Methodenartikel

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

DOI:

10.3791/62067

⸱

23. Dezember 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Malopolska Centre of Biotechnology, Jagiellonian University, 2Microbiology Department Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 3Department of Cardiac, Vascular and Endovascular Surgery and Transplantology, The Medical University of Silesia in Katowice, 4Silesian Centre for Heart Diseases

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript enthält ein Protokoll für die In-situ-Hybridisierungs-Kettenreaktion (HCR) in Verbindung mit Immunfluoreszenz zur Visualisierung des schweren akuten Atemwegssyndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in Zelllinie und dreidimensionalen (3D) Kulturen des menschlichen Atemwegsepithels. Die Methode ermöglicht eine hochspezifische und sensible Visualisierung viraler RNA, indem sie sich auf HCR stützt, die durch Diesonlokalisierung initiiert werden. Split-Initiator-Sonden helfen, das Signal durch fluoreszierend markierte Verstärker zu verstärken, was zu einer vernachlässigbaren Hintergrundfluoreszenz in der konfokalen Mikroskopie führt. Etikettierverstärker mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen erleichtern die gleichzeitige Erkennung verschiedener Targets. Dies wiederum ermöglicht die Kartierung der Infektion in Geweben, um die virale Pathogenese und Replikation auf einzelzellarer Ebene besser zu verstehen. Die Kopplung dieser Methode mit der Immunfluoreszenz kann ein besseres Verständnis der Wirts-Virus-Wechselwirkungen erleichtern, einschließlich einer Abwechslung des Wirtsepigenoms und der Immunantwortwege. Dank der sensiblen und spezifischen HCR-Technologie kann dieses Protokoll auch als Diagnosetool verwendet werden. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Technik leicht modifiziert werden kann, um den Nachweis von RNA zu ermöglichen, einschließlich nicht-kodierender RNAs und RNA-Viren, die in der Zukunft entstehen könnten.

Einleitung

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SARS-CoV-2 ist ein neuartiges humanes Betacoronavirus, das Ende 2019 auftauchte und wenige Monate später eine beispiellose Pandemie verursachte. Da das Virus neu in der Wissenschaft ist, bleibt ein Großteil seiner Biologie und seiner Auswirkungen auf Wirtszellen unbekannt. Daher ist die Kartierung der Virus-Zell- und -Gewebetropismus während der Infektion wichtig, wenn ihre grundlegenden biologischen Eigenschaften und ihre Auswirkungen auf den Wirt zu verstehen sind. Mehrere Techniken werden verwendet, um das Zusammenspiel von Virus-Host zu untersuchen, einschließlich biochemischer, biologischer und physikalischer Assays. In-situ-Hybridisierung ist eine gängige Method....

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Protokoll

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1. Puffervorbereitung

  1. Für 500 ml 2x PHEM-Puffer 18,14 g Piperazin-N,N-Bis(2-Ethansulfonsäure) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethansulfonsäure (HEPES), 3,8 g Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) und 0,99 g Magnesiumsulfat (MgSO4) kombinieren Machen Sie das Volumen bis zu 400 ml mit destilliertem Wasser (dH2O), rühren sie und stellen Sie den pH-Wert mit 10 M Kaliumhydroxid (KOH) oder Natriumhydroxid (NaOH) auf 7,0 ein. Machen Sie das Endvolumen bis zu 500 ml, und dann in 50 ml Aliquots aufgeteilt. Bei -20 °C lagern, bis erforderlich.
    HINWEIS: Der Puffer ist erst klar, wenn der pH-Wert 7,0 erreicht.
  2. Bere....

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Ergebnisse

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Das in diesem Manuskript beschriebene Immun-RNA-FISH-Protokoll wurde mit zwei zellulären Systemen durchgeführt: einer Vero-Zelllinie und einer 3D-HAE-Kultur. Die wichtigsten Schritte für beide Zellmodelle sind in Tabelle 2dargestellt. Das RNA-FISH-Protokoll zur Visualisierung von SARS-CoV-2 in HAE-Kulturen umfasst Schritte, die typisch für Gewebeproben sind, d.h. Permeabilisation mit 100% MeOH und Rehydrierung durch eine abgestufte Reihe von MeOH-PBS- und 0,1% Tween-Lösun.......

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Diskussion

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Immuno-RNA-FISH ist eine zuverlässige Methode zur Doppelfärbung von RNA und zellulären Proteinen. Hier wurde ein modifiziertes Immun-RNA-FISH-Protokoll beschrieben, das den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA und zellulären Proteinen in Zelllinien und HAE-Kulturen ermöglicht. Dieses Protokoll kann für den Einsatz in verschiedenen Zellmodellen angepasst werden, einschließlich Zellmonolayern oder spezifischen Geweben. Die Methode basiert auf dem Konzept eines HCR, das durch entsprechende Sondenlokalisierung initiiert wird. Als näc.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung für die Forschung zu SARS-CoV-2 und durch Stipendien des National Science Center (Stipendien UMO2017/27/B/NZ6/02488 an K.P. und UMO-2018/30/E/NZ1/00874 an A.K.-P.) unterstützt.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung
Konfokalmikroskop LSM 880ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- ShakerFisher Scientific12965501
Inkubator Galaxy170RNew BrunswickCO170R-230-1000
Thermomixer ComfortEppendorf5355 000 011
Materialien
15 mm x 15 mm Nr. 1 DeckgläserLabSolute7695022
1,5 mL RöhrchenFL-MEDICAL5.350.023.053
12-Well-PlatteTTP92412
Konisches ZentrifugenröhrchenSarstedt5.332.547.254
ParafilmSigmaP7793-1EA
serologische PipettenVWR Collection612-5523P, 612-5827P
ObjektträgerglasPTH CHEMLAND04-296.202.03
Transwell ThinCertsGrainer bio-one665641
Reagenzien
Alexa Fluorophor 488-konjugierte Sekundärantikörper Invitrogen
& beta; 5-Tubulin Santa Cruz Biotechnologie sc-134234
DAPIThermo ScientificD1306
DinatriumphosphatSigmaS51136-500G
EGTABioShopEGT101.25
HCR AmplifikationspufferMolecular Instruments, Inc.BAM01522Puffer kann auch vorbereitet werden doi:10.1242/dev.165753: Ergänzende Informationen
HCR-Verstärker B1-h1 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.
HCR-Verstärker B1-h2 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.
HCR-Sonden-HybridisierungspufferMolecular Instruments, Inc.BPH03821Puffer kann auch hergestellt werden doi:10.1242/dev.165753: Ergänzende Informationen
HCR-Sondenset für SARS-CoV-2 NcapsidMolecular Instruments, Inc.PRE134
HCR-SondenwaschpufferMolecular Instruments, Inc.BPW01522Puffer kann auch hergestellt werden doi:10.1242/dev.165753: Ergänzende Informationen
HEPESBioShopHEP001.100
Magnesiumsulfat HeptahydratSigma63138-250G
MethanolSigma32213-1L-M
MonokaliumphosphatSigmaP5655-100G
ParaformaldehydSigmaP6148-1KG
ROHREBioShopPIP666.100
KaliumchloridSigmaP5405-250G
Prolong Diamond Antifade EinbettmediumInvitrogenP36970
NatriumchloridBioShopSOD001.5
Trinatriumcitrat 2-HydratPOCH 6132-04-3
Tween-20BioShopTWN580.500
Software
Fluoreszenz-SpektroviewerModellierung von Spektralparametern
ImageJ FijiAufnahme und Verarbeitung von Z-Stack-Bildern
S013922S012522

Referenzen

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  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

SARS CoV 2 VisualizationImmuno RNA FISHIn Situ HybridizationHybridization Chain ReactionViral RNA DetectionHuman Airway EpitheliumConfocal MicroscopyImmunofluorescence LabelingSingle Cell AnalysisProtein RNA Interactions

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