Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Positron Utslipp Tomografi Imaging for In Vivo Måling av Myelin Innhold i Lysolecithin Rotte Modell av Multippel Sklerose

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62094
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Nuclear Medicine (LIM-43), Departamento de Radiologia e Oncologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Nuclear Medicine Division, Hospital Sirio-Libanes

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokollen har som mål å overvåke in vivo myelin endringer (demyelination and remyelination) ved positron utslipp tomografi (PET) avbildning i en dyremodell av multippel sklerose.

Abstract

Multippel sklerose (MS) er en nevroinflammatorisk sykdom med ekspanderende aksonal og nevronal degenerasjon og demyelinasjon i sentralnervesystemet, noe som fører til motoriske dysfunksjoner, psykisk funksjonshemning og kognitiv svekkelse under MS-progresjon. Positron utslipp tomografi (PET) er en bildeteknikk i stand til å kvantifisere in vivo cellulære og molekylære endringer.

Radiotracere med affinitet til intakt myelin kan brukes til in vivo avbildning av myelininnhold endres over tid. Det er mulig å oppdage enten en økning eller reduksjon i myelininnhold, hva betyr at denne bildeteknikken kan oppdage demyelinasjon og remyelinasjonsprosesser i sentralnervesystemet. I denne protokollen viser vi hvordan du bruker PET-avbildning til å oppdage myelinendringer i lysolecithin rottemodellen, som er en modell for fokal demyelinasjonslesjon (indusert av stereotaktisk injeksjon) (det vil si en modell av multippel sklerosesykdom). 11.11 .11 C-PIB PET imaging ble utført ved baseline, og 1 uke og 4 uker etter stereotoksisk injeksjon av lysolecithin 1% i høyre striatum (4 μL) og corpus callosum (3 μL) av rottehjernen, slik at kvantifisering av fokal demyelinasjon (injeksjonsstedet etter 1 uke) og remyelinasjonsprosessen (injeksjonsstedet ved 4 uker).

Myelin PET imaging er et interessant verktøy for overvåking in vivo endringer i myelin innhold som kan være nyttig for overvåking avmagyeliniserende sykdomsprogresjon og terapeutisk respons.

Introduction

Multippel sklerose (MS) er en nevroinflammatorisk sykdom som påvirker sentralnervesystemet, preget av betennelse, demyelinasjon og aksonalt tap1. Prognosen for denne sykdommen er variabel selv med fremskritt i behandlingen, og det er en av de vanligste årsakene til nevrologiske underskudd hos ungemennesker 1. Diagnosen MS er basert på kriteriene for klinisk manifestasjon og visualisering av karakteristiske lesjoner ved magnetisk resonansavbildning (MR)2,3.

Positronutslippstomografi (PET) kan være et nyttig verktøy for in vivo overvåking av MS-progresjon og terapeutiske effekter. Pittsburgh sammensatte B radiotracer (PIB) merket med karbon-11(11C-PIB) er mye brukt til å kvantifisere β-amyloid plakk; men i det siste tiåret har det blitt studert for å kvantifisere myelininnhold og vise dynamisk demyelinasjon og remyelination4,5,6.

Forskjellige amyloid PET tracers (11C-PIB, 18F-florbetaben,18F-florbetapir, 18F-flutemetamol) kan brukes til å kvantifisere myelin og gi viktig informasjon om sykdomsprogresjon og terapeutisk respons, slik at identifisering av demyelinasjon og remyelinasjonsprosesser, uten forstyrrelser av nevroinflammasjon, som kan oppstå med konvensjonelle magnetiske resonansbilder (MR)7. Amyloid PET imaging viste redusert sporopptak hos aktive MS-pasienter sammenlignet med ikke-aktive pasienter som kan forklares med tidlig skade på hvit materiale hos de aktive pasientene8. Lavere amyloid tracer opptak var også forbundet med kognitiv nedgang i en oppfølgingsstudie, viser denne teknikken å være et verdifullt verktøy for å studere patofysiologien til sykdommen og kliniske resultater9.

Lysolecithin (LPC) rottemodellen er en kjemisk indusert modell av multippel sklerose, hvor det injiserte toksinet, LPC, induserer en høy respons av makrofager som resulterer i økt betennelse og følgelig demyelinasjon10,11. Demyelinasjonen reverseres raskt, i ca. 4 uker, noe som gjør dette til en god modell for evaluering av demyelinasjons- og remyelinasjonsprosesser hos gnagere. Denne modellen har allerede blitt evaluert ved hjelp av PET-bildebehandling, med gode resultater og korrelasjon med post-mortem essays12.

Her presenterer vi protokollen for myelin PET-avbildning med 11C-PIB i lysolecithin rottemodellen, som viser denne bildeteknikken for å være et nyttig verktøy for in vivo måling av myelininnhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene i National Council for kontroll av Animal Experimentation (CONCEA, Brasil) og ble godkjent av etikkkomiteen for dyreforskning ved Medical School ved University of Sao Paulo (CEUA-FMUSP, Brasil - protokollnummer: 25/15).

MERK: I denne protokollen viser vi hvordan vi induserer en lysolecithin rottemodell av multippel sklerose og hvordan man skaffer og analyserer myelin PET-bildene.

1. Klargjøring av lysolecitin oppløsning

  1. Vei lysolecithin (L-α-Lysophosphatidylcholine fra eggeplomme) på en analytisk skala ved hjelp av et konisk plastrør (1,5 ml).
  2. Tilsett steril saltvann til røret for å lage 1% løsning (for eksempel: veie 1 mg lysolecithin og oppløse den med 100 μL saltvann) og oppløs lysolecithin ved å riste røret (risting fra side til side og ikke snu fra topp til bunn).
  3. Forbered løsningen like før du starter dyremodellinduksjonen (ikke lager den endelige ferdige løsningen).

2. Lysolecithin rotte modell - Stereotoksisk kirurgi

  1. Bruk hannrotter som veier mellom 220 og 270 g. Bruk hansker og maske under alle prosedyrer.
  2. Induser anestesi med 5 % isofluran blandet i 100 % O2 (1 l/min) ved hjelp av en induksjonsboks. Kontroller om dyret bedøves ved å observere fravær av bevegelse (kun pusting bør observeres).
  3. Plasser dyret i stereotoksisk apparat på en varmepute. Fest dyrets nese og ører til utstyret.
    MERK: Detaljer om hvordan du utfører stereotoksisk kirurgi finner du i JoVE Science Education Database. Nevrovitenskap. Gnager Stereotoksisk kirurgi. JoVE, Cambridge, MA, 2021.
    1. Overvåk anestesi for hele prosedyren (inkludert kirurgi og bildeoppkjøp). For å justere isoflurankonsentrasjonen, følg dyrets pustefrekvens. En rask pustehastighet krever høyere konsentrasjon og en langsom pustefrekvens krever lavere bedøvelseskonsentrasjon.
  4. Injiser smertestillende (ketoprofen - 5 mg/ kg) subkutant (fortynne medisinen til 1 ml i saltvann, dette vil bidra til å hydrere dyret).
  5. Sett øyekrem i dyrets øyne for å beskytte mot dehydrering.
  6. Bruk en 0,5% klorhexidinoppløsning for å rengjøre snittområdet.
  7. Injiser 100 μL lidokainhydroklorid 2% subkutant i snittområdet.
  8. Barber skallen området.
  9. Bruk sterile instrumenter for denne prosedyren.
  10. Ved hjelp av en skalpell, gjør et snitt på ca 2 cm i huden over skallen.
  11. Utsett skallen med Bulldog klemmer.
  12. Bruk en vattpinne til å rengjøre skallen med 1% hydrogenperoksidase.
  13. Finn og merk bregma (en stereotoksisk rotte hjerneatlas kan bidra til å identifisere Bregma).
  14. Plasser Hamilton sprøyten (μL neuros sprøyter) på bregma.
  15. Bruk bregma og et stereotaksisk atlas som referanse, plasser Hamilton-sprøyten ved følgende koordinater: Antero-posterior: -0,30 mm, latero-lateral: -3,0 mm, og ventral til den berører skallen bein, og merk skallen og noter koordinatene orientering på papir.
  16. Bor skallen ved den merkede koordinaten. Ta vare på dura mater (skadelig dura mater kan forårsake mye blødning).
  17. Fyll Hamilton sprøyten med 7 μL lysolecithin oppløsning (1% i saltvann). Et større volum kan plasseres i sprøyten, men bare 7 μL vil bli injisert (ta boblene ut av sprøyten for å måle volumet riktig).
  18. Plasser Hamilton-sprøyten ved de forrige koordinatene for å starte injeksjonen (totalt 7 μL i 3 forskjellige ventrale stereotaktiske koordinater). Med tanke på de tidligere kjente koordinatene, senk Hamilton-sprøyten til ventral koordinat -5,0 mm.
  19. Injiser sakte 2 μL lysolecitinoppløsning (1 μL/10 min). Vent 3 min.
  20. Ta nålen opp til neste ventrale stereotoksiske koordinat (-4,2 mm) og injiser sakte 2μL lysolecitinoppløsning (1 μL/ 10 min). Vent 3 min.
  21. Injiser den tredje ventrale koordinaten -3,0 mm (3 μL lysolecitin oppløsning - 1 μL/ 10 min).
  22. Vent 5 min og fjern deretter Hamilton sprøyten fra hjernen.
  23. Sutur huden.
  24. Fjern dyret fra det stereotaktiske apparatet og la dyret vekke.
  25. Returner dyret til hjemmeburet, hold dyret alene og under tilsyn for å se etter tegn på ubehag.
  26. Injiser subkutant smertestillende (ketoprofen - 5 mg/kg) fortynnet i saltvann, ved 24 timer og 48 timer etter operasjonen.

3. PET oppkjøp

  1. Ta 7 til 20 MBq av 11C-PIB radioaktivitet i en sprøyte (1 ml er det maksimale volumet som er tillatt for intravenøs injeksjon hos rotter).
  2. Bedøve dyret med 5 % isofluran blandet i 100 % O2 (1 l/min) ved hjelp av induksjonsboksen.
  3. Injiser 11C-PIB (radioaktivitet definert i punkt 4.1 ovenfor) i penisvenen, eller halevenen til rotten (begge administrasjonsstedene er fine, avgjørelsen er et personlig valg. Vi råder bare til ikke å bruke en retro-orbital injeksjon siden plasseringen er for nær interesseområdet (hjernen) og kan svekke bildekvaliteten.
    MERK: Bildeopphenting av utgangspunktets tidspunkt utføres før stereotoksisk injeksjon og de andre 2 tidspunktene ved 1 uke og 4 uker etter operasjonen.
  4. Fjern dyret fra anestesi for å la dyret vekke (la dyret stå på en varm pute til det er helt våken).
  5. Returner dyret til hjemmeburet.
  6. Vent 30 min for neste trinn.
  7. Bedøve rotter med 5% isofluran blandet i 100% O2 (1 L / min) ved hjelp av en induksjonsboks.
  8. Åpne PET-skannerprogramvare.
  9. Velg Skann > Klar for kjæledyr.
  10. Fullstendige hovedetterforskerdetaljer, studie-ID, serie-ID, dyre-ID, Dyrevekt (g) og Tilleggsnotater. Velg Neste.
    MERK: Bruk punkt (.) for desimaltall i dyrevekten.
  11. Rediger roi-området for skanning (vanligvis mellom 3 og 8). Dette er området som vil bli inkludert i bildet (områder mellom tallene 3 og 8 av sengedekselet vises i det endelige bildet).
  12. Plasser den bedøvede rotten på en standard rotteseng på PET-skanneren og slå på anestesi (3 % isofluran i 100 % O2 er en god start, og deretter bør anestesihastigheten justeres etter behov). For å justere anestesi, sjekk overvåkingsdataene til skannerprogramvaren for å bekrefte at dyret puster inn en konstant og langsom rytme.
    MERK: Slå på vakuumpumpen koblet til det aktiverte karbonfilteret for å samle isoflurangassoverskudd (hvis pumpen er tilgjengelig).
  13. Påfør øyekrem for å beskytte dyrets øyne.
  14. Skyv dyresengen inne i PET-skanneren.
  15. Fullfør aktivitetsdetaljer, aktivitetskalibreringstid, Isotop (C-11) og Skannevarighet (20 minutter). Velg Start skanning.
    MERK: En melding om flytteseng for kjæledyr vises, og dyresengen vil flytte inn i utstyret og stoppe ved den tidligere valgte roi-posisjonen. Tidspunktet for anskaffelsen vil starte tellingen, og antall tellinger per sekunder vises (CPS).
  16. I skannerprogramvaren navigerer du til Skjerm-fanen til venstre på skjermen, kontrollerer du endre endring av endrede respirasjonsgrense til åndedrettsparametere (BPM).
    MERK: Et vindu vil dukke opp, komplett med terskelparameter (500). Velg OK.
  17. Naviger til 0 % POWER for å endre temperaturparametrene for å varme opp dyret under skanningen. Et vindu vil dukke opp; fullføre parameteren (80 - 100). Velg OK.
    MERK: Velg mellom 80 og 100 % strøm basert på romtemperaturforhold (jo mer kraft, jo varmere blir det).
  18. Naviger tilbake til SCAN-fanen.
  19. Naviger til konfigurasjonsverktøyet (tannhjulikon) og fullfør injeksjonstid, gjenstående aktivitet, Gjenværende aktivitetskalibreringstid. Velg Lagre.
    MERK: Et vindu vil dukke opp "Er du sikker på at du vil endre protokollmetadataene?" > JA
  20. Naviger tilbake til monitorfanen (sjekk dyrets åndedrettsparametere, og om nødvendig øke eller redusere isoflurankonsentrasjon - vanligvis 3% i 100% O2 er nok).
  21. Når PET oppkjøpet er ferdig, Pet Klar meldingen vises på Scan kategorien, sjekk Pil ut ikon (venstre for konfigurasjonsverktøyet) for å flytte ut dyr sengen.
  22. Fjern dyret fra anestesi og la det våkne på en varm pute.
  23. Hvis du vil rekonstruerebildet, går du til Rekonstruer-fanen.
  24. Sjekk plussikonet nederst til venstre på skjermen, og velg studiefilen som skal rekonstrueres. Velg Neste.
  25. Gå til energioppløsningsverktøyet. Et vindu vil dukke opp. Konfigurer energitoppen (keV) til utstyrsparameteren (basert på månedlig kvalitetskontroll). Velg Lukk.
    MERK: Energitoppen kan endres hver måned når du utfører månedlig utstyrskalibrering.
  26. Behold alle andre parametere som standard (isometrisk voxelstørrelse: 400 mm; antall iterasjoner: 30; Energioppløsning: 30%; Lagre bare siste iterasjon; fjern merket for Behold binære data) .
  27. Merk av for Legg til.
    MERK: Et vindu vil dukke opp "Rekonstruksjonen ble lagt til i køen og vil starte når de andre er ferdige". Velg OK. En fil vises i rekonstruksjonslisten i kategorien Rekonstruering, og statusen vises som venter eller % (fremdrift) eller fullført.

4. Bildeanalyse

MERK: Utfør bildeanalyse ved hjelp av dedikert bildeanalyseprogramvare. I den gjeldende protokollen bruker demonstrasjonen et bestemt program, men hvis det ikke er tilgjengelig, kan andre alternativer brukes.

  1. Åpne PMOD > Sikring den.
  2. Naviger til Samsvar-fanen øverst på skjermen.
  3. Åpne Last inn inndata-menyen i midten av skjermen, og velg Autodetect-filer, velg PET-fil (DICOM, Interfile eller NifTI), legg til i valgt, klikk med Operasjoner, Reorienter til Standardretning, klikk Last inn og lukk.
  4. Kontroller om dyreartene er riktige nederst på skjermen (RAT).
  5. Merk av i Beskjæringsboksen nederst til høyre på skjermen.
  6. Juster den gule boksstørrelsen i PET-bildet for å ta hele hjernen.
  7. Klikk på Stiv-knappen til høyre på skjermen. Klikk Ja i bekreftelsesvinduet.
  8. Klikk på hjerneverktøyet til høyre midt på skjermen for å åpne Reference Atlas. Velg Px Rat (W.Schiffer) - T2.
  9. Velg Match resultater fra fanen øverst til høyre (Velg fanen behandlingsstadium).
  10. Klikk på Data-reslicing (4. faneøverst til høyre).
  11. Juster PET-bildet etter referansemalen ved hjelp av roteringsverktøyet (hvitt ikon midt i PET-bildet). Kontroller justeringen for 3 anatomiske plan.
  12. Lagre medregistreringsfilen (menyen til høyre på skjermen).
  13. Velg utdataformat (DICOMor NifTI), katalog- og filprefiks. Klikk Lagre.
    MERK: Hvis medregistrerte utdata lagres som NifTi, vil topptekstbildeinformasjonen gå tapt.
  14. Klikk på VOI-menyen nederst på skjermen.
  15. Gå til Mal > Atlas nederst på skjermen (under VOI-vinduet).
  16. Velg Px Rat (W.Schiffer) fra rullegardinmenyen.
    MERK: Hvis du bare trenger å analysere spesifikke VOIer, kan du velge bare hjerneområdene av interesse. Hvis du vil ha alle hjerneområder i hjerneatlaset, er det ikke nødvendig med noen handling.
  17. Klikk på Disposisjon nederst på skjermen.
    MERK: VOIer for hjerneområder vises i VOI-vinduet.
  18. Trekk VOI manuelt på lesjonsstedet og det kontralaterale hjernehalvkuleområdet (henholdsvis 11C-PIB lavt opptaksområde og kontralateral hjernehalvkule).
  19. Klikk i området PET bilde med 11C-PIB lavt opptak.
  20. Velg Ny VOI > OK.
    MERK: Et regneark vises
  21. Naviger til SPHERE-ikonet midt på skjermen (til venstre for VOI-vinduet)
    MERK: Et regneark vises.
  22. Velg VOI-navnet: lesjonen, og velg Bruk.
    MERK: En sfære vises i det medregistrerte bildet.
  23. Juster sfæren i lesjonsområdet og juster VOI for alle anatomiske plan.
  24. Klikk på Lukk (nederst i regnearket).
  25. Velg lesjons-VOI (fra VOI-listen).
  26. Naviger til VOI-speilingsoperasjonsikonet (øverst til høyre i VOI-vinduet), og velg Klone og speil til venstre/høyre.
  27. Naviger til Beregn valgt VOI-statistikk øverst i VOI-listevinduet. Naviger til Velg statistikk som skal beregnes ikonet for å velge utdata (til høyre for VOI statistikk ikonet). Vanligvis for myelin innhold sjekk Statistikk for gruppe voier, Gjennomsnitt, SD, Min, Max).
    MERK: Et regneark vises. Standardinnstillingen Data Unit er kBq/cc. Øverst på regnearket (VOI-statistikk) kan du sjekke dataenheten som SUV (standardisert opptaksverdi). Hvis du fullførte radiotracer administrasjon og bildeinnhenting detaljer riktig i skannerprogramvaren, som beskrevet tidligere, SUV-dataene vil bli beregnet automatisk av PMOD programvare, hvis ikke, kan du redigere detaljene.
  28. Naviger til Kopier ved hjelp av tallformat for system nasjonale medier.
    MERK: Kontroller om all statistikk er valgt for å kopiere som utdata (Kontroller ikonet øverst til høyre på skjermen). Dataene som skal kopieres, avhenger av den valgte dataenheten.
  29. Lim inn utdata i en notisblokk eller et regneark.
    MERK: Vær forsiktig med programvareinnstillinger for punkt- og kommasymboler mellom tall. Dette kan være forskjellig mellom språkkonfigurasjoner.
  30. Lagre filen med studienavn og detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser illustrerende 11C-PIB PET-bilder med myelinendringer over tid. I grunnlinjeskanningen kan det ikke ses forskjeller i myelininnhold (det vil si at det ikke finnes noen demyelinasjon). I 1-ukers tidspunktbilde er det mulig å se den fokale demyelinerte lesjonen (på høyre halvkule) som indikert av den hvite pilen. Bilder presenteres i de 3 anatomiske flyene (koronar, aksial og sagittal), og det er mulig å identifisere den demyelinerte lesjonen i dem alle. 1-ukers bildet er illustrasjonen av en godt avgrenset lesjon på injeksjonsstedet, som representerer riktig modellinduksjon og bildedeteksjon. I 4 ukers bilde er ingen lesjon synlig lenger, noe som indikerer at remyelinasjon har skjedd og myelininnholdet er tilbake til normalt (eller i nærheten av det).

De representative grafene viser kvantifiseringen av bildene av 4 dyr i de 3 forskjellige tidspunktene. Den første grafen viser resultatene fra kvantifiseringen av lesjonen (manuell VOI) til kontralateral sideforhold som viser mer fokal myelinendringer, hvor lysolecitininjeksjonen ble utført. Den andre grafen viser samme kvantifisering, men i striatum (injisert striatum til kontralateral forhold) og i dette tilfellet forskjellen er ikke statistisk signifikant, noe som kan forklares av den lille prøvestørrelsen og fordi VOI er større og radioaktivitetskonsentrasjonen måles ikke bare der lysolecitin ble injisert.

Forskjeller mellom grupper ble analysert av Kruskal Wallis-testen, etterfulgt av Dunns test for flere sammenligninger, og resultatene presenteres som ± SD. I lesjonen VOI (H = 7,063; P=0,017), i 1-ukers bildet, var sporingsopptaksforholdet (0,90±0,07) 16 % lavere enn baseline (1,07±0,06), med statistisk signifikans (p=0,024). Det ble ikke funnet signifikante forskjeller i 4-ukersbildet (1,01±0,06).

I striatum ble det ikke funnet statistiske forskjeller (H =1,412; P=0,5393). Opptaksprosentene for bildene var 1,07±0,07 for baseline, 1,02±0,07 i 1 uke og 1,01±0,08 i 4 uker.

Den tredje grafen (bunnlinjen, venstre graf) presenterer kvantifiseringen av kontralateral striatum (ikke-injisert side). I denne grafen er det mulig å observere at det ikke var noen forskjell (P = 9397) blant tidspunkter, noe som betyr at variasjonen i den injiserte siden skyldes myelinendringer og ikke på grunn av sporsporopptaksvariasjon over tid.

Den endelige grafen, nederst til høyre, viser kvantifiseringen av det injiserte stedet (lesjon VOI) hos dyr der modellen ikke var godt indusert (sannsynligvis på grunn av rask lysolecithin injeksjon, feil stereotoksisk manipulasjon og / eller feil løsningspreparat). I dette tilfellet er det nedre opptaket ikke sett i 1 ukes tidspunkt, noe som betyr at ingen demyelinasjonsprosess har skjedd, og det lave opptaket ved 4 uker kan være relatert til en senere demyelinasjonsprosess eller vevsskade, begge situasjonene er relatert til dårlig dyremodellinduksjon. Denne grafen ble lagt til protokollen for å eksemplifisere utseendet på resultatene når dyret induksjon ikke er godt utført og for å understreke viktigheten av hvert trinn i protokollen, fra begynnelsen til slutten. Det er ingen forskjeller i sporingsopptaket (H = 2,745, P = 0,267) med opptaksforhold på 1,06±0,05, 1,02±0,14 og 0,96±0,10 for baseline, 1 uke og 4 ukers PET-bilder.

Figur 2 legger til mer informasjon i resultatene, der figur 2A detaljer hvor den manuelle VOI ble tegnet, basert på MR-malreferansen og figur 2B viser luxol rask blå flekker (for detaljer om luxol rask blå farging protokollen, se De Paula Faria et al.13) fra injisert side og ikke-injisert side på 7 dager etter stereotoksisk injeksjon.

Figure 1
Figur 1: Illustrerende 11C-PIB PET-bilder som viser bilder av baseline, 1 uke og 4 uker etter stereotaktisk injeksjon. Grafene nederst på figuren representerer kvantifiseringen av sporingsopptak (n=4) på forskjellige tidspunkter. De to første grafene representerer opptaksforholdet i den injiserte siden til kontralateral side i lesjonen og i striatum i en velindusert modell (det vil si rotter som presenterer lesjon etter lysolecithin injeksjon). Den tredje grafen (nederst til venstre) viser kvantifiseringen av ikke-injisert striatum (negativ kontroll), og den endelige grafen (nederst til høyre) representerer 11C-PIB-opptaket på injeksjonsstedet for dyr som ikke presenterte demyelinert lesjon (dårlig indusert modell). Resultatene presenteres som ±SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Detaljer om Leion-posisjon. A) Illustrerende VOIer av injisert side (stiplet linje) og ikke-injisert side (hvit linje) trukket manuelt basert på MR-malen (region av corpus callosum og striatum) ved 1 uke etter stereotaktisk injeksjon. B) Luxol rask blå flekker som viser demyelinasjon i injisert halvkule sammenlignet med den ikke-injiserte siden (Topp: 40x forstørrelse, bunn: 100x forstørrelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den største fordelen med å bruke lysolecithin-modellen til å studere multippel sklerose er den raske tidslinjen for demyelinasjon (ca. 1 uke) og remyelinasjon (ca. 4 uker) somskal forekomme 14. Denne modellen kan også induseres hos mus15,men induksjon hos rotter er mer fordelaktig for in vivo PET-avbildning på grunn av den større størrelsen på rottehjernen sammenlignet med mus.

Det første trinnet i induksjonsmodellen er å være ekstremt forsiktig. Denne modellen ble validert for myelin PET imaging av de Paula Faria et al.10 i 2014, og det ble vist at hastigheten på lysolecithin injeksjon inne i hjernen er avgjørende for en velindusert modell. Injeksjonen må utføres veldig sakte, 1 μL hver 10 min, som en måte å unngå vevsskader. Lysolecithin-oppløsningen bør også tilberedes samme dag som den stereotaktiske injeksjonen, helst like før operasjonen startes. Hvis modellen skal brukes for første gang i en forskningsgruppe, anbefaler vi at modellen skal valideres før du utfører myelin kvantifisering av PET-bildebehandling. Valideringen må inkludere post-mortem vev analyse av myelin farging, for eksempel: Luxol rask blå histologi, som vist i figur 2, og myelin grunnleggende protein (MPB) immunohistochemistry, i de forskjellige tidspunktene som er ment å brukes i in vivo analyse. I resultatseksjonen viste vi en kvantifisering av radiotraceropptak hvor lesjonsinduksjon ikke var godt lyktes, og derfor ble forskjellene ikke oppdaget ved 11C-PIB PET-avbildning.

Lesjonen som kvantifiseres med denne teknikken må være større enn PET-skanneroppløsningen (ca. 1 mm i preklinisk utstyr og ca. 5 mm i klinisk utstyr).

Når modellen er godt indusert, må bildebehandlingsprosedyren være godt planlagt, på grunn av radiotracer merket med karbon-11, som har en kort halveringstid på 20 minutter. Det prekliniske bildelaboratoriet må forberede alt nødvendig materiale, fylle anestesisystemet, sjekke om alt fungerer som det skal, og skrive ut skjemaene som skal fylles ut under eksperimentet. PET-skanneren bør også verifiseres før eksperimentet, når alle kvalitetskontroll som er nødvendige i utstyret (avhengig av hvert land) må utføres for å kontrollere at skanneren fungerer godt. Etter å ha mottatt sporingsenheten til injeksjon, må målingen av aktiviteten også måles i en kalibrert dosekalibrator for å garantere riktig injisert dose, og informasjonen (aktiviteten i sprøyten, før og etter injeksjon) skrevet på skjemaet, samt den respektive tiden da målingen ble utført. Etablere hvilken klokke som skal brukes, som riktig tidspunkt er tiden på arbeidsstasjonen av PET skanneren, tiden som vil bli vurdert i forfall korreksjon av bildene, derfor bør eventuelle klokker som brukes under eksperimentet synkroniseres til skannerarbeidsstasjonen tid.

Under dyrebildeoppkjøp bør temperatur og dyrs pust overvåkes og anestesi justeres etter behov. Temperaturen er stedsavhengig og bør justeres for dyrets velvære. Etter at bildeoppkjøpet er ferdig, er det viktig å holde dyret på en varm pute for å gjenopprette før det returneres til buret.

Bildebehandling er avgjørende for å få pålitelige resultater fra forsøkene ved hjelp av PET-avbildning. Idealet er at analysatoren ikke er klar over dyregruppene og/ eller behandlingen, og at han / hun allerede har erfaring med PET-bilder med PET-traceren som brukes på en slik måte at den garanterer perfekt registrering mellom PET-bildebehandling og MR-mal. Vi brukte PMOD-programvaren i denne protokollen, men hvis denne programvaren ikke er tilgjengelig, kan alternativ bildekvantifiseringsprogramvare brukes, selv om det må gis oppmerksomhet for å oppnå god hjerneregiondefinisjon og kvantifisering. For definisjonen av lesjonsstedet må det tas ekstra forsiktighet for å sikre at det injiserte stedet er inne i den tegnede lesjonen VOI (kunnskap om rottehjerneanatomi er nødvendig).

Det er viktig å si at myelin PET-avbildning også kan utføres i andre MS-dyremodeller, og viser uforutsigbare lesjoner, som allerede vist av vår gruppe i Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) marmoset modell5. Som allerede nevnt, er den viktige parameteren å vurdere i lesjonskvantifisering PET-skanneroppløsningen, som er begrensningen for påvisning av lesjoner som er for små. PET-bildebehandling er en bildeteknikk med dårlig oppløsning sammenlignet med andre teknikker som MR, men det er en svært spesifikk modalitet, og på grunn av dette bruker kvantifisering av PET-bildene en anatomisk mal, for eksempel MR, for å bidra til å trekke interesseområdet, som vist i protokollen ovenfor.

Selv om den manuelle tegningen av VOIer er operatøravhengig, er det det beste alternativet for LPC-dyremodellen, siden lesjonen kan være variabel mellom dyr. For å redusere skjevhet i kvantifiseringsprosessen, er det viktig å utføre et speil VOI, som forklart i protokollen, som vil være i samme region og av samme størrelse som den injiserte siden. Det er også viktig å ha de stereotoksiske koordinatene i tankene når du tegner VOI i MR-malen for å garantere at riktig hjerneregion vurderes. Bruk av myelinfarging som en guide for å identifisere det demyelinerte området kan også hjelpe i tegningen, som forklart i de Paula Faria12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

β -kube utstyr (Molecubes NV, Belgia) ble støttet av São Paulo Research Foundation, FAPESP - Brasil (#2018/15167-1). LES har et ph.d.-stipend fra FAPESP - Brasil (#2019/15654-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance Marte AUWZZOD max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer Nanitech 15800
Beta-cube Molecubes
Bulldog clamp Stoelting 5212043P
clorexidine Rioquimica 0.5%/100 mL
Cotton swabs johnson e johnson
Dose calibrator Capintech
Drill Kinzo powertools 352901 Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube Eppendorf 30125150 1.5 mL
Eye lubricant ADVFARMA 30049099  vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps Stoelting 52102-38P
Gloves Descarpack 212101  6.5 size
Heating pad Softhear
Injection Syringe Hamilton 80314 10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe BD 328328 1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane Cristália 410525 100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic Sanofi 100 mg/2 mL
lidocaine Hipolabor 1.1343.0102.001-5 2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk Sigma-aldrich L-4129 25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder Stoelting 5212290P
Oxygen White Martins 7782-44-7 Compressed gas
PMOD software PMOD technologies Version 4.1 module fuse it
Rat anesthesia mask KOPF Model 906
Saline Farmace 0543325/ 14-8 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades Stoelting 52173-10
Scapel handles Stoelting 52171P
Scissor Stoelting 52136-50P
Semi-analytical Balance Quimis BK-3000 max:3,100 g; min:0.2 g
shaver Mega profissional AT200 model
Stereotactic Apparatus KOPF Nodel 900
Universal holder with needle support KOPF Model 1772-F1 Hamilton support for 5 and 10 µL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
  2. Sand, I. K. Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis. Current Opinion in Neurology. 28 (3), 193-205 (2015).
  3. Thompson, A. J., et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurology. 17 (2), 162-173 (2018).
  4. Veronese, M., et al. Quantification of C-11 PIB PET for imaging myelin in the human brain: a test-retest reproducibility study in high-resolution research tomography. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (11), 1771-1782 (2015).
  5. Carvalho, R. H. F., et al. C-11 PIB PET imaging can detect white and grey matter demyelination in a non-human primate model of progressive multiple sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 35, 108-115 (2019).
  6. Stankoff, B., et al. Imaging central nervous system myelin by positron emission tomography in multiple sclerosis using [methyl-(1)(1)C]-2-(4'-methylaminophenyl)- 6-hydroxybenzothiazole. Annals of Neurology. 69 (4), 673-680 (2011).
  7. Faria, D. D. Myelin positron emission tomography (PET) imaging in multiple sclerosis. Neural Regeneration Research. 15 (10), 1842-1843 (2020).
  8. Pietroboni, A. M., et al. Amyloid PET as a marker of normal-appearing white matter early damage in multiple sclerosis: correlation with CSF -amyloid levels and brain volumes. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46 (2), 280-287 (2019).
  9. Pytel, V., et al. Amyloid PET findings in multiple sclerosis are associated with cognitive decline at 18 months. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 39, (2020).
  10. Faria, D. dP., et al. PET imaging of glucose metabolism, neuroinflammation and demyelination in the lysolecithin rat model for multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal. 20 (11), 1443-1452 (2014).
  11. Rinaldi, M., et al. Galectin-1 circumvents lysolecithin-induced demyelination through the modulation of microglial polarization/phagocytosis and oligodendroglial differentiation. Neurobiology of Disease. 96, 127-143 (2016).
  12. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis comparison of [C-11]MeDAS, [C-11]CIC and [C-11]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  13. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis: comparison of [11C]MeDAS, [11C]CIC and [11C]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  14. vander Star, B. J., et al. In Vitro and In Vivo Models of Multiple Sclerosis. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets. 11 (5), 570-588 (2012).
  15. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216 (2015).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 168 11C-PIB PET-avbildning myelin multippel sklerose molekylær avbildning lysolecithin rottemodell VOI-analyse

Erratum

Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.

The citation was updated from:

de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

to:

de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Positron Utslipp Tomografi Imaging for <em>In Vivo</em> Måling av Myelin Innhold i Lysolecithin Rotte Modell av Multippel Sklerose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Paula Faria, D., Real, C. C.,… More

de Paula Faria, D., Real, C. C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter