Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.
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Methodenartikel
Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Darmschleimhaut wird von einer einzigen Schicht von Epithelzellen ausgekleidet, die eine dynamische Barriere bildet, die den parazellulären Transport von Nährstoffen und Wasser ermöglicht und gleichzeitig die Passage von leuchtenden Bakterien und exogenen Substanzen verhindert. Ein Bruch dieser Schicht führt zu einer erhöhten Durchlässigkeit für luminalen Inhalt und zur Rekrutierung von Immunzellen, die beide Kennzeichen pathologischer Zustände im Darm einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) sind.
Mechanismen, die die epitheliale Barrierefunktion und die transepitheliale Migration (TEpM) von polymorphonukleären Neutrophilen (PMN) regulieren, sind aufgrund des Mangels an experimentellen In-vivo-Methoden, die quantitative Analysen ermöglichen, unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein robustes murines experimentelles Modell, das ein exteriorisiertes Darmsegment von entweder Ileum oder proximalem Dickdarm verwendet. Die exteriorisierte Darmschleife (iLoop) ist vollständig vaskularisiert und bietet physiologische Vorteile gegenüber ex vivo kammerbasierten Ansätzen, die üblicherweise zur Untersuchung der Permeabilität und PMN-Migration über Epithelzellmonoschichten verwendet werden.
Wir zeigen zwei Anwendungen dieses Modells im Detail: (1) quantitative Messung der Darmpermeabilität durch Nachweis von fluoreszenzmarkiertem Dextrans im Serum nach intraluminaler Injektion, (2) quantitative Beurteilung von migriertem PMN über das Darmepithel in das Darmlumen nach intraluminaler Einführung von Chemoattraktantien. Wir demonstrieren die Machbarkeit dieses Modells und liefern Ergebnisse mit dem iLoop bei Mäusen, denen das epitheliale Tight Junction-assoziierte Protein JAM-A im Vergleich zu Kontrollen fehlt. Es wurde gezeigt, dass JAM-A die epitheliale Barrierefunktion sowie PMN TEpM bei Entzündungsreaktionen reguliert. Unsere Ergebnisse mit dem iLoop bestätigen frühere Studien und unterstreichen die Bedeutung von JAM-A bei der Regulation der Darmpermeabilität und PMN TEpM in vivo während der Homöostase und Erkrankung.
Das iLoop-Modell bietet eine hochstandardisierte Methode für reproduzierbare In-vivo-Studien der intestinalen Homöostase und Entzündung und wird das Verständnis der Darmbarrierefunktion und der Schleimhautentzündung bei Krankheiten wie IBD deutlich verbessern.
Einleitung
Die Darmschleimhaut umfasst eine einzige Schicht aus säulenförmigen Darmepithelzellen (IECs), darunter liegenden Lamina propria Immunzellen und den Muscularis mucosae. Neben seiner Rolle bei der Aufnahme von Nährstoffen ist das Darmepithel eine physikalische Barriere, die das Körperinnere vor luminalen kommensalen Bakterien, Krankheitserregern und diätetischen Antigenen schützt. Darüber hinaus koordinieren IECs und Lamina propria-Immunzellen die Immunantwort, die je nach Kontext und Reizen entweder Toleranz oder Reaktion induziert. Es wurde berichtet, dass die Störung der Epithelbarriere dem Beginn einer pathologischen Schleimhautentzündung vorausgehen und zu entzündl....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt und vom Institutional Animal Care & Use Committee an der University of Michigan genehmigt.
1. Präoperative Vorbereitung
HINWEIS: Diese Methode wurde mit erwachsenen Mäusen aus dem genetischen Hintergrund C57BL / 6 im Alter von 8 - 12 Wochen entwickelt. Alle Mäuse wurden unter strengen spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit ad libitum Zugang zu normalem Chow und Wasser gehalten. Die Ergebnisse wurden mit C57BL/6, Jam-a-Nullmäusen (Jam-a-/-) oder Mäusen mit s....
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Ergebnisse
Eine schematische Darstellung der Ilealschleifen- und pcLoop-Modelle ist in Abbildung 1 bzw. Abbildung 2dargestellt. Die anatomischen Bilder zeigen die kritischen Schritte des Verfahrens, einschließlich der Exteriorisierung des Darmsegments (Abbildung 1B und Abbildung 2B), der Identifizierung einer geeigneten Stelle für Ligationen, die eine minimale Störung der Blutversorgung ermöglicht.......
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Diskussion
Die Mechanismen, die für die Dysregulation der Darmbarrierefunktion und die Rekrutierung von Immunzellen unter pathologischen Erkrankungen wie IBD verantwortlich sind, sind unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein robustes in vivo murines Modell, das ein gut vaskularisiertes exteriorisiertes Darmsegment von entweder Ileum oder proximalem Dickdarm verwendet und die Beurteilung der Darmpermeabilität, neutrophilen Migrationsstudien sowie anderer Anwendungen ermöglicht.
Der iLoop ist ein.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Sven Flemming von der Universität Würzburg für seine Beiträge zur Etablierung des proximalen Dickdarmschleifenmodells, Sean Watson für das Management der Mauskolonien und Chithra K. Muraleedharan für die Hilfe bei der Anschaffung der Bilder des iLoop-Modells. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft/DFG (BO 5776/2-1) zu KB, R01DK079392, R01DK072564 und R01DK061379 zu C.A.P.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ausrüstung und Material | |||
| BD Alkoholtupfer | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Nadel, 25G x 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Nadel, 30G x 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberkulinspritze ohne Nadel | BD | 309659 | |
| 15 ml Zentrifugenröhrchen | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Mikroplatte aus massivem schwarzem Polystyrol | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Unbehandelte Kulturschale, 10 cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Wattestäbchen-Applikator (Wattestäbchen), 6", steril | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex mit Baumwolle gefüllte Mullschwämme, Unsteril, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 Anästhesie-Vaporizer (Classic System, einschließlich Heizeinheiten) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Zentrifugenröhrchen 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Farbiges Beschriftungsband | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Nadelhalter (Nadelhalter) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, klein (Taschentuch) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen | Thomas Wissenschaftlich | c2170 | |
| Mikroröhrchen 1,3 ml Z (Röhrchen für Serumgergerinnselaktivatoren) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Feinschere | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe (35 & Mikro; m Nylon Mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Salbe, Steriles Augengleitmittel | Dechra | 12920060 | |
| Ringzange (stumpfe Gewebezange) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Pinzette (anatomische Pinzette) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk nicht resorbierbare beschichtete schwarze Naht geflochtene Seide Größe 3-0, 18", Nadel 19mm Länge 3/8 Kreis Rückwärtsschnitt | HenrySchein | SS694 | |
| Student Feinzange, abgewinkelt | FST | 91110-10 | |
| 10ml Spritze PP/PE ohne | Nadel Millipore Sigma | ||
| 96 Well Zellkulturplatte | Corning | 3799 | |
| Gelbe Ernährungssonden für Nagetiere 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30< | |
| strong>Lösungen und Puffer | |||
| Accugene 0,5M EDTA | Lonza 51201 | ||
| Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysing Puffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' ausgewogene Salzlösung | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| strong>Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Maus Ly-6G Antikörper (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoklonaler Antikörper, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Zählperlen | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fötales Rinderserum, hitzeinaktiviert | R& D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanat-Dextran, mittleres Molekulargewicht 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isofluran | Halogenkohlenstoff | 12164-002-25 | |
| Leukotrien B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Ratte Anti-Maus CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Gereinigtes Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32 (Maus-BD-FC-Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| rekombinantes murines IFN-& gamma; | Peprotech | 315-05 | |
| Rekombinante Maus TNF-α | Peprotech | 315-01A |
Referenzen
- Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
- Jump, R. L., Levine, A. D. M....
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Nachdrucke und Genehmigungen
