Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

Zusammenfassung

Mit Hilfe von Quantenpunkt-markierter DNA und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie können wir den Reaktionsmechanismus von Restriktionsendonukleasen untersuchen, während wir unmarkierte Proteine verwenden. Diese Einzelmolekültechnik ermöglicht die massiv gemultiplexte Beobachtung einzelner Protein-DNA-Wechselwirkungen, und Daten können gepoolt werden, um gut bevölkerte Verweilzeitverteilungen zu erzeugen.

Zusammenfassung

Dieser neuartige, auf der Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie basierende Assay ermöglicht die gleichzeitige Messung der Länge des katalytischen Zyklus für Hunderte von einzelnen Restriktionsendonuklease (REase)-Molekülen in einem Experiment. Dieser Assay erfordert keine Proteinmarkierung und kann mit einem einzigen Bildgebungskanal durchgeführt werden. Darüber hinaus können die Ergebnisse mehrerer Einzelexperimente gepoolt werden, um gut gefüllte Verweilzeitverteilungen zu erzeugen. Die Analyse der resultierenden Verweilzeitverteilungen kann helfen, den DNA-Spaltungsmechanismus aufzuklären, indem sie das Vorhandensein von kinetischen Schritten aufdeckt, die nicht direkt beobachtet werden können. Beispieldaten, die mit diesem Assay mit der gut untersuchten REase EcoRV - einer dimeren Typ-IIP-Restriktionsendonuklease, die die palindromische Sequenz GAT↓ATC (wobei ↓ die Schnittstelle ist) - gesammelt wurden, stimmen mit früheren Studien überein. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es mindestens drei Schritte auf dem Weg zur DNA-Spaltung gibt, der durch die Einführung von Magnesium eingeleitet wird, nachdem EcoRV die DNA in deren Abwesenheit gebunden hat, mit einer durchschnittlichen Rate von 0,17 ^s-1 für jeden Schritt.

Einleitung

Restriktionsendonukleasen (REasen) sind Enzyme, die sequenzspezifische Doppelstrangbrüche in der DNA bewirken. Die Entdeckung von REasen in den 1970er Jahren führte zur Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie, und diese Enzyme sind heute unverzichtbare Laborwerkzeuge für die genetische Veränderung und Manipulation¹. Typ-II-REasen sind die am weitesten verbreiteten Enzyme dieser Klasse, da sie die DNA an einer festen Stelle entweder innerhalb oder in der Nähe ihrer Erkennungssequenz spalten. Es gibt jedoch eine große Variation zwischen den Typ-II-REasen, und sie werden in mehrere Subtypen unterteilt, die auf bestimmten enzymatischen Eigenschaften basieren, anstatt nach ihren evolutionären Beziehungen klassifiziert zu werden. Bei jedem Subtyp gibt es häufige Ausnahmen vom Klassifikationsschema, und viele Enzyme gehören zu mehreren Subtypen². Tausende von Typ-II-REasen wurden identifiziert, und Hunderte von ihnen sind kommerziell erhältlich.

Trotz der Vielfalt unter den Typ-II-REasen wurden jedoch nur sehr wenige REasen im Detail untersucht. Laut REBASE, der von Sir Richard Roberts 1975 gegründeten Datenbank für Restriktionsenzyme³, liegen für weniger als 20 dieser Enzyme veröffentlichte Kinetikdaten vor. Während einige REasen direkt auf Einzelmolekülebene beobachtet wurden, während sie entlang der DNA diffundierten, bevor sie auf ihre Erkennungssequenz^trafen 4,5,6,7, gibt es nur sehr wenige Einzelmolekülstudien über ihre Spaltreaktionskinetik. Die vorhandenen Studien liefern entweder keine ausreichenden Statistiken, um eine detaillierte Analyse der Variation der Zeitpunkte durchzuführen, zu denen einzelne Spaltungsereignisse stattfinden ^8,9,10, oder sie sind nicht in der Lage, die vollständige Verteilung der Spaltungszeiten^{zu erfassen 11}. Diese Art der Analyse kann das Vorhandensein von relativ langlebigen kinetischen Zwischenprodukten aufdecken und könnte zu einem besseren Verständnis der Mechanismen der REase-vermittelten DNA-Spaltung führen.

Auf der Ebene der Einzelmoleküle sind biochemische Prozesse stochastisch - die Wartezeit auf das Auftreten einer einzelnen Instanz des Prozesses, τ, ist variabel. Bei vielen Messungen von τ kann jedoch erwartet werden, dass sie einer Wahrscheinlichkeitsverteilung (p(τ) folgen, die auf die Art des stattfindenden Prozesses hinweist. Zum Beispiel gehorcht ein einstufiger Prozess, wie z. B. die Freisetzung eines Produktmoleküls aus einem Enzym, der Poisson-Statistik, und p(τ) nimmt die Form einer negativen Exponentialverteilung an:

wobei β die mittlere Wartezeit ist. Beachten Sie, dass die Geschwindigkeit des Prozesses k gleich 1/β ist, dem Kehrwert der mittleren Wartezeit. Bei Prozessen, die mehr als einen Schritt erfordern, ist p(τ) die Faltung der einfachen Exponentialverteilungen für jeden der einzelnen Schritte. Eine allgemeine Lösung für die Faltung von N einfach-exponentiellen Zerfallsfunktionen mit identischen mittleren Wartezeiten, β, ist die Gamma-Wahrscheinlichkeitsverteilung:

Dabei ist Γ(N) die Gamma-Funktion, die die Interpolation der Fakultät von N-1 zu nicht-ganzzahligen Werten von N beschreibt. Obwohl diese allgemeine Lösung als Annäherung verwendet werden kann, wenn die mittleren Wartezeiten einzelner Schritte ähnlich sind, muss verstanden werden, dass das Vorhandensein relativ schneller Schritte durch Schritte mit deutlich längeren Wartezeiten maskiert wird. Mit anderen Worten, der Wert von N stellt eine untere Grenze für die Anzahl der Schritte¹² dar. Bei einer ausreichenden Anzahl von Wartezeitmessungen können die Parameter β und N geschätzt werden, indem die Ereignisse klassifiziert und die Gammaverteilung an das resultierende Histogramm angepasst wird, oder indem ein Maximum-Likelihood-Schätzansatz verwendet wird. Diese Art der Analyse kann daher das Vorhandensein von kinetischen Schritten aufdecken, die in Ensemble-Assays nicht leicht aufgelöst werden können und eine große Anzahl von Beobachtungen erfordern, um die Parameter genau zu schätzen^12,13.

In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, mit der mit Quantenpunkten markierte DNA und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) Hunderte von einzelnen REase-vermittelten DNA-Spaltungsereignissen parallel beobachtet werden können. Das Design des Assays ermöglicht es, die Ergebnisse mehrerer Experimente zu bündeln und Verweilzeitverteilungen mit Tausenden von Ereignissen zu erstellen. Die hohe Photostabilität und Helligkeit der Quantenpunkte ermöglichen eine Zeitauflösung von 10 Hz, ohne die Fähigkeit zu beeinträchtigen, Spaltungsereignisse zu beobachten, die auch viele Minuten nach dem Start des Experiments auftreten. Die gute zeitliche Auflösung und ein breiter dynamischer Bereich, kombiniert mit der Möglichkeit, einen großen Datensatz zu sammeln, ermöglichen eine genaue Charakterisierung der Verweilzeitverteilungen, um das Vorhandensein mehrerer kinetischer Schritte in den Spaltungswegen von REasen aufzudecken, die Umsatzraten im Bereich von 1 ^min-1 aufweisen. Im Fall von EcoRV können drei kinetische Schritte aufgelöst werden, die alle auf andere Weise identifiziert wurden, was bestätigt, dass der Assay empfindlich auf das Vorhandensein solcher Schritte reagiert.

Duplex-DNA-Substrate, die die interessierende Erkennungssequenz enthalten, werden hergestellt, indem ein biotinyliertes Oligonukleotid an einen komplementären Strang geglüht wird, der mit einem einzelnen, kovalent gebundenen Halbleiter-Nanokristall-Quantenpunkt markiert ist. Diese Substrate werden in einen Strömungskanal eingebracht, der auf einem Glasdeckglas aufgebaut ist, an dessen Oberfläche ein Rasen aus hochmolekularen Polyethylenglykol (PEG)-Molekülen befestigt ist. Die DNA-Substrate werden über eine Biotin-Streptavidin-Biotin-Bindung von einem Teil der PEG-Moleküle eingefangen, die an ihrem freien Ende ein Biotin haben. In der TIRF-Mikroskopie sorgt eine evaneszente Welle, die exponentiell mit zunehmender Entfernung von der Glas-Flüssig-Grenzfläche abklingt, für Beleuchtung; Die Eindringtiefe liegt in der Größenordnung der Wellenlänge des verwendeten Lichts. Unter diesen Bedingungen werden nur Quantenpunkte angeregt, die durch ein DNA-Molekül an die Oberfläche gebunden sind, das auf der funktionalisierten Glasoberfläche eingefangen wurde. Quantenpunkte, die in Lösung frei sind, werden innerhalb des beleuchteten Bereichs nicht eingeschränkt und leuchten daher nicht. Wenn die DNA, die einen Quantenpunkt an die Oberfläche bindet, gespalten wird, kann dieser Quantenpunkt frei von der Oberfläche weg diffundieren und verschwindet aus dem Fluoreszenzbild.

Obwohl bekannt ist, dass viele Typ-II-REasen in Abwesenheit von^{Magnesium 14} DNA binden, benötigen alle Magnesium, um die DNA-Spaltung^{zu vermitteln 15}. Diese REasen können die oberflächenimmobilisierte DNA in Abwesenheit von Magnesium binden. Wenn magnesiumhaltiger Puffer durch einen Kanal fließt, in dem REase an die DNA vorgebunden ist, beginnt die Spaltung sofort, was durch das Verschwinden der Quantenpunkte angezeigt wird. Die Synchronisation, die durch die Vorbindung der REase-Moleküle und die anschließende Initiierung der DNA-Spaltung durch die Einführung von Magnesium erreicht wird, erleichtert die Messung der Verzögerungszeit bis zum Abschluss der DNA-Spaltung unabhängig für jedes Molekül in der Population der Enzyme, die in einem Experiment beobachtet wurden. Fluorescein ist als Tracerfarbstoff in dem magnesiumhaltigen Puffer enthalten, um die Ankunft von Magnesium im Sichtfeld anzuzeigen. Da kein Enzym in dem magnesiumhaltigen Puffer enthalten ist, gibt die Verzögerungszeit von der Ankunft des magnesiumhaltigen Puffers bis zum Verschwinden jedes Quantenpunkts die Zeit an, die eine bereits an die DNA gebundene REase benötigt, um die DNA zu spalten und den Quantenpunkt von der Glasoberfläche freizusetzen. Das Verschwinden von Quantenpunkten geschieht schnell und führt zu einer starken Abnahme der Intensitätskurve, was einen klaren Hinweis auf den Zeitpunkt gibt, zu dem ein bestimmtes DNA-Molekül gespalten wird. Die Bestimmung der Ereigniszeiten erfolgt durch die mathematische Analyse von Intensitätsverläufen, und ein typisches Experiment führt zu Hunderten von identifizierbaren Spaltungsereignissen. Die Ergebnisse mehrerer Experimente können zusammengefasst werden, um angemessene Statistiken zu liefern, die eine Schätzung der Parameter N und β entweder durch nichtlineare Analysen der kleinsten Quadrate oder durch Maximum-Likelihood-Analysen ermöglichen.

Protokoll

1. Allgemeine Informationen

1. Oligonukleotid-Design
   HINWEIS: Das 60 Basenpaare (bp) lange DNA-Substrat wird aus einem Paar komplementärer Oligonukleotide mit einer Duplex-Schmelztemperatur von 75 °C in 100 mM NaCl gebildet.
   1. Bestellen Sie ein Oligonukleotid, das mit einer einzelnen 5'-Biotin-Modifikation synthetisiert wird, und das andere mit einer 5'-Thiol-Modifikation (mit einem Sechs-Kohlenstoff-Spacer). Platzieren Sie die Erkennungsstelle in der Mitte des Duplexbereichs.
      HINWEIS: Die Oligonukleotidsequenzen zur Verwendung mit EcoRV sind unten dargestellt (Erkennungsstelle in Fett).
      5' Biotin - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' Thiol - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. Verwenden Sie für alle Schritte Reinstwasser mit einem spezifischen Widerstand von 18 MOhm.
3. Schützen Sie alle Lösungen, die Quantenpunkte enthalten, vor Licht, um Photobleiche zu verhindern.
4. Verwenden Sie eine Druckluftquelle, um dieses Protokoll abzuschließen.

2. Herstellung von Quantenpunkt-markierten DNA-Substratmaterialien

ANMERKUNG: Neben den oben beschriebenen Oligonukleotiden siehe Materialtabelle für andere Materialien und Tabelle 1 für Puffer, die für die Herstellung von Quantenpunkt-markierten DNA-Substraten erforderlich sind.

1. Reduzieren Sie 5'-Thiolgruppen auf dem Oligonukleotid, das an Quantenpunkte gekoppelt werden soll.
   1. Jedes thiolierte Oligonukleotid wird in Wasser in einer Konzentration von 100 μM resuspendiert.
   2. Pipettieren Sie 650 μl Wasser in eine Spin-Säule mit Größenausschluss für jede Oligonukleotidprobe und wirbeln Sie sie ~15 s lang ein. Lassen Sie die Säule 30 Minuten lang packen.
   3. Bereiten Sie unmittelbar vor jedem Gebrauch frische 100 mM Dithiothreitol (DTT)-Lösung vor, da DTT in Lösung schnell abgebaut wird. Öffnen Sie vorsichtig eine Durchstechflasche mit 7,7 mg DVB-T und pipettieren Sie 500 μl Natriumphosphatpuffer in die Durchstechflasche. Vortex, um gründlich zu mischen.
   4. Für jedes resuspendierte Oligonukleotid wird ein frisches Röhrchen vorbereitet und 50 μl des Oligonukleotids und 50 μl DTT-Lösung in das Röhrchen gegeben. Zum Mischen nach oben und unten pipettieren. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Disulfidbindungen zwischen den oxidierten Thiolgruppen am 5'-Ende der Oligonukleotide zu reduzieren.
   5. Entfernen Sie die Spin-Säulenkappen und setzen Sie jede Säule in das Auffangröhrchen ein. Die Spin-Säulen werden 2 Minuten lang bei 750 × g zentrifugiert und das Eluat verworfen.
   6. Übertragen Sie die Spin-Säulen in frische Zentrifugenröhrchen. Das gesamte Volumen (100 μl) einer Probe des DNA/DTT-Gemisches wird vorsichtig auf jede vorbereitete Säule pipetiert. Zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 750 × g und messen Sie die Extinktion des Eluats bei 260 nm, um zu bestätigen, dass die Konzentration etwa 40 μM beträgt.
   7. Proben, die nicht sofort verwendet werden, sind bei -20 °C zu lagern, um die Oxidation der Thiolgruppen und die Bildung von Disulfidbindungen zu verhindern.
2. Kopplung von DNA an Quantenpunkte
   1. Pipettieren Sie für jedes herzustellende Konstrukt ein Aliquot von 50 μl des Quantenpunktstocks in ein Dialysegerät, wobei Sie darauf achten müssen, die Membran nicht mit der Pipettenspitze zu berühren. Dialysieren Sie gegen ein Volumen von N-Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure (CHES)-Puffer, das mindestens das 1000-fache des Probenvolumens beträgt, und rühren Sie 15 Minuten lang bei ~100 U/min.
   2. Bereiten Sie unmittelbar vor jedem Gebrauch eine frische 6 mM Lösung von Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) in CHES-Puffer vor. Öffnen Sie vorsichtig eine Durchstechflasche mit 2 mg Sulfo-SMCC und pipettieren Sie 800 μl CHES-Puffer in die Durchstechflasche. Vortex, um gründlich zu mischen.
   3. Entnehmen Sie mit einer Pipette vorsichtig die suspendierten Quantenpunkte aus dem Dialysegerät und überführen Sie sie in ein frisches Röhrchen, das das gleiche Volumen der Sulfo-SMCC-Lösung enthält. Zum Mischen nach oben und unten pipettieren. 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 1000 U/min inkubieren, damit das Sulfo-SMCC mit den primären Aminen auf den Quantenpunkten reagieren kann.
   4. Übertragen Sie jede Probe mit einer Pipette vorsichtig in ein frisches Dialysegerät. Um überschüssiges Sulfo-SMCC zu entfernen, dialysieren Sie 15 Minuten lang unter Rühren gegen ein Volumen des CHES-Puffers, das mindestens dem 1000-fachen des in dem/den Dialysegerät(en) enthaltenen Volumens entspricht. Tauschen Sie den Puffer 2x aus und führen Sie die Dialyse mit frischem CHES-Puffer insgesamt 3x durch, so dass die Dialyse 15 Minuten nach jedem Pufferwechsel fortgesetzt werden kann.
   5. Um den Puffer zur Vorbereitung der zweiten Reaktion auszutauschen, übertragen Sie die Dialysegeräte in ein Becherglas mit einem Volumen an phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), das mindestens dem 1000-fachen des in den Geräten enthaltenen Volumens entspricht. Dialysieren Sie 15 Minuten lang unter Rühren, tauschen Sie den Puffer 2x aus und führen Sie die Dialyse mit frischem PBS insgesamt 3x durch, so dass die Dialyse nach jedem Pufferwechsel 15 Minuten lang fortgesetzt werden kann.
   6. Gewinnen Sie mit einer Pipette vorsichtig die Lösung mit den Quantenpunkten aus dem/den Dialysegerät(en) und überführen Sie jede Probe in ein frisches Röhrchen, das eine äquimolare Menge an thioliertem Oligonukleotid enthält, das in PBS verdünnt ist. Kombinieren Sie ein gleiches Volumen PBS und ein¹ /10 des Volumens der reduzierten und gereinigten Oligonukleotidprobe (ca. 40 μM Konzentration), da die Quantenpunktkonzentration zu diesem Zeitpunkt ~4 μM beträgt. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren und bei 1000 U/min schütteln.
   7. Jede Probe wird mit Rinderserumalbumin (BSA, 10 mg/ml) versorgt, um eine BSA-Endkonzentration von 0,5 mg/ml zu erhalten. Übertragen Sie jede Probe vorsichtig mit einer Pipette in ein frisches Dialysegerät und dialysieren Sie gegen ein Volumen des Speicherpuffers, das mindestens dem 1000-fachen des in dem/den Dialysegerät(en) enthaltenen Volumens entspricht. Tauschen Sie den Puffer 2x aus und führen Sie die Dialyse mit frischem Lagerpuffer insgesamt 3x durch, so dass die Dialyse nach jedem Pufferwechsel 15 Minuten lang fortgesetzt werden kann.
   8. Entnehmen Sie jede Probe vorsichtig mit einer Pipette, geben Sie sie in ein frisches Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 °C.
      HINWEIS: Nicht bei -20 °C lagern, da Quantenpunkte durch Einfrieren beschädigt werden.
3. Annealing von quantenpunktmarkiertem Oligonukleotid zu biotinyliertem Oligonukleotid
   1. Jedes biotinylierte Oligonukleotid wird in einem Lagerpuffer in einer Konzentration von 100 μM resuspendiert. Nicht verwendete Proben werden bei -20 °C gelagert.
   2. Kombinieren Sie eine Probe eines mit Quantenpunkten markierten Oligonukleotids mit einem 10-fachen molaren Überschuss an biotinyliertem Oligonukleotid. Da die geschätzte DNA-Konzentration in der mit Quantenpunkten markierten Probe 2 μM beträgt, fügen Sie 0,2 μl biotinyliertes Oligonukleotid pro 10 μl dieser Probe hinzu.
   3. Die Mischung in einem Heizblock auf 75 °C erhitzen (die Schmelztemperatur für den Komplementärbereich). Bei dieser Temperatur 5 Minuten halten. Schalten Sie den Heizblock aus und lassen Sie ihn langsam abkühlen. Lagern Sie das fertige Konstrukt bei 4 °C; Nicht einfrieren.

3. Oberflächenfunktionalisierung von Deckgläsern

HINWEIS: Dieser Vorgang wurde bereits in anderen JoVE-Videoprotokollen^16,17 beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt eine angepasste Version des Verfahrens mit geringfügigen Änderungen, um einen kleineren Objektträger aufzunehmen. In der Materialtabelle finden Sie weitere Materialien, die für die Oberflächenfunktionalisierung von Deckgläsern erforderlich sind.

1. Legen Sie 5 Deckgläser in jeden Deckglashalter. Achten Sie darauf, zwischen jedem Deckglaspaar ein Leerzeichen zu überspringen, damit sie nicht aneinander kleben. Legen Sie die Deckgläser in ihren Halter in ein Glas mit Deckel, geben Sie Ethanol in das Glas, bis die Deckgläser bedeckt sind, und schrauben Sie den Deckel fest fest. Stellen Sie das gesamte Glas in das Wasser des Badbeschallungsgeräts, ohne es vollständig einzutauchen, und beschallen Sie es 30 Minuten lang.
2. Füllen Sie ein sauberes Becherglas oder Glas mit Reinstwasser. Entferne die Deckgläser in ihrer Halterung mit einer Metallpinzette vom Ethanol und tauche sie zum Spülen in Wasser. Füllen Sie dann die Deckgläser und den Halter in ein Glas mit einer 1 M Kaliumhydroxid (KOH)-Lösung. Schrauben Sie den Deckel fest auf, stellen Sie das Glas in das Beschallungsbad und beschallen Sie es 30 Minuten lang.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit der KOH-Lösung, da sie ätzend und reizend ist.
3. Wiederholen Sie die Beschallung in Ethanol und KOH-Lösung und spülen Sie die Deckgläser zwischen den einzelnen Schritten wie oben beschrieben mit Wasser ab.
4. Übertragen Sie die Deckgläser in ihrem Halter in ein sauberes Glas, das mit reinem Aceton gefüllt ist. Beenden Sie die Reinigung, indem Sie das Glas wie oben beschrieben 30 Minuten lang beschallen. Nach diesem Schritt nicht mit Wasser abspülen.
5. Übertragen Sie die Deckgläser in ihrem Halter mit einer Metallpinzette in ein sauberes 100-ml-Becherglas, das 80 mL frisches Aceton und einen Mikrorührstab enthält. Stellen Sie den Becher auf eine magnetische Rührplatte, die auf mindestens 1.000 U/min eingestellt ist. Während das Aceton kräftig gerührt wird, pipettieren Sie 1,6 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in das Becherglas, um eine 2%ige v/v-Lösung herzustellen.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie APTES pipettieren, da es ätzend ist.
6. Lassen Sie die Deckgläser 2 Minuten lang in der Lösung inkubieren, dann verwenden Sie eine Metallzange, um die Deckgläser in ihrem Halter in ein Becherglas mit Wasser zu übertragen, um die Reaktion zu löschen. Spülen Sie die Deckgläser noch zwei Mal aus und ersetzen Sie das Wasser im Becherglas.
7. Das silanisierte Glas im Backofen bei 120 °C 75 min härten. Wenn Sie nicht sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren, lagern Sie die Deckgläser maximal einige Tage lang unter Vakuum.
8. Löse N-Hydroxysuccinimid (NHS)-ester-derivatisierte Polyethylenglykole (PEGs) in 100 mM Natriumbicarbonat (pH 8,2). Verwenden Sie ein Verhältnis von 10:1 von methoxyterminiertem PEG zu Biotin-terminiertem PEG mit ~100 mg/ml methoxyterminiertem PEG.
9. Pipettieren Sie 100 μl der PEG-Lösung auf die Hälfte der trockenen silanisierten Deckgläser und bedecken Sie jedes mit einem zweiten Deckglas. Verwenden Sie kleine Stücke Parafilm, die an jeder Ecke als Abstandshalter platziert werden, um zu verhindern, dass die Deckgläser aneinander kleben.
10. Inkubieren Sie die Deckgläser 3,5 h lang in einer feuchten Umgebung. Trennen Sie die Deckglas-Sandwiches. Waschen Sie jedes Deckglas mit einer Spritzflasche mit reichlich Wasser und trocknen Sie es mit Druckluft.
11. Lagern Sie funktionalisierte Deckgläser unter Vakuum. Achten Sie darauf, die PEG-behandelte Seite nach oben zu halten, da die andere Seite das DNA-Substrat nicht einfängt.

4. Bau mikrofluidischer Geräte

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie weitere Materialien, die für die Konstruktion des mikrofluidischen Geräts erforderlich sind.

1. Bohren Sie mit einem handgeführten Rotationsmultitool, das mit einem konischen Diamantschleifer ausgestattet ist, zwei Löcher in gegenüberliegende Ecken des Quarzschlittens, die als Ein- und Auslass dienen. Achten Sie darauf, den Schlitten an Ort und Stelle zu sichern, den Bohrer zu schmieren und während des Bohrens ständig mit Wasser zu gleiten. Nach jedem Experiment den vorbereiteten Quarzobjektträger zur Wiederverwendung zurückgewinnen, indem Sie ein gebrauchtes Gerät in Aceton einweichen, um den Klebstoff und das Epoxidharz aufzulösen. Verwerfen Sie die restlichen Komponenten.
   HINWEIS: Das Bohren kann von Hand durchgeführt werden, aber die Verwendung eines Presshalters für das Multitool erleichtert den Vorgang.
2. Kombinieren Sie 25 μl Streptavidin-Lösung mit 80 μl PBS und 20 μl Blockierungspuffer. Bestreichen Sie ein mit PEG behandeltes Deckglas mit dieser Mischung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang in einer feuchten Umgebung.
3. Bereiten Sie während der Inkubation des Deckglases den Imaging-Spacer vor, um einen Strömungskanal zu erstellen. Schneiden Sie ein 1 Zoll großes quadratisches Stück Abstandshaltermaterial ab und markieren Sie dann einen 2 mm breiten Kanal, der an den Enden der Löcher ausgerichtet ist, die in den Quarzschlitten gebohrt wurden (Abbildung 2). Schneiden Sie den Kanal mit einem Skalpell aus dem Abstandsmaterial heraus.
4. Ziehen Sie eine Seite der Rückseite vom Bildabstandshalter ab und legen Sie sie vorsichtig auf den Quarzdia, wobei Sie darauf achten, dass die Einlass- und Auslasslöcher nicht verdeckt werden. Achten Sie darauf, den Quarzobjektträger gründlich mit Aceton zu reinigen, um alle Klebstoffreste von früheren Experimenten zu entfernen.
5. Waschen Sie den Deckglas mit Wasser und trocknen Sie ihn mit Druckluft. Entfernen Sie die andere Seite der Rückseite vom Abstandshalter und klemmen Sie sie zwischen den Quarzobjektträger und das funktionalisierte, mit Streptavidin beschichtete Deckglas, indem Sie die Baugruppe mit der Kunststoffpinzette zusammendrücken und Luftblasen aus dem Klebstoff entfernen.
6. Führen Sie in jedes Loch des Quarzschiebers einen 30 cm langen Polyethylenschlauch ein. Achten Sie darauf, die Enden des Schlauchs schräg abzuschneiden, um einen freien Fluss der Lösung zu gewährleisten. Verwenden Sie ein Röhrchengestell oder eine andere Stütze, um die Röhrchen an Ort und Stelle zu halten, und versiegeln Sie die Röhrchen an Ort und Stelle und die Kanten des zusammengebauten Geräts mit Epoxidharz.
   HINWEIS: Es funktioniert gut, das Gerät auf einem Stück Parafilm zu bauen, der sich leicht von der Unterseite abziehen lässt, wenn das Epoxidharz ausgehärtet ist.
7. Sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist, führen Sie die stumpfe Nadel der leeren Spritze in das Auslassrohr des Geräts ein und tauchen Sie das Ende des Einlassrohrs in einen mit Blockierungspuffer gefüllten Behälter. Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um das Gerät mit Blockierungspuffer zu füllen. Lassen Sie das Gerät vor der Verwendung mindestens 30 Minuten lang inkubieren.

5. Oberflächen-Tethering von Quantenpunkt-markiertem DNA-Substrat

HINWEIS: Neben dem oben beschriebenen mikrofluidischen Gerät, DNA-Substrat und Blockierungspuffer finden Sie in der Materialtabelle für andere Materialien und in Tabelle 1 für Puffer, die für die Oberflächenbindung von Quantenpunkt-markierten DNA-Substraten erforderlich sind.

1. Befestigen Sie das mikrofluidische Gerät mit Klebeband an der Tischplatte des Mikroskops, bringen Sie das Objektiv in Kontakt mit der Unterseite des Geräts und positionieren Sie das Objektiv so, dass sich das Sichtfeld innerhalb des mikrofluidischen Kanals befindet.
2. Spülen Sie den mikrofluidischen Kanal mit frischem Blockpuffer, indem Sie den Spritzenkolben zurückziehen, nachdem Sie den Auslassschlauch an die Spritzenpumpe angeschlossen haben. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen im Schlauch oder im Kanal eingeschlossen sind.
   HINWEIS: Achten Sie ab diesem Zeitpunkt darauf, dass sich das Einlaufrohr in Flüssigkeit befindet, damit keine Luftblasen in das Gerät gelangen.
3. 1 μl des vorbereiteten DNA-Substrats in 1 ml Blockierungspuffer verdünnen. Setzen Sie das Einlassröhrchen in das verdünnte DNA-Substrat ein und lassen Sie 800 μl der Substratlösung mit einer Geschwindigkeit von 200 μl/min durch den Kanal fließen. Lassen Sie die DNA-Lösung 15 Minuten lang ungestört im Kanal inkubieren, nachdem der Fluss gestoppt wurde.
4. Mindestens 800 μl Blockierungspuffer werden mit einer Geschwindigkeit von 200 μl/min durch den Kanal geleitet, um die ungebundene DNA aus dem Kanal zu spülen.
5. Passen Sie die Laserleistung, den Mikroskopfokus und den TIRF-Winkel so an, dass die oberflächengebundenen Quantenpunkte deutlich sichtbar sind.
   HINWEIS: Obwohl Quantenpunkte nicht schnell ausbleichen, ist es am besten, die Leistung so gering wie möglich zu halten, um das Blinken zu minimieren.

6. REase-vermittelte DNA-Spaltung

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie die Materialien und in Tabelle 1 die Puffer, die für die REase-vermittelte DNA-Spaltung erforderlich sind.

1. Stellen Sie sicher, dass die Kamera auf die optimale Betriebstemperatur gekühlt und für Highspeed-Streaming mit einer Belichtungszeit von 0,10 s eingerichtet ist. Seien Sie darauf vorbereitet, ~4 Minuten lang Daten zu sammeln.
2. Spülen Sie das mikrofluidische Gerät mit 800 μl experimentellem Puffer ohne Magnesium bei einer Durchflussrate von 200 μl/min.
3. Die REase wird in ein Aliquot (1 ml) experimenteller Puffer ohne Magnesium gegeben und durch Pipettieren vorsichtig gemischt. Verwenden Sie 4 μl von 100.000 Einheiten/ml, was 400 Einheiten/ml EcoRV entspricht. 800 μl des verdünnten Enzyms mit einer Durchflussrate von 200 μl/min durch den Kanal fließen lassen.
4. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie einen experimentellen Puffer mit Magnesium und Fluorescein mit einer Durchflussrate von 200 μl/min fließen lassen. Beginnen Sie sofort nach dem Starten der Spritzenpumpe mit der Datenerfassung. Nachdem 800 μl Puffer geflossen sind, stoppen Sie die Datenerfassung.

7. Datenanalyse

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie die für dieses Protokoll verwendete Datenanalysesoftware, und nehmen Sie Anpassungen vor, wenn Sie eine andere Analyseplattform verwenden.

1. Nullpunktbestimmung
   1. Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz von jedem Bild des Experimentalfilms mit der Imtophat-Funktion , einer integrierten morphologischen Top-Hat-Filterfunktion in der Image Processing Toolbox. Wählen Sie eine Scheibe mit einem Radius von drei Pixeln als Strukturierungselement aus. Ermitteln Sie die Hintergrundintensität, indem Sie das gefilterte Bild vom Originalbild subtrahieren.
      HINWEIS: Der Filter behält nur Bildmerkmale bei, die heller als der Hintergrund und kleiner als das Strukturierungselement sind.
   2. Mittelung des subtrahierten Hintergrunds über jedes Filmbild. Verwenden Sie eine Trajektorie dieses Werts, um den Nullzeitpunkt für das Experiment zu bestimmen (Abbildung 3A). Bestimmen Sie den Startzeitpunkt, indem Sie das erste Bild ermitteln, bei dem die Anstiegsrate das 3-fache der Standardabweichung der Änderungsrate während des Totvolumenstroms überschreitet.
      HINWEIS: Ein starker Anstieg der Änderungsrate des Durchschnittswerts des subtrahierten Hintergrunds für jedes Filmbild zeigt den Zeitpunkt an, zu dem der letzte experimentelle Puffer mit dem Tracerfarbstoff in die Durchflusszelle eingetreten ist (Abbildung 3B).
2. Berechnung und Analyse der Quantenpunktintensität
   1. Berechnen Sie eine Projektion mit maximaler Intensität für den Satz von hintergrundkorrigierten Filmbildern, die vor dem Eintreffen des Tracerfarbstoffs aufgenommen wurden. Bestimmen Sie die Positionen von Quantenpunkten in diesem Projektionsbild mit einer Genauigkeit von einem Pixel mithilfe einer Peak-Finding-Funktion wie z. B. pkfnd.
   2. Generieren Sie Intensitätstrajektorien für einzelne Quantenpunkte, indem Sie die durchschnittliche Intensität in jedem Filmbild eines quadratischen Bereichs von drei Pixeln pro Seite berechnen, der die von der Peak-Finding-Funktion zurückgegebene Position umgibt.
      HINWEIS: Die oben beschriebene Hintergrundkorrektur entfernt die Artefakte, die durch den Tracerfarbstoff eingeführt wurden. Die resultierenden Intensitätsverläufe sollten relativ flach sein, aber dennoch natürlich auftretende Intensitätsschwankungen einbeziehen (Abbildung 4).
   3. Identifizieren Sie Ereignisse des Verschwindens von Quantenpunkten durch statistische Analyse der Intensitätsverläufe. Berechnen Sie für jede Quantenpunkt-Intensitätskurve eine Schwellenwertintensität, die je nach dem in den Trajektorien beobachteten Rauschen über dem Minimalwert liegt, und zwar um einen angemessenen Bruchteil der Differenz zwischen den Maximal- und Minimalwerten für diese Trajektorie.
      HINWEIS: Die Intensitätsfluktuation für den Quantenpunkt ist in der Regel viel größer als die Hintergrundfluktuation. Durch den Vergleich dieser Werte kann ein geeigneter Wert ermittelt werden: Der gewählte Schwellenwert muss höher sein als der höchste Hintergrundwert, idealerweise aber niedriger als der niedrigste Wert für die Quantenpunktfluoreszenz. Für die vorgelegten Daten wurde der verwendete Schwellenwert so berechnet, dass er über dem Mindestwert für jede Trajektorie zuzüglich eines Drittels der Differenz zwischen den Höchst- und Minimalwerten für diese Trajektorie liegt. Man kann davon ausgehen, dass ein Quantenpunkt zu dem Zeitpunkt verschwindet, zu dem die an seinem Standort beobachtete Intensität zuletzt über dieser Schwelle lag.
   4. Bestätigen Sie mutmaßliche Verschwindenereignisse. Ereignisse werden nur dann in die abschließende Analyse einbezogen, wenn die beobachtete Intensität über dem Mittelwert zwischen den minimalen und maximalen Intensitätswerten für die Trajektorie für mehr als die Hälfte der Filmbilder vor dem Zeitpunkt des Verschwindens liegt und die Standardabweichung der Intensitätstrajektorie nach dem Ereignis abgenommen hat.
      HINWEIS: Es können auch andere statistische Tests durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass nur gültige Verschwindenereignisse protokolliert werden.

Ergebnisse

Die Durchflusszelle ist direkt mit einem Ölimmersionsobjektiv mit 60-facher Vergrößerung mit hoher numerischer Apertur an einem inversen Mikroskop gekoppelt, das mit Laserbeleuchtung für die durchzielbare TIRF-Bildgebung ausgestattet ist (Abbildung 5A). Nach dem Einbringen des DNA-Substrats und dem Wegspülen von überschüssiger DNA und Quantenpunkten befinden sich typischerweise Tausende von einzelnen Quantenpunkten in einem Sichtfeld (Abbildung 5B). Diese Quante...

Diskussion

Das DNA-Substrat für diesen Assay wird unter Verwendung eines zweistufigen Reaktionsschemas unter Verwendung von Sulfo-SMCC mit einem Quantenpunkt markiert. Dieser bifunktionelle Vernetzer besteht aus einer NHS-Estergruppe, die mit einem primären Amin reagieren kann, und einer Maleimidgruppe, die mit einer Sulfhydrylgruppe²⁰ reagieren kann. Die thiolierten Oligonukleotide, die zur Herstellung des Substrats verwendet werden, werden in ihrer oxidierten Form versandt. Es ist wichtig, sie wie beschrie...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Aminopropyltriethoxysilan (APTS)	Sigma Aldrich	440140-100ML	In Exsikkatorbox aufbewahren
5 Minuten Epoxidharz	Devcon	20845	zur Versiegelung des mikrofluidischen Geräts
Aceton	Pharmco	329000ACS	zur Reinigung von Deckgläsern
Badsonicator	Fisher Scientific	CPXH Modell 2800	Katalognummer 15-337-410
Becherglas, Glas, 100 mL
Tischzentrifuge
Biotin-PEG-Succinimidylvalerat (MW 5.000)	Laysan Bio	BIO-SVA-5K	Succinimidylvalerat hat eine längere Halbwertszeit als Succinimidylcarbonat
biotinyliertes Oligonukleotid	Integrated DNA Technologies	kundenspezifisch - siehe Protokoll für Designüberlegungen	Anfrage 5' Biotin-Modifikation und HPLC-Aufreinigung
Rinderserumalbumin (BSA)	VWR	0903-5G	Bereiten Sie eine Lösung von 10 mg/ml (aq) vor und erhitzen Sie es auf 95 μg; C vor der Verwendung von
Centri-Spin-10 Größenausschluss Spin-Säulen	Princeton Trennungen	CS-100 oder CS-101	zur Aufreinigung von thiolierten Oligonukleotiden nach Reduzierung der Disulfidbindung
Zentrifugenröhrchen 1,5 ml
Deckgläser, 1-Zoll-Deckglashalter
		7134	Verwendung zum Bohren von Löchern in Quarz-Durchflusszellen-Topper
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	A39255	No-Weigh Format, 7,7 mg/Fläschchen
Bohrmaschine Rotationswerkzeug-Workstation-Ständer	Dremel	220-01	erleichtert Quarzbohren
EcoRV (REase zur Generierung von Beispieldaten)	New England Biolabs	R0195T oder R0195M	Verwenden Sie einen Vorrat von 100.000 Einheiten/ml, um die Zugabe von überschüssigem Glycerin zu vermeiden Überprüfen Sie REBASE für Lieferanten anderer REasen
Ethanol	verschiedene	CAS 64-17-5	vergällt oder 95% sind akzeptabel, zur Reinigung von Deckgläsern
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma Aldrich	EDS	BioUltra, wasserfrei, in Exsikkatorbox aufbewahren
Floh Micro Spinbar	Fisherbrand	14-513-65	Größe 3 mm x 10 mm, um unter das Deckglasgestell
zu passen Fluoreszein	Acros Organics	17324	zur Herstellung von experimentellen Puffern
Schwerkraftkonvektionsofen	Binder	9010-0131
Handheld-Rotationsmultitool	Dremel	8220	zum Bohren von Löchern in Quarz-Durchflusszellen-Topper
ImagEM X2 EM-CCD-Kamera	Hamamatsu	C9100-23B	Luftkühlung ist für dieses Experiment ausreichend, verwenden Sie die HCImage-Software oder ähnliches zur Steuerung
Imaging Spacer, doppelseitig, selbstklebendes
Glas, Glas mit Schraubverschluss, (ca. 50 mm Durchmesser und 50 mm hoch)
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Fisher Bioreagents	BP214-500	zur Herstellung von experimentellen Puffern mit Magnesium
MATLAB-Software		verwenden	Datenanalyse
Metallpinzette	Fisher Brand	16-100-110
Methoxy-PEG-Succinimidylvalerat (MW 5.000)	Laysan Bio	M-SVA-5K	Beide PEGs sollten den gleichen NHS-Ester haben, damit die Reaktionsgeschwindigkeit konstant ist
Mikrozentrifuge Eppendorf		5424
Mehrpositions-Magnetrührer	VWR	12621-022
N-Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure (CHES)	Acros Organics	AC20818	CAS 103-47-9, zur Herstellung von CHES
Puffer-Orbitalschüttler und Heizung für Mikrozentrifugenröhrchen	Q Instruments	1808-0506	mit Adapter 1808-1061 für 24 x 2,0 mL oder 15 x 0,5 mL Röhrchen
Parafilm
PE60 Polyethylenschlauch (Innendurchmesser 0,76 mm, Außendurchmesser 1,22 mm)	Intramedizinisches	6258917	22 G stumpfe Nadeln passen gut zu dieser Schlauchgröße
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10x	Sigma Aldrich	P7059	Verwenden Sie
Kaliumhydroxid	VWR Chemicals BDH	BDH9262	verwenden Sie eine 1 M Lösung zum Reinigen von Deckgläsern
Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Invitrogen	Q21521MP
Quarz-Objektträger, 1 Zoll quadratisch, 1 mm dick	Elektronenmikroskopie Sciences	72250-10	Löcher müssen in die Ecken gebohrt werden für das Einführen von Einlass- und Auslassschläuchen
Verstärkte Kunststoffpinzette	Rubis	K35a	Verwendung für die Handhabung von Deckgläsern und den Bau von Mikrofluidikgeräten
SecureSeal Klebefolien	Grace Biolabs	SA-S-1L	geschnitten, um Abstandshalter für mikrofluidische Geräte
zu bilden Einkanal-Spritzenpumpe für Mikrofluidik	New Era Pumpensysteme	NE-1002X-US	ausgestattet mit einer 50-ml-Spritze und einer stumpfen 22-G-Nadel
Slide-a-Lyzer MINI-Dialysegeräte, 10 kDa MWCO, 0,1 mL Thermo	Scientific	69570 oder 69572	für den Pufferaustausch während der Quantenpunktkopplung an die DNA
Natriumbicarbonat	EMD Millipore	SX0320	zur Herstellung von Puffern für die Oberflächenfunktionalisierung; 100 mM, pH 8
Natriumchlorid	Macron	7581-12	Verwendung zur Herstellung von experimentellen Puffern
Zweibasische Natriumphosphatlösung (BioUltra, 0,5 M in Wasser)	Sigma Aldrich	94046	zur Herstellung von 100 mM Natriumphosphatpuffer
Monobasische Natriumphosphatlösung (BioUltra, 5 M in Wasser)	Sigma Aldrich	74092	zur Einstellung des pH-Werts von 100 mM Natriumphosphatpuffer
Streptavidin aus Streptomyces avidinii	Sigma Aldrich	S4762	lösen Sie sich bei 1 mg/mL auf und lagern Sie 25 mL Aliqouts bei -20 ?
Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC)	Thermo Scientific	A39268	No-Weigh-Format, 2 mg/Fläschchen
Spritze mit stumpfer 21-G-Nadel
Spritzenpumpe
thioliertes Oligonukleotid	Integrated DNA Technologies	kundenspezifisch - siehe Protokoll für Designüberlegungen	Anfrage 5' Thiol-Modifikator C6 S-S und HPLC-Reinigung
TIRF-Bildgebungssystem mit 488 nm Laserbeleuchtung	verschiedene		kundenspezifische
Tris-HCl	Research Products International	T60050	zur Herstellung von experimentellen Puffern
Tris-Basis	JT Baker	4101	zur Herstellung von experimentellen Puffern
Tween-20	Sigma	P7949	zur Blockierung verwenden Puffer
Reinstwasser-Wirbelmischer
	VWR	10153-842
Wash-N-Dry Deckglasgestell	Elektronenmikroskopie Sciences	70366-16	zur Oberflächenfunktionalisierung von Deckgläsern