Chronische Pankreatitis (CP) ist eine Krankheit, die durch Entzündungen und Fibrose der Bauchspeicheldrüse gekennzeichnet ist, die oft mit hartnäckigen Bauchschmerzen verbunden sind. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verfeinerung der Technik, um ein Mausmodell von CP durch Gallengangsinfusion mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) zu erzeugen.
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Methodenartikel
Ein Mausmodell für chronische Pankreatitis mittels Gallengangs-TNBS-Infusion
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Chronische Pankreatitis (CP) ist eine komplexe Erkrankung mit Pankreasentzündung und Fibrose, Drüsenatrophie, Bauchschmerzen und anderen Symptomen. Mehrere Nagetiermodelle wurden entwickelt, um CP zu untersuchen, von denen das Gallengang 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) Infusionsmodell die Merkmale neuropathischer Schmerzen bei CP repliziert. Die Infusion von Gallengangsmedikamenten bei Mäusen ist jedoch technisch anspruchsvoll. Dieses Protokoll demonstriert das Verfahren der Gallengangs-TNBS-Infusion zur Erzeugung eines CP-Mausmodells. TNBS wurde durch die Ampulle von Vater im Zwölffingerdarm in die Bauchspeicheldrüse infundiert. Dieses Protokoll optimierte das Arzneimittelvolumen, die chirurgischen Techniken und die Handhabung während des Eingriffs. TNBS-behandelte Mäuse zeigten Merkmale von CP, die sich in Gewichtsreduktionen des Körpergewichts und der Bauchspeicheldrüse, Veränderungen des schmerzbedingten Verhaltens und einer abnormalen Pankreasmorphologie widerspiegeln. Mit diesen Verbesserungen war die Mortalität im Zusammenhang mit der TNBS-Injektion minimal. Dieses Verfahren ist nicht nur entscheidend für die Erstellung von Pankreaserkrankungsmodellen, sondern auch für die lokale Verabreichung von Pankreasmedikamenten.
Einleitung
Chronische Pankreatitis (CP) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die durch Atrophie der Bauchspeicheldrüse, Fibrose, Bauchschmerzen und eventuellen Verlust exokriner und endokriner Funktionen gekennzeichnet ist1. Aktuelle medizinische und chirurgische Behandlungen sind nicht heilend, sondern werden durchgeführt, um Symptome zu lindern, die die Folge der Krankheit sind: refraktäre Bauchschmerzen, endokrine und exokrine Dysfunktion. Daher sind wirksamere Behandlungen dringend erforderlich2. Tiermodelle sind ein wesentliches Werkzeug, um ein besseres Verständnis der Krankheit zu entwickeln und potenzielle Therapeutika zu untersuchen3. Es wurden mehrere Mausmodelle für CP entwickelt, von denen Cerulein- und/ oder Alkoholmodelle häufig verwendet werden. Cerulein, ein Oligopeptid, das die Pankreassekretion stimuliert, hat gezeigt, dass es ein CP-Modell mit Pankreasatrophie, Fibrose und anderen reproduzierbar induziert4. Ein anderes gängiges Modell verwendet serielle Injektionen von L-Arginin, das eine exokrine Insuffizienz erzeugt, die der bei menschlichen Patienten beobachtetenähnelt 5. CP kann auch durch vollständige oder partielle Pankreasgangligatur sowie Pankreasganghypertonie6,7induziert werden. Trotz der Vielfalt der für CP verfügbaren Tiermodelle reproduziert keines dieser Modelle effektiv die Bauchschmerzen von CP-Patienten8.
Frühere Studien zeigten, dass die lokale Pankreasinjektion von 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) die anhaltenden Schmerzen von CP-Patienten repliziert9,10,11. TNBS-behandelte Mäuse zeigten abdominale Überempfindlichkeit und erhöhtes schmerzbedingtes Verhalten sowie eine "generalisierte Überempfindlichkeit" gegen schmerzhafte Reize, ein Phänomen, das bei CP-Patienten beobachtet wurde10. Neben der genauen Nachahmung von CP-Schmerzen repliziert das TNBS-Modell auch andere pathologische Merkmale des menschlichen Zustands wie Fibrose, mononukleäre Zellinfiltration und Ersatz von Acinarzellen durch Fettgewebe10,12. Die TNBS-Infusion über den Gallengang ist jedoch ein technisch anspruchsvolles Verfahren bei Mäusen, das zum Tod führen kann. Unseres Wissens gibt es kein visuelles Protokoll, um zu zeigen, wie die Gallengangsinfusion durchgeführt wird. In diesem Artikel demonstrieren wir das Verfahren der Gallenabduktion von TNBS zur Erzeugung eines CP-Mausmodells. Dieses Verfahren wird dazu beitragen, wertvolle Tiermodelle für die Untersuchung von CP und anderen Pankreaserkrankungen zu generieren und kann verwendet werden, um andere Materialien (z. B. Virus, Zellen) in die Bauchspeicheldrüse einzuschmeißen13.
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Protokoll
Alle Verfahren wurden mit Genehmigung der Institutional Animal Care and Use Committees an der Medical University of South Carolina und dem Ralph H. Johnson Medical Center durchgeführt. C57BL/6J männliche Mäuse im Alter von 8-10 Wochen wurden in dieser Studie verwendet. Mäuse wurden unter einem Standard-12-Licht- / 12-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.
1. Herstellung von TNBS-Injektionslösung
- Bereiten Sie 10% Ethanol in 0,9% Kochsalzlösung vor. TNBS -Stamm (siehe Materialtabelle)in 10% Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 7,5 mM auflösen, indem 7,5 μL TNBS in 1 ml 10% Ethanol zugefüllt werden.
ACHTUNG: TNBS stellt eine chemische Gefahr dar. Bereiten Sie die Lösung in einem Abzug vor und verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel, um direkten Kontakt mit TNBS zu vermeiden. - Laden Sie 50 μL 0,75% TNBS-Lösung mit einer 31-Gauge-Nadel in eine Insulinspritze. Laden Sie 50 μL 10% Ethanol in Kochsalzlösung in eine Spritze der gleichen Größe wie die Fahrzeugsteuerung. Legen Sie die Spritzen auf Eis und schützen Sie sie vor Licht, bis sie benötigt werden.
2. Mausvorbereitung und Operation
- Rasieren Sie die Haare aus dem abdominalen Operationsbereich.
- Injizieren Sie vor der Operation eine präventive Dosis des Analgetikums (z. B. Buprenorphin 0,1 mg/kg i.p.).
- Induzieren und erhalten Sie die Maus unter Vollnarkose mit 1,5-2% Isofluran und 1 L/min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Betäubung, indem Sie die Zehen einklemmen und das Tier auf einen Mangel an Reflex beobachten.
- Legen Sie die Maus während der Operation auf ein beheiztes Operationspad. Tragen Sie tierärztliche Salbe auf jedes Auge auf, wenn die Maus unter Betäubung steht.
- Desinfizieren Sie die Operationsstelle, indem Sie den Operationsbereich 3x mit 2% Jod abwischen, gefolgt von 70% Alkohol (Materialtabelle).
- Führen Sie eine Laparotomie mit einer Mikroschere durch, um einen Schnitt von 0,5-1 cm zu erzeugen.
- Legen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig frei und lokalisieren Sie den gemeinsamen Gallengang mit Wattestäbchen (Materialtabelle).
- Legen Sie einen geraden Mikro-Hämoclip ( Materialtabelle ) über den proximalengemeinsamenKanal, um den Fluss von TNBS oder Vehikellösungen in die Leber und die Gallenblase zu verhindern (Abbildung 1A, B).
- Legen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig frei und führen Sie die Nadel durch die Papille von Vater in den Pankreasgang ein.
- Sobald sich die Nadel im Kanal befindet, legen Sie einen gekrümmten Mikro-Hämoclip (Materialtabelle) über den Zwölffingerdarm, der die Nadel umgibt (Abbildung 1A), um die Nadel an Ort und Stelle zu sichern und zu verhindern, dass die injizierte Lösung in den Zwölffingerdarm gelangt.
- Die Lösung (TNBS oder Vehikel) wird im Laufe von einer Minute schrittweise in den Pankreasgang einfließen.
HINWEIS: TNBS muss langsam über eine Minute infundiert werden, und es ist einfach, die Infusionsgeschwindigkeit zu kontrollieren, wenn die Bauchspeicheldrüse mit einer Insulinspritze mit einer 5/16 Zoll und 31G Nadel perfundiert wird. Halten Sie die Hand so stabil wie möglich, um ein Stechen des Gallengangs zu vermeiden. Wenn TNBS erfolgreich injiziert wird, kann gelbe Farbe in der Bauchspeicheldrüse sichtbar sein. - Entfernen Sie nach der Infusion vorsichtig die Mikroklemme in der Nähe der Leber und entfernen Sie dann die Mikroklemme, die die Nadel und den Zwölffingerdarm hält.
- Bringen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig in seine ursprüngliche Position zurück.
- Lassen Sie 0,5 ml warme sterile Kochsalzlösung (36-37 ° C) vor dem Verschluss in der Bauchhöhle, um dem Zwölffingerdarm zu helfen, in seine ursprüngliche Position zurückzukehren und die Wiederherstellung der Peristaltik zu unterstützen.
- Schließen Sie den Schnitt in der Muskelschicht mit einer kontinuierlichen Naht mit einem 5-0-Stich. Schließen Sie die Haut mit unterbrochener Naht mit einem 4-0-Stich.
- Stellen Sie den Käfig mit Mäusen auf ein Heizkissen, um die Genesung von der Anästhesie zu ermöglichen.
- Vergewissern Sie sich, dass die Mäuse warm und zu spontanen Bewegungen fähig sind, bevor Sie sie in den Haltungsraum zurückbringen.
- Stellen Sie weiterhin alle 12 Stunden ein Analgetikum (z. B. Buprenorphin 0,1 mg / kg i.p.) und 48 Stunden nach der Operation zusätzliche Wärme zur Verfügung.
3. Überwachung des Mausverhaltens
- Entfernen Sie die Nähte am Tag 7 nach der Operation.
- Überwachen Sie die Gesundheit und das Verhalten der Maus täglich in der ersten Woche nach der Operation. Achten Sie auf Anzeichen von Stress wie Vokalisieren, gebückte Rückenhaltung oder reduzierte Fortbewegung. Messen Sie das Körpergewicht jeden zweiten Tag.
- Verwenden Sie Von Frey Monofilamente (VFFs), um die abdominale mechanische Überempfindlichkeit vor und 2, 3 Wochen nach der Operation wie beschrieben zu messen9,14.
- Tragen Sie VFFs verschiedener aufgebrachter Kräfte in aufsteigender Reihenfolge 10x alle 1-2 s auf den oberen Bauchbereich auf. Betrachten Sie das Anheben, Zurückziehen oder Lecken des Bauches (Entzugsreaktion) als positive Reaktion.
- Wenden Sie einen stärkeren Reiz an, wenn keine positive Reaktion beobachtet wird, und einen schwächeren Reiz, wenn eine positive Reaktion beobachtet wird. Die Entzugsschwelle ist die Kraft, mit der die Maus 50% der Zeit reagiert.
4. Sammlung und histologische Analyse von Pankreasgewebe
- Opfern Sie die Mäuse unter Anästhesie durch zervikale Dislokation und sezieren Sie vorsichtig die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm und anderen Organen.
- Fixieren Sie die Bauchspeicheldrüse 24 Stunden lang in 10% Paraformaldehyd, betten Sie sie in Paraffin ein, schneiden Sie Gewebeabschnitte von 5 μm Dicke und legen Sie sie zur Färbung auf Glasobjektträger.
- Führen Sie Hämatoxylin-Eosin und Massons Trichromfärbung mit Standardmethoden durch, wie zuvor berichtet4.
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Ergebnisse
Die Gallengangsinfusionsverfahren wurden optimiert, um die mit diesem Verfahren verbundene Maussterblichkeit zu reduzieren10. TNBS wurde zunächst in einem Gesamtvolumen von 35 μL oder 50 μL verabreicht. Die Injektion von TNBS in einem Volumen von 50 μL könnte die gesamte Bauchspeicheldrüse erreichen und einen homogeneren Krankheitsphänotyp induzieren (Abbildung 1B). Darüber hinaus könnte die Injektion von TNBS mit einer Insulinspritze mit 31G-Nadel die Infusionsgeschw...
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Diskussion
Die Gallengangsinfusion von TNBS zur Induktion einer chronischen Pankreatitis ist bei Mäusen technisch anspruchsvoll, da bis zu 22,5% der Mäuse innerhalb von 3-4 Tagen nach der Medikamenteninfusion sterben können10. Hier verfeinerte dieser Bericht das Verfahren auf der Grundlage früherer Studien und reduzierte die frühe Maussterblichkeit auf <10%. Zum Beispiel kann das erhöhte Arzneimittelvolumen (von 35 μL auf 50μL) sicherstellen, dass die Medikamente die gesamte Bauchspeicheldrüse erreichen. Die...
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Offenlegungen
Alle Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Danksagungen
Diese Studie wurde vom Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) unterstützt, und das National Institute of Health gewährt HW # 1R01DK105183, DK120394 und DK118529. Wir danken Dr. Hongju Wu für den Austausch technischer Erfahrungen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10% neutrales gepuffertes Formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alkohol-Vorbereitungspads, steril | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tieranästhesiesystem | VetEquip, Inc. | ||
| Buprenorphinhydrochlorid, Injektion | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Zentrifugenröhrchen, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolut (200 proof), molekularbiologische | Qualität Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra feine Mikro-Präparierschere 4" gerade scharf | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe Pinzette 4" extra zarte Spitze | Roboz Chirurgisches Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heizkissen | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Nadelhalter 5,25" | Roboz Chirurgisches Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulinspritze mit 31-Gauge-Nadel | BD | 324909 | |
| Jodvorbereitungspads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isofluran | Piramal Intensivpflege | NDC 66794-017-25 | |
| Mikroclip-Applikationszange 5,5" | Roboz Chirurgisches Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro Clip, gerade stark gebogen 1x6mm | Roboz Chirurgisches Instrument Co. | RS-5433 | |
| Mikro-Clip, gerade, 0,75 mm Clipbreite | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonsäurelösung, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylen-Naht 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylen-Nahtmaterial 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Natriumchlorid, 0,9 % intravenöse Lösung | VWR | 2B1322Q | |
| OP-Tuch, steril | Med-Vet International | DR1826 | |
| Gewebekassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey Filamente | Bioseb | EB2-VFF |
Referenzen
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