert wird; Nachweis, bei dem Antikörper oder Nukleinsäuresonden aufgetragen werden; und schließlich Montage der Proben zur Visualisierung.

Obwohl bestehende Protokolle diese allgemeinen Funktionen gemeinsam nutzen, unterscheiden sie sich in Bezug auf die beteiligten Parameter deutlich. Hier wurde ein optimiertes, einfaches Immun-RNA-FISH-Protokoll zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in HAE-Kulturen und Vero-Zellen beschrieben. Die Technik umfasst die folgenden Schritte: (1) Fixierung von Zellen mit Paraformaldehyd; (2) Permeabilisation mit Waschmittel oder Methanol (MeOH); (3) Rehydratation durch eine abgestufte Reihe von MeOH-Lösungen (nur HAE-Kulturen); (4) Erkennung; (5) Amplifikation mit HCR-Technologie zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA; (6) Immunfärbung; und (7) Bildgebung unter einem konfokalen Mikroskop.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Puffervorbereitung

  1. Für 500 ml 2x PHEM-Puffer 18,14 g Piperazin-N,N-Bis(2-Ethansulfonsäure) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethansulfonsäure (HEPES), 3,8 g Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) und 0,99 g Magnesiumsulfat (MgSO4) kombinieren Machen Sie das Volumen bis zu 400 ml mit destilliertem Wasser (dH2O), rühren sie und stellen Sie den pH-Wert mit 10 M Kaliumhydroxid (KOH) oder Natriumhydroxid (NaOH) auf 7,0 ein. Machen Sie das Endvolumen bis zu 500 ml, und dann in 50 ml Aliquots aufgeteilt. Bei -20 °C lagern, bis erforderlich.
    HINWEIS: Der Puffer ist erst klar, wenn der pH-Wert 7,0 erreicht.
  2. Bereiten Sie eine Lagerlösung von 37% w/v Paraformaldehyd (PFA) vor. Für 50 ml 18,5 g PFA und 35 ml dH2O in einer Glasflasche mischen. Legen Sie die Flasche auf einen Magnetischen Rührer mit Heizung. Fügen Sie 900 L von 1 M KOH oder NaOH hinzu und rühren Sie, bis die Lösung klar wird. Abkühlen lassen und in ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr geben; aufladen bis zu 50 ml mit dH2O. Die Lösung kann bei -20 °C gelagert werden, bis erforderlich.
    HINWEIS: Formaldehyd sollte in einer Dunstabzugshaube behandelt werden, während Schutzhandschuhe und ein Labormantel getragen werden.
  3. Vorbereiten des Fixationspuffers (3,7 % PFA gepuffert mit PHEM). Für 50 ml 5 ml 5 ml 37% PFA-Lösung, 25 ml 2x PHEM-Puffer und 20 ml dH2O in einem 50 ml konischen Zentrifugenrohr kombinieren. Bei -20 °C lagern, bis erforderlich.
    HINWEIS: Nach dem Auftauen kann der Puffer bis zu 3 Monate bei 4 °C gelagert werden.
  4. PBST vorbereiten (0,1% Tween-20 in 1x Phosphat-gepufferter Saline [PBS]). Für 50 ml 50 l von 100 % Tween-20 bis 50 ml 1x PBS hinzufügen und gut mischen.
    HINWEIS: Die Lösung kann bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.
  5. Bereiten Sie Rehydrierungspuffer vor, indem Sie MeOH/PBST in Verhältnissen von 3:1, 1:1 und 1:3 kombinieren (Endvolumen von jeweils 100 ml; siehe Tabelle 1).
    HINWEIS: MeOH ist sehr giftig und brennbar. Da es den Sehnerv beschädigen kann, sollte es in einer Dunstabzugshaube behandelt werden, um offene Flammen zu vermeiden. Da das Mischen von MeOH und PBST eine exotherme Reaktion erzeugt, kombinieren Sie die Lösungen auf Eis.
  6. Für 1000 ml 20x SSC 175,3 g Natriumchlorid (NaCl) und 88,2 g Natriumcitrat in einem Becher glasieren und mit 800 ml dH2O. rühren, bis es gelöst ist, und den pH-Wert mit NaOH auf 7,2 einstellen. Fügen Sie dH2O zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml hinzu und autoklavieren oder filtern Sie durch einen 0,22 m Filter in eine autoklavierte Flasche.
  7. Für 50 ml 5x SSCT 12,5 ml 20x SSC-Puffer mit 37,5 ml dH2O kombinieren und 50 l von 100% Tween-20 hinzufügen. Gut mischen.
  8. Für 50 ml 50% 5x SSCT/50% PBST, kombinieren 25 ml 5x SSCT mit 25 ml PBST.
  9. Für 50 ml 2x SSC 5 ml 10x SSC Puffer mit 45 ml dH2O mischen gut kombinieren.
    HINWEIS: Alle SSC-Puffer sollten bei RT im Dunkeln gespeichert werden.

2. Zieldefinition, Sonden und Verstärker

  1. Verwenden Sie die auf der Website des Herstellers verfügbaren Tools, um Verstärker und Sonden zu entwerfen. Stellen Sie sicher, dass die Sonden den umgekehrten DNA-Strang des SARS-CoV-2 N-Gens ergänzen (Ergänzende Abbildung 1).
  2. Bestimmen Sie die beste Sondensatzgröße (ein Satz von 20 Prüfstons ist für die Visualisierung ausreichend).
  3. Stellen Sie die Verstärker ein, die für die Ziel-RNA-Erkennung verwendet werden.
    1. Verwenden Sie den HCR-Verstärker B1 mit Alexa Fluor 647 beschriftet.
      HINWEIS: Ein HCR-Verstärker besteht aus metastabilen HCR-Haarnadeln h1 und h2. Multiplex-Experimente können mit diesem Protokoll entwickelt werden. Wenn dies geplant ist, wählen Sie einen anderen HCR-Verstärker (B1, B2, ...) für jede Ziel-RNA, die innerhalb derselben Probe abgebildet werden soll (z. B. Verstärker B1 für Ziel 1, Verstärker B2 für Ziel 2, ...).

3. Zellkultur und Infektion mit SARS-CoV-2

  1. Kultur Vero (Affennierenepithelzellen) Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 5% fetales Rinderserum enthält.
    1. Säen Sie 50.000 Zellen auf Deckscheiben (Nr. 1, 15 × 15 mm) in einer 12-Well-Platte.
  2. Bereiten Sie vollständig differenzierte HAE-Kulturen wie beschrieben18 auf durchlässigen Transwell-Insert-Stützen mit einer Membran (Durchmesser = 6,5 mm) und Kultur in bronchialen epithelialen Wachstumsmedium bis vollständig konfluent.
  3. Virusinfektion
    1. Impfzellen mit SARS-CoV-2 bei 1000x mittlerer Gewebekultur-Infektiöse Dosis (TCID50) pro ml
    2. Inkubieren Sie Zellen für 2 h bei 37 °C.
    3. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS, um ungebundene Viren zu entfernen.
    4. Kulturzellen für 48 h.

4. SARS-CoV-2 RNA-FISH in Vero-Zellen auf Deckellips kultiviert

TAG 1

  1. Fixierung und Permeabilisierung von Zellen
    1. Fix infizierte Zellen mit 3.7% w/v PFA-Lösung für 1 h bei RT.
    2. Saugen Sie die 3,7% PFA-Lösung an und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
    3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBST-Lösung für 10 min bei RT mit Agitation.
    4. Aspirieren Sie die PBST, und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
  2. Erkennung
    1. Die 1x PBS-Lösung aspirieren und die Zellen zweimal mit 2x SSC bei RT waschen.
    2. Aspirieren Sie die 2x SSC-Lösung, und prähybridisieren Sie die Samples, indem Sie mindestens 300 L Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen. Bedecken Sie die Brunnen, die die Zellen enthalten, und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min.
    3. Bereiten Sie die Sondenlösung vor, indem Sie dem Sondenhybridisierungspuffer 1,2 pmol Sondenmischung hinzufügen.
      1. Verwenden Sie 1,2 l des 1-M-Sondenbestands, um 300 L Arbeitsbestand vorzubereiten.
    4. Entfernen Sie die Vorhybridisierungslösung, und übertragen Sie die Abdeckungen in eine befeuchtete Kammer.
      1. Pipette 30-50 l der Sondenlösung auf Parafilm, um einzelne Tröpfchen zu bilden.
    5. Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) bei 37 °C.

      TAG 2
    6. Die Abdeckungen wieder in eine 12-Well-Platte geben und überschüssige Sondenlösung entfernen, indem Sie 4 x 5 min mit 400 l Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen.
      ANMERKUNG: Als Alternative zur Platzierung von 30-50 l Aliquots auf Parafilm und unter Deckscheiben für die Inkubation, fügen Sie 300 l Sondenlösung direkt zu Denlips in einer 12-Well-Platte hinzu. Dieses Verfahren ist einfacher, erfordert aber erhebliche Mengen an Reagenzien. Den Sondenwaschpuffer vor Gebrauch auf 37 °C erhitzen. Berechnen Sie die benötigte Puffermenge, und übertragen Sie sie in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr.
    7. Proben für 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT waschen.
    8. Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS, und lagern Sie die Proben bei 4 °C bis zur Verstärkung.
  3. Verstärkung
    1. Entfernen Sie die 1x PBS-Lösung aus den Brunnen, und fügen Sie jedem Bohrspeicher mindestens 300 L Verstärkungspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 30 min bei RT.
    2. Bereiten Sie jede HCR-Haarnadel (h1 und h2) vor, indem Sie das gewünschte Volumen in separaten Rohren abkühlen.
      1. Um 300 l Amplifikationslösung vorzubereiten, verwenden Sie 18 pmol jeder Haarnadel (z. B. für 300 l, verwenden Sie 6 l einer 3-M-Stammhaarnadellösung).
      2. Übertragen Sie die Haarnadellösung in Tuben.
      3. Bei 95 °C für 90 s inkubieren.
      4. Abkühlen auf RT für 30 min im Dunkeln.
    3. Bereiten Sie eine Haarnadelmischung vor, indem Sie dem Amplifikationspuffer die snap-gekühlten Haarnadeln "h1" und "h2" hinzufügen.
    4. Tropfen von 30-50 l Haarnadelmischung auf Parafilm legen.
    5. Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) im Dunkeln bei RT.

      TAG 3
    6. Übertragen Sie die Abdeckungen zurück in die 12 Well Platte, und entfernen Sie überschüssige Haarnadeln durch Waschen für 5 x 5 min mit 5x SSCT bei RT mit Rührung.
    7. Aspirieren Sie den 5x SSCT-Puffer und ersetzen Sie ihn durch 1x PBS.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenztest, gefolgt von der Färbung von Kernen (siehe Abschnitt 5).
  4. Nukleare Färbung und Gleitmontage
    1. Die 1x PBS-Lösung aspirieren und in 1x PBS-Lösung durch 4x,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 0,2 g/ml) ersetzen.
    2. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.
    3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
    4. Legen Sie zwei Tropfen von je 10 L DesMontagemedium; Stellen Sie sicher, dass die Tropfen so weit voneinander getrennt sind, dass zwei Abdeckungen auf einem einzigen Dia platziert werden können.
    5. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Abdeckungen auf ein sauberes Handtuch tippen, und legen Sie sie dann in Antifade-Montagemedium mit den Zellen nach unten.
    6. Die montierten Proben auf eine trockene, flache Oberfläche im Dunkeln stellen und aushärten lassen.
    7. Nach der Aushärtung die Kanten der Abdeckungen mit VALAP-Dichtstoff oder Nagellack versiegeln, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.

5. SARS-CoV-2 RNA-FISH in HAE-Kulturen

TAG 1

  1. Fixierung und Durchlässigkeit der HAE-Kultur
    1. Aspirieren Sie das Medium, und fixieren Sie die infizierten Zellen mit 3,7% PFA-Lösung für 1 h bei RT.
    2. Die 3,7%-PFA-Lösung ansaugen und die Zellen zweimal mit 1x PBS waschen.
      1. Ersetzen Sie die 3,7% PFA-Lösung durch 1x PBS unter einem Transwell-Einsatz.
    3. Entsorgen Sie die PBS, und dehydrieren Sie die Proben mit 2 x 5 min Wähwürn mit 100% MeOH vorgekühlt auf -20 °C.
    4. Nach der zweiten Wäsche den Puffer durch frisches, gekühltes MeOH zur Permeabilisierung unter dem Transwell-Einsatz ersetzen. Über Nacht bei -20 °C lagern.

TAG 2

  1. Rehydration
    Rehydratisieren Sie die Proben durch eine abgestufte Reihe von MeOH/PBST-Lösungen (jeweils für 5 min) auf Eis: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS und 100% PBST (zweimal).
    1. Waschen Sie die Zellen für 5 min auf Eis mit 50% 5x SSCT/50% PBST.
    2. Waschen Sie Zellen für 5 min auf Eis mit 5x SSCT.
    3. Ersetzen Sie den 5x SSCT-Puffer durch 1x PBS.
  2. Erkennung
    1. Inkubieren Sie die Zellen (innerhalb des Transwell-Einsatzes) für 5 min auf Eis mit 100 l Sondenhybridisierungspuffer. Als nächstes übertragen Sie die Platte für 30 min bei 37 °C (Vorhybridisierung) in den Inkubator.
      HINWEIS: Der Sondenhybridisierungspuffer muss vor Gebrauch auf 37 °C vorgeheizt werden. Berechnen Sie das benötigte Volumen: Für einen einzelnen Transwell-Einsatz werden 100 l benötigt.
    2. Bereiten Sie die Prüfpunktlösung vor. Da 1 ml Sondenlösung 4 pmol Sonde benötigt, 4 L von 1 'M Sondenlagerlösung zu 1 ml Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen und gut mischen.
      HINWEIS: Für die RNA-Erkennung verwenden Sie 100 L Sondenlösung pro Transwell-Einsatz. Lassen Sie die Sondenlösung bis zum Ende des Vorhybridisierungsschritts auf Eis.
    3. Entfernen Sie die Prähybridisierungslösung, und fügen Sie die Prüfpunktlösung hinzu.
    4. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht (12-18 h) bei 37 °C.

      TAG 3
    5. Überschüssige Sonde entfernen, indem Sie 4 x 15 min mit 100 l Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen.
    6. Waschen Sie die Proben für 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT.
    7. Ersetzen Sie den 5x SSCT durch 1x PBS, und lagern Sie die Proben bei 4 °C bis zur Verstärkung.
  3. Verstärkung
    1. Präamplify die Proben durch Inkubation mit Verstärkungspuffer für 30 min bei RT.
    2. Bereiten Sie jede Haarnadel vor, indem Sie die gewünschten Volumina in separaten Rohren abkühlen.
      1. Um eine Amplifikationslösung von 500 l zu erstellen, verwenden Sie 30 pmol jeder Haarnadel (z. B. für 500 l, 10 l von 3 'M Stammhaarnadellösung).
      2. Übertragen Sie die Haarnadellösung in die Schläuche.
      3. Bei 95 °C für 90 s inkubieren.
      4. Abkühlen auf RT für 30 min im Dunkeln.
    3. Bereiten Sie die Haarnadellösung vor, indem Sie alle snap-cooled Haarnadeln zu 500 l Verstärkungspuffer bei RT hinzufügen.
    4. Entfernen Sie die Vorverstärkungslösung, und fügen Sie die komplette Haarnadellösung hinzu.
    5. Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) bei RT im Dunkeln.
    6. Entfernen Sie überschüssige Haarnadeln, indem Sie mit 5x SSCT bei RT wie folgt waschen: 2 x 5 min, 2 x 15 min und 1 x 5 min.
    7. Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS, und lagern Sie sie bei 4 °C für nicht mehr als 2-3 Tage oder gehen Sie direkt zur nuklearen Färbung über.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenztest, gefolgt von nuklearer Färbung (siehe Abschnitt 6).
  4. Nukleare Färbung und Gleitmontage
    1. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch eine DAPI-Lösung (0,2 g/ml) in 1x PBS.
    2. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.
    3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
    4. Legen Sie die Ausgeschnittenmembran der Transwell-Einsätze auf 10 l Antifade-Montagemedium mit nach oben gerichteten Zellen und fügen Sie der Membran zusätzliches Montagemedium (5 l) hinzu.
    5. Bedecken Sie die Membranen mit Abdeckungen.
    6. Härten Sie die montierten Proben auf einer trockenen, flachen Oberfläche im Dunkeln.
    7. Nach der Aushärtung die Kanten der Abdeckungen mit VALAP-Dichtstoff oder Nagellack versiegeln, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.

6. Immunfluoreszenzanalyse von Vero-Zellen und HAE-Kulturen

HINWEIS: Führen Sie den Immunfluoreszenztest am 3. Tag für Zelllinien oder Tag 4 für HAE-Kulturen durch. Verwenden Sie für jedes Modell einen anderen Ansatz. Alle Unterschiede sind deutlich gekennzeichnet.

  1. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung aus den Brunnen.
  2. Blockieren Sie die Proben durch Inkubation mit 1% w/v Rinderserumalbumin in PBST-Lösung für 30 min bei 37 °C.
  3. Bereiten Sie primäre Antikörper vor, indem Sie geeignete Verdünnungen in der Blockierlösung vorbereiten und inkubieren.
    1. Für Vero-Zellen auf Abdeckungen:
      1. Tropfen (30-50 l) der Antikörperlösung auf Parafilm in eine Feuchtigkeitskammer geben.
      2. Legen Sie Coverlips auf die Antikörpertropfen mit nach unten gerichteten Zellen.
    2. Ersetzen Sie bei HAE das Blockiermittel in den Einsätzen durch eine Antikörperlösung (100 l), und inkubieren Sie die Proben in einer befeuchteten Kammer.
      HINWEIS: Passen Sie die Zeit und Temperatur für jede Inkubation mit primärem Antikörper an. Typische Parameter sind 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C.
  4. Waschen Sie die Proben 3 x 5 min mit PBST.
    1. Für Zellen auf Deckellipse auf eine 12-Well-Platte übertragen und PBST-Lösung hinzufügen.
    2. Ersetzen Sie bei HAE-Kulturen die Antikörperlösung durch eine PBST-Lösung.
  5. Überprüfen Sie die Lichtquellen und Filter, die für das konfokale Mikroskop verfügbar sind.
  6. Wählen Sie sekundäre Antikörper nach der Wirtsart. Wählen Sie die Fluorophorparameter (Erregungs- und Emissionswellenlängen, Spektrumbreite und Anregungseffizienz entsprechend der verfügbaren Lichtquelle).
    HINWEIS: Spektralparameter können mit Online-Tools modelliert werden (siehe Materialtabelle).
  7. Bereiten Sie geeignete Sekundärantikörperlösungen vor, indem Sie sie mit einer BlockierenderLösung verdünnen.
  8. Mit sekundären Antikörpern inkubieren (wie in 6.3), aber 1 h bei 37 °C inkubieren.
  9. Waschen Sie die Proben wie in Schritt 6.4.
  10. Nukleare Färbung und Gleitmontage
    1. Für Zellen auf Deckellips
      1. Aspirieren Sie den PBST, und ersetzen Sie ihn durch DAPI (0,2 g/ml) in 1x PBS-Lösung.
      2. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.
      3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
      4. Legen Sie die Abdeckungen auf Tropfen von 10 L Montagemedium mit nach unten gerichteten Zellen.
      5. Versiegeln Sie die Coverlips mit Nagellack.
    2. Für HAE-Kulturen
      1. Aspirieren Sie den 1x PBST, und ersetzen Sie ihn durch DAPI (0,2 g/ml) in 1x PBS-Lösung.
      2. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.
      3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
      4. Legen Sie die ausgeschnittenen Membranen auf Tropfen von 10 l Montagemedium mit nach oben gerichteten Zellen und fügen Sie der Membran zusätzliches (5 l) Montagemedium hinzu.
      5. Bedecken Sie die Membranen mit Abdeckungen.
      6. Versiegeln Sie die Coverlips mit Nagellack.

7. Konfokale Mikroskopie

  1. Definieren Sie die Spuren, indem Sie die verwendeten Fluorophore angeben.
  2. Wählen Sie den Scanmodus und die Geschwindigkeit aus.
  3. Passen Sie die Laserleistung, Verstärkung und Offset-Werte für jedes Fluorophor an, indem Sie sie mit den jeweiligen Negativkontrollen vergleichen: für Virus-, Mock-infizierte Zellen; für zelluläre Proteine, Proben, die mit Isotypkontrollantikörpern von einem geeigneten Wirt gefärbt sind.
  4. Um ein 3D-Bild zu erfassen, aktivieren Sie den Z-Stack-Modus, und legen Sie die oberen und unteren Grenzwerte fest. Legen Sie die Schrittgröße/-zahl fest.
    HINWEIS: Weitere Informationen zur Coronavirus-Bildgebung finden Sie unter19.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das in diesem Manuskript beschriebene Immun-RNA-FISH-Protokoll wurde mit zwei zellulären Systemen durchgeführt: einer Vero-Zelllinie und einer 3D-HAE-Kultur. Die wichtigsten Schritte für beide Zellmodelle sind in Tabelle 2dargestellt. Das RNA-FISH-Protokoll zur Visualisierung von SARS-CoV-2 in HAE-Kulturen umfasst Schritte, die typisch für Gewebeproben sind, d.h. Permeabilisation mit 100% MeOH und Rehydrierung durch eine abgestufte Reihe von MeOH-PBS- und 0,1% Tween-Lösun...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immuno-RNA-FISH ist eine zuverlässige Methode zur Doppelfärbung von RNA und zellulären Proteinen. Hier wurde ein modifiziertes Immun-RNA-FISH-Protokoll beschrieben, das den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA und zellulären Proteinen in Zelllinien und HAE-Kulturen ermöglicht. Dieses Protokoll kann für den Einsatz in verschiedenen Zellmodellen angepasst werden, einschließlich Zellmonolayern oder spezifischen Geweben. Die Methode basiert auf dem Konzept eines HCR, das durch entsprechende Sondenlokalisierung initiiert wird. Als näc...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung für die Forschung zu SARS-CoV-2 und durch Stipendien des National Science Center (Stipendien UMO2017/27/B/NZ6/02488 an K.P. und UMO-2018/30/E/NZ1/00874 an A.K.-P.) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung
Konfokalmikroskop LSM 880ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- ShakerFisher Scientific12965501
Inkubator Galaxy170RNew BrunswickCO170R-230-1000
Thermomixer ComfortEppendorf5355 000 011
Materialien
15 mm x 15 mm Nr. 1 DeckgläserLabSolute7695022
1,5 mL RöhrchenFL-MEDICAL5.350.023.053
12-Well-PlatteTTP92412
Konisches ZentrifugenröhrchenSarstedt5.332.547.254
ParafilmSigmaP7793-1EA
serologische PipettenVWR Collection612-5523P, 612-5827P
ObjektträgerglasPTH CHEMLAND04-296.202.03
Transwell ThinCertsGrainer bio-one665641
Reagenzien
Alexa Fluorophor 488-konjugierte Sekundärantikörper Invitrogen
& beta; 5-Tubulin Santa Cruz Biotechnologie sc-134234
DAPIThermo ScientificD1306
DinatriumphosphatSigmaS51136-500G
EGTABioShopEGT101.25
HCR AmplifikationspufferMolecular Instruments, Inc.BAM01522Puffer kann auch vorbereitet werden doi:10.1242/dev.165753: Ergänzende Informationen
HCR-Verstärker B1-h1 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.
HCR-Verstärker B1-h2 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.
HCR-Sonden-HybridisierungspufferMolecular Instruments, Inc.BPH03821Puffer kann auch hergestellt werden doi:10.1242/dev.165753: Ergänzende Informationen
HCR-Sondenset für SARS-CoV-2 NcapsidMolecular Instruments, Inc.PRE134
HCR-SondenwaschpufferMolecular Instruments, Inc.BPW01522Puffer kann auch hergestellt werden doi:10.1242/dev.165753: Ergänzende Informationen
HEPESBioShopHEP001.100
Magnesiumsulfat HeptahydratSigma63138-250G
MethanolSigma32213-1L-M
MonokaliumphosphatSigmaP5655-100G
ParaformaldehydSigmaP6148-1KG
ROHREBioShopPIP666.100
KaliumchloridSigmaP5405-250G
Prolong Diamond Antifade EinbettmediumInvitrogenP36970
NatriumchloridBioShopSOD001.5
Trinatriumcitrat 2-HydratPOCH 6132-04-3
Tween-20BioShopTWN580.500
Software
Fluoreszenz-SpektroviewerModellierung von Spektralparametern
ImageJ FijiAufnahme und Verarbeitung von Z-Stack-Bildern
S013922S012522

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
  3. Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
  4. Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
  5. El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118(2020).
  6. Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
  7. Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
  8. Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
  9. Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
  10. Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
  11. Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286(2017).
  12. Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8(2017).
  13. Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889(2019).
  14. Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
  15. Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
  16. Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
  17. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830(2017).
  18. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  19. Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

SARS CoV 2 VisualizationImmuno RNA FISHIn Situ HybridizationHybridization Chain ReactionViral RNA DetectionHuman Airway EpitheliumConfocal MicroscopyImmunofluorescence LabelingSingle Cell AnalysisProtein RNA Interactions

Verwandte Artikel