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Methodenartikel

Ein syngenes orthotopes Osteosarkom Sprague Dawley Rattenmodell mit Amputation zur Kontrolle der Metastasenrate

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DOI:

10.3791/62139

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3. Mai 2021

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1Department of Molecular and Comparative Pathobiology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University, 3Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 5Program for Comparative Medicine, Gene Therapy Program, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 6Tuskegee College of Veterinary Medicine, 7Department of Human Pathology, Juntendo University Faculty of Medicine, 8Department of Surgery, Juntendo University Shizuoka Hospital, Juntendo University School of Medicine, 9Department of Urology, The Johns Hopkins School of Medicine, 10Department of Gastroenterology and Minimally Invasive Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird eine syngene orthotope Implantation gefolgt von einem Amputationsverfahren des Osteosarkoms mit spontaner Lungenmetastasierung beschrieben, das zur präklinischen Untersuchung der Metastasenbiologie und entwicklung neuartiger Therapeutika eingesetzt werden kann.

Zusammenfassung

Der jüngste Fortschritt in der Behandlung des Osteosarkoms (OS) erfolgte in den 1980er Jahren, als gezeigt wurde, dass die Multi-Agent-Chemotherapie das Gesamtüberleben im Vergleich zur Operation allein verbessert. Um dieses Problem anzugehen, besteht das Ziel der Studie darin, ein weniger bekanntes Modell des Os bei Ratten mit einem umfassenden histologischen, bildgebenden, biologischen, Implantations- und Amputationschirurgieansatz zu verfeinern, der das Überleben verlängert. Wir verwendeten ein immunkompetentes, ausgezüchtetes Sprague-Dawley (SD), syngenes Rattenmodell mit implantierter UMR106 OS-Zelllinie (ausgehend von einer SD-Ratte) mit orthotopen Tibiatumorimplantaten in 3 Wochen alte männliche und weibliche Ratten, um das pädiatrische OS zu modellieren. Wir fanden heraus, dass Ratten reproduzierbare primäre und metastasierende Lungentumoren entwickeln und dass Amputationen der Gliedmaßen 3 Wochen nach der Implantation die Inzidenz von Lungenmetastasen signifikant reduzieren und unerwartete Todesfälle verhindern. Histologisch gesehen waren die primären und metastasierenden OS bei Ratten dem menschlichen OS sehr ähnlich.Unter Verwendung immunhistochemischer Methoden zeigt die Studie, dass Ratten-OS mit Makrophagen und T-Zellen infiltriert werden. Eine Proteinexpressionsuntersuchung von OS-Zellen zeigt, dass diese Tumoren Kinasen der ErbB-Familie exprimieren. Da diese Kinasen auch in den meisten menschlichen Betriebssystemen stark exprimiert werden, könnte dieses Rattenmodell verwendet werden, um ErbB-Signalweginhibitoren für die Therapie zu testen.

Einleitung

Das Osteosarkom (OS) ist der häufigste primäre Knochentumor bei Kindern, Jugendlichen und jungen Erwachsenen. Der jüngste Fortschritt in der Behandlung von OS trat in den 1980er Jahren auf, als gezeigt wurde, dass die Multi-Agent-Chemotherapie das Gesamtüberleben im Vergleich zur Operation allein verbessert1. OS entwickelt sich während des schnellen Knochenwachstums, typischerweise in langen röhrenförmigen Knochen wie Femur, Tibia und Humerus. Sie zeichnen sich durch ein osteolytisches, osteoblastisches oder gemischtes Aussehen mit bemerkenswerter periostaler Reaktionaus 2. Chemotherapie und chirurgische Resektion können das Ergebnis für Patienten mit einem 5-Jahres-Überleben für 65% der Patienten verbessern2,3. Leider haben hochgradige OS-Patienten mit metastasierender Erkrankung ein Überleben von 20%. OS dringt regional ein und metastasiert hauptsächlich in die Lunge oder andere Knochen und ist häufiger bei Männern. Das dringendste Bedürfnis für diese jungen Patienten ist eine neuartige Therapie, die die Lebensfähigkeit von Fernmetastasen verhindert und beseitigt.

OS präklinische Modelle wurdenüberprüft 4,5,6,7 und es wurden nur wenige verfügbare immunkompetente Modelle unter Amputation des orthotopen OS entwickelt. Im Jahr 2000 wurde ein wichtiges Modell unter Verwendung von BALB/c-Mäusen mit orthotopem syngenem OS und Amputation entwickelt8. Im Vergleich zu diesem Mausmodell basiert das Rattenmodell auf genetisch gezüchteten und 10-mal größeren Tieren, was zu einigen Vorteilen führt. Das Rattenmodell UMR106 wurde aus einem 32P induzierten OS in einer Sprague Dawley (SD) Ratte entwickelt, das in eine Zelllinie9abgeleitet wurde. Im Jahr 2001 wurde die orthotope Implantation von UMR106-01 erstmals in implantierten Tibien von athymischen Mäusen mit schneller, konsistenter Primärtumorentwicklung und radiologischen, histologischen Merkmalen beschrieben, die mit dem Os beim Menschen gemeinsam sind. Lungenmetastasen entwickelten sich und waren abhängig von der orthotopischen Platzierung von UMR106 in der Knochenmikroumgebung10. Im Jahr 2009 etablierten Yu et al.11 ein reproduzierbares orthotopes Femur-OS-Rattenmodell unter Verwendung von UMR106-Zellen bei größeren männlichen SD-Ratten. Die erfolgreichen Tumorimplantationen und die Lungenmetastasierungsrate bei Ratten ohne Amputation ähnelten den hier vorgestellten Daten. In dieser Studie wurde eine zusätzliche Amputation des Modells mit jungen Ratten durchgeführt, was darauf hindeutet, dass der Zeitpunkt der Primärtumorentfernung für die Modellierung des OS entscheidend ist, insbesondere im Zusammenhang mit der metastatischen Progression. Mit dieser Verfeinerung verbessern Amputation und In-vivo-Bildgebung dieses Modell für präklinische Studien zur Bewertung neuartiger Medikamente für OS.

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Protokoll

Alle Verfahren und Experimente mit Ratten wurden gemäß den vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen durchgeführt.

1. Das SD-Ratten-OS-Zelllinien-UMR-106-Zellkulturprotokoll

  1. Züchtung von Zellen in DMEM, ergänzt mit 10% (v/v) FBS, Penicillin (10 U/ml)-Streptomycin (10 U/ml) bei 37 °C in befeuchteter 5%CO2-Atmosphäre. Führen Sie Experimente mit Zellen mit Passagen von 2-812 durch.

2. Intratibiale Injektion von OS-Zellen Protokoll

HINWEIS: Zeitversetzte trächtige SD-Ratten gebären in der Tiereinrichtung und im Alter von 3 Wochen werden Würfe verwendet (da die UMR 106-Zelllinie mit SD-Ratten syngen ist, ist keine Bestrahlung erforderlich).

  1. Induktion
    1. Legen Sie die Ratte in eine mittelgroße Induktionskammer und induzieren Sie eine Anästhesie mit 2% -3% Isofluran. Überwachen Sie das Tier kontinuierlich auf die Tiefe der Anästhesie durch Reflex auf Zehendrücken, Atemfrequenz und Charakter.
    2. Führen Sie die Nase in den Nasenkegel ein. Bei Bedarf mit Klebeband sichern.
    3. Entfernen Sie die Haare am rechten Bein bis zum ventralen und dorsalen Unterbauch mit einem Haarschneider oder verwenden Sie Enthaarungsmittel. Legen Sie die Ratte in Rückenlage.
    4. Schrubben Sie den Operationsbereich aseptisch mit 70% Ethanol und verdünnen Sie Chlorhexidindiacetat oder verdünntes Betadin. Beginnen Sie um den Bereich des Knies herum und schrubben Sie in einer kreisförmigen Bewegung sowohl proximal als auch distal. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Für die Tumorimplantation wird kein Vorhang verwendet.
    5. Tragen Sie Augengleitmittel in beide Augen der Ratte auf, um eine durch Anästhesie verursachte Hornhautaustrocknung zu verhindern. Legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen mit niedriger Wärmeeinstellung. Stellen Sie sicher, dass die Ratte eine normale Körpertemperatur (37 °C) und eine normale Atemfrequenz hat.
  2. Chirurgie
    1. Schalten Sie Isofluran bei ~ 1,5% -2% ein (zur Wartung). Stellen Sie sicher, dass sich das Tier auf einer angemessenen Anästhesieebene befindet, da kein Zehen-Pinch-Reflex vorhanden ist. Wenn nicht, erhöhen Sie den Isoflurananteil auf 2,5%.
    2. Markieren Sie eine sterile Nadel (ca. 22 G) 10 mm von der Spitze entfernt, um die Tiefe des Einsetzens zu bestimmen.
    3. Führen Sie die Nadel 10 mm nach unten in die Diaphyse der Tibia ein, indem Sie in das gebeugte Knie in der Mitte des Tibiaplateaus eintreten und die Nadel durch die Metaphyse in die Diaphyse mit einer leichten bohrerartigen Bewegung ausstrecken, um eine Öffnung zu machen. Entfernen Sie die Nadel.
    4. Laden Sie die Zellsuspension direkt vor der Injektion in die Tibia in die Hamilton-Spritze. Mischen Sie dazu die Zellen vorsichtig, bevor Sie sie in die Spritze ziehen, da sich die Zellen durch die Schwerkraft im Boden des Röhrchens niederlassen.
      HINWEIS: Die Zellen können in einem 1,5 bis 2 ml Röhrchen (bei Raumtemperatur) gelagert werden, bevor sie nach sorgfältigem Mischen in die Hamilton-Spritze (100 μL) eingezogen werden. Die Zellen können während des Implantationsverfahrens für 2-3 h bei Raumtemperatur gehalten werden. Überprüfen Sie immer die Zelllebensfähigkeit der Zellen in der Röhre vor und nach der Implantationssitzung. Der Trypanblau-Ausschluss ist die einfachste Methode zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit.
    5. Sobald der Knochen mit der ersten Nadel durchquert ist, führen Sie eine zweite Nadel (Nadel mit kleinerem Durchmesser, die ebenfalls bei 10 mm markiert ist) ein, die an der mit Zellen beladenen 100 μL Hamilton-Spritze befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass Sie die Nadel bis zur 10-mm-Markierung in das gleiche Loch einführen, das in die Diaphyse reicht.
    6. Geben Sie 20 μL von 75.000 OS-Zellsuspensionen in PBS vorsichtig in die Diaphyse und die Markhöhle ab.
      HINWEIS: Die Nadel sollte nicht im Knochen wackeln und sich sicher anfühlen. Wenn sich die Nadel leicht bewegt, kann der Kortex an der Diaphyse durchquert worden sein. Wiederholen Sie die Einführung erneut, um vor der Injektion von Zellen eine festere Platzierung zu erhalten.
    7. Entfernen Sie die Hamilton-Nadel vom Knochen.
      HINWEIS: Wenn sich ein kleiner Blutstropfen bildet, üben Sie leichten Druck aus. Wenn sich an der Punktionsstelle ein klarer Flüssigkeitstropfen bildet, wurde die Nadel möglicherweise nicht weit genug im Knochen ausgefahren und die Tumorzellsuspension ist möglicherweise durch das Loch zurückgesickert. Notieren Sie dies in den Notizen, aber im Allgemeinen wird die Tumorimplantation erfolgreich sein. Mit Erfahrung sollte das Tumorimplantationsverfahren 5 Minuten pro Ratte dauern. Mit der Erfahrung wird die Tumorimplantation von Zellen in den Knochen einfacher. Die versehentliche Injektion von Zellen in den Muskel um den Knochen herum führt möglicherweise nicht zu der Tumormikroumgebung, die für die Lungenmetastasierung erforderlich ist.
  3. Genesung
    1. Stellen Sie sicher, dass die Ratte normotherm ist. Legen Sie die Ratte in einen Käfig mit einem Heizkissen, das zur Genesung unter dem Käfig platziert ist.
    2. Nachdem sie vollständig wach, beweglich und gut atmen, injizieren Sie den Ratten Buprenorphin (1,0-1,2 mg/kg SC).
      HINWEIS: Um Zugang zu Buprenorphin zu erhalten, erkundigen Sie sich bei der Institution, um Optionen für die Genehmigung durch das Veterinärpersonal zu sehen, um die Bestellung aufzugeben.
    3. Bringen Sie die Ratten zurück in saubere Käfige und überwachen Sie sie einmal täglich, jede Woche.

3. Messung und Überwachung

  1. Messen Sie die Tumorgröße 9-10 Tage nach der Implantation und dann alle 2 Tage bis 3 Wochen nach der Implantation, um eine Wachstumsrate zu ermitteln. Messen Sie den maximalen Durchmesser des Schienbeins mit einem elektronischen oder manuellen Bremssattel. Speichern Sie die Daten in einer Tabelle mit einer Formel zur Berechnung des Tumorvolumens. Messen Sie die kontralaterale (nicht implantierte Tibia) als Basislinie.
    HINWEIS: Die implantierten Hinterbeindurchmesser werden als Surrogat für die Tumorgröße verwendet. Die Hintergliedmaßen werden senkrecht zur Tibia-Längsachse am größten Durchmesser für zwei Messungen gemessen, ventral/dorsal und media/lateral an der Extremität. Das geschätzte Tumorvolumen wird nach der Formel11berechnet: Tumorvolumen (mm3)= größter Durchmesser (mm) x kleinster Durchmesser (mm)2/2.
  2. Betrachten Sie die Ratten für die Überlebensamputation oder Chemotherapie-Behandlung, wenn sich Tumore 15 mm in der größten Dimension oder 3 Wochen nach der Tumorimplantation nähern. Die kontralaterale Extremität misst bei den meisten Ratten in diesem Alter etwa 7-9 mm.

4. Intravenöse Verabreichung von Doxorubicin

  1. Betäuben Sie die Ratten mit 2% Isofluran. Bereiten Sie die Haut über die Halsvene mit drei chirurgischen Waschungen unter Verwendung von Betadin und Alkohol wie beschriebenvor 13.
  2. Visualisieren Sie unter sorgfältiger Dissektion die rechte oder linke Jugularvene. Führen Sie die Nadel in den darüber liegenden Muskel ein und richten Sie sie dann in Richtung des Kopfes der Ratte in das Lumen der Jugularvene, wie es in der Jugularvene vor dem Musculus pectoralis sichtbar ist.
    1. Wenn die Nadel in die Halsvene eingeführt wird, ziehen Sie vorsichtig Blut in die Spritze, um eine ordnungsgemäße Einführung zu gewährleisten. Es ist möglich zu glauben, dass die Nadel durch die Vene ist, aber die Nadel ist unter der Vene und nicht im Lumen. Wenn die Jugularvene beim stumpfen Sezieren zu klein für Injektionen wird, um die Jugularvene freizulegen, verwenden Sie die andere Jugularvene für die Injektion.
  3. Doxorubicin (2 mg/kg) langsam über 1 min in einem Volumen von 100-150 μL injizieren. Die Lösung kann intravenös in der Vena jugularis während der Entbindung visualisiert werden.
  4. Injizieren Sie ähnliche Mengen normaler Kochsalzlösung in Kontrollratten.
  5. Entfernen Sie die Nadel und üben Sie mit einer sterilen Gaze sanften Druck auf die Vene aus.
  6. Schließen Sie den Hautschnitt mit 3-4 Wundclips. Entfernen Sie die Clips 7-10 Tage nach der Injektion.
    HINWEIS: Ratten versuchen normalerweise nicht, Metallclips zu entfernen, sondern beißen und entfernen Nähte. Die juguläre Injektionsmethode ist den Schwanzveneninjektionen für Doxorubicin vorzuziehen, da jedes Medikament, das außerhalb des Gefäßes austritt, eine Nekrose des Schwanzes verursacht, die eine Schwanzamputation erfordern kann.

5. Protokoll zur Amputation der Hintergliedmaße

  1. Induktion
    1. Legen Sie die Ratte in eine mittelgroße Induktionskammer und induzieren Sie eine Anästhesie mit 2% -4% Isofluran. Überwachen Sie die Ratte kontinuierlich auf die Tiefe der Anästhesie.
      HINWEIS: Die Induktionskammer wird zu einem Holzkohlekanister gespült und alle anderen Gase werden durch einen Down-Draft-Tisch entfernt, der für die Operation verwendet wird.
    2. Führen Sie die Nase in einen Nasenkegel ein. Bei Bedarf mit Klebeband sichern.
      HINWEIS: Dieses Verfahren wird auf einer Down-Draft-Tabelle durchgeführt, um überschüssige flüchtige Gase (z. B. Isofluran) abzufangen.
    3. Entfernen Sie die Haare am rechten Bein bis zum ventralen und dorsalen Unterbauch mit einem Haarschneider oder verwenden Sie Enthaarungsmittel. Legen Sie die Ratte in Rückenlage.
    4. Schrubben Sie den Operationsbereich aseptisch mit 70% Ethanol und verdünnen Sie Chlorhexidindiacetat oder verdünntes Betadin. Bereiten Sie die Haut auf die Operation von der Mitte der Wade bis zum Hautbereich direkt über dem Hüftgelenk des rechten Unterbauchs vor. Schrubben Sie das Bein proximal und den distalen Bereich umlaufend. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
    5. Tragen Sie das Augengleitmittel in beide Augen der Ratte auf. Stellen Sie sicher, dass die Ratte eine normale Körpertemperatur (37 °C) und normale Vitalfunktionen aufweist. Überwachen und regulieren Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen, das an einen rektalen Temperaturfühler-Monitor angeschlossen ist.
  2. Chirurgie
    1. Schalten Sie Isofluran bei 1,5% -3% ein (Wartung). Überwachen Sie die Anästhesietiefe, einschließlich der Reaktion auf Zehendrücken, Atemfrequenz und Charakter. Passen Sie die Isofluranrate nach Bedarf an, um eine geeignete Anästhesieebene aufrechtzuerhalten.
      HINWEIS: Die Atemfrequenz während der Narkose sollte zwischen 50-100 Atemzügen pro Minute liegen. Tiefe, seltene Atemzüge sind ein Hinweis darauf, dass die Ratte zu tief betäubt ist.
    2. Öffnen Sie sterile Instrumentenpackungen und Vorhänge und ziehen Sie sterile Handschuhe an. Achten Sie darauf, die Sterilität während der gesamten Dauer des Eingriffs aufrechtzuerhalten. Zu den grundlegenden sterilen chirurgischen Instrumenten, die benötigt werden, gehören Skalpellklingenhalter, Pinzetten, Hämostatika, Nadelhalter, Schere und Wundclip-Applier.
    3. Ziehen Sie das Bein der Ratte durch die Entlüftung des sterilen chirurgischen Vorhangs. Stellen Sie sicher, dass sich das Tier über einen Zehen-Pinch-Reflex auf einer ausreichenden Anästhesieebene befindet.
    4. Machen Sie mit einer Skalpellklinge oder einer chirurgischen Schere einen umschneidenden, hautnahen Schnitt nur in der Nähe des Erstickens (Kniegelenk).
    5. Deglove der Hintergliedmaße mit Gaze oder stumpfer Dissektion, um die Oberschenkelarterie und -vene auf der ventral-medialen Oberfläche der Hintergliedmaße freizulegen.
    6. Ligatieren Sie die Gefäße mit 4-0 resorbierbaren Nähten auf Höhe des mittleren Femurs und transektieren Sie distal.
    7. Klemmen Sie die Vene distal, um leckage während der Muskeldissektion zu reduzieren.
      HINWEIS: Die umlaufende Muskulatur wird distal auf die Ebene der Ligatur des Femurarteriengefäßes und der Muskeln vom Femur auf das Niveau des Coxofemoralgelenks durchtrennt.
    8. Mit stumpfer Dissektion das Hüftgelenk mit seitlicher Rotation nach außen abführen.
    9. Finden Sie den Kopf des Femurs und disartikulieren Sie ihn aus dem Acetabulum. Schneiden Sie das verbleibende Gewebe ab und halten Sie das Bein am Körper befestigt.
    10. Geben Sie dem Acetabulum und dem Ischiasnerv einen Spritzblock mit etwa 6 mg/kg Ropivacain.
    11. Schließen Sie die Muskulatur über dem Acetabulum mit einer einfachen unterbrochenen Naht (4-0, resorbierbare Naht).
      HINWEIS: Zusätzliche 0,5% Bupivacain oder Lidocain (insgesamt 0,15-0,2 mg) können an mehreren Stellen entlang der geschlossenen Muskelschicht injiziert werden (lokale Infiltration/Spritzblock).
    12. Gegenlehnen und schließen Sie die Hautränder mit Wundklammern, die alle 5-10 mm auseinander gelegt werden.
  3. Genesung
    1. Legen Sie die Ratte in einen sauberen Rückgewinnungskäfig mit Wärmeunterstützung mit einem Heizkissen, das unter dem Käfig platziert ist.
      HINWEIS: Um eine Hyperthermie zu verhindern, sollte das Heizkissen nicht in direktem Kontakt mit dem Tier stehen und 40 °C nicht überschreiten.
    2. Überwachen Sie das Tier, bis es sich vollständig erholt hat und normotherm ist (37,5-39 °C).
      HINWEIS: Das Tier sollte nicht unbeaufsichtigt bleiben, bis es bei vollem Bewusstsein und streng liegend ist und sich leicht im Käfig bewegt.
    3. Nachdem sie vollständig wach, beweglich und gut atmen, injizieren Sie den Ratten Buprenorphin (1,0-1,2 mg/kg SC).
      HINWEIS: Die Gabe von Buprenorphin bei einer betäubten Ratte kann die Genesung beeinträchtigen.
    4. 10 ml warme laktierte Ringer-Lösung subkutan zwischen den Schulterblättern verabreichen.
    5. Bringen Sie die Ratten zurück in den sauberen Käfig und vereinen Sie sich wieder mit Artgenossen.
    6. Überwachen Sie alle Tiere zweimal täglich für den nächsten Monat auf Anzeichen von Schmerzen und Leiden, einschließlich Piloerection, gebeugte Haltung oder Inappetenz oder Anzeichen einer Infektion der Inzisionsstelle, einschließlich Erythem, eitriger Ausfluss oder Wunddehiszenz.
      HINWEIS: Bis heute haben wir bei keinem der Tiere klinische Symptome (z. B. Infektionen) nach postoperativer Genesung beobachtet. Nur eine Ratte hatte eine Dehiszenz mit Nähten, wonach Wundklemmen verwendet wurden, um Wunden ohne weitere Probleme zu schließen.
    7. Verabreichen Sie Buprenorphin oder Meloxicam bei Tieren mit klinischen Anzeichen von Schmerzen in veröffentlichten Dosen in Absprache mit einem Labortierarzt.
    8. Verabreichung von Antibiotika (z. B. Cephalosporin) an Tiere, die in veröffentlichten Dosen klinische Anzeichen von Schmerzen aufweisen, in Absprache mit einem Labortierarzt.
      HINWEIS: Alle Tiere, die langwierige Anzeichen von Schmerzen oder Leiden aufweisen, die sich mit Analgetika nicht bessern, oder Tiere, die Anzeichen einer Infektion aufweisen, die nicht auf Antibiotika ansprechen, müssen human eingeschläfert werden.

6. Bildgebung mit Röntgen

  1. Bilden Sie nach der Tumorimplantation die Tibien und die Lunge nicht-invasiv ab, um das Tumorwachstum mithilfe von Röntgenaufnahmen mit einer für Nagetiere entwickelten Maschine zu erkennen.
  2. Betäuben Sie die Ratten wie zuvor.
  3. Nehmen Sie Bilder mit 3-facher Vergrößerung für 6 s bei 25 kV auf.
  4. Verarbeiten Sie den Film mit dem Röntgenprozessor. Röntgenbilder können auch digital gescannt werden.

7. Nekropsie-Verfahren

  1. Die Ratten mit CO2 einschläfern. Bestätigen Sie den Tod durch Herzschlagmangel und entnehmen Sie sofort 3 ml Blut aus dem Herzen für Serum- oder Plasmaproben.
  2. Öffnen Sie den Thorax und den Bauch zur Untersuchung.
  3. Isolieren Sie die Luftröhre und kanülieren Sie sie mit einem (18 G) Katheter. Um den Katheter in der Luftröhre zu sichern, binden Sie mit dem Katheter eine Seidennaht um die Luftröhre.
  4. Schließen Sie den Infusionskatheter an eine 3- oder 5-ml-Spritze an. Infusion von Formalin oder Kochsalzlösung, um die Lungenlappen sanft aufzublasen, um bessere Histologieproben zu erhalten. Bei der Infusion bläht sich die Lunge auf und ermöglicht eine bessere Visualisierung von Lungenmetastasen.
  5. Untersuchen, sezieren und wiegen Sie alle ausgewählten Thorax- und Bauchorgane (wie Leber, Nieren).
  6. Fixieren Sie die Organe in Formalin für die Histopathologie oder frieren Sie auf Trockeneis, 2-Methylbutan oder flüssigem Stickstoff ein.
  7. Zur Beurteilung der Proteinexpression mit Western Blot stellen Sie Lysate aus gefrorenem Gewebe her. Antikörper, die mit Rattengewebe reagieren, werden detailliertbeschrieben 13.

8. Immunhistochemie

  1. Verarbeiten Sie das primäre OS-Gewebe, betten Sie es in Paraffin ein und schneiden Sie es für die immunhistochemische Färbung.
  2. Rufen Sie das Antigen nach der Deparaffinisierung mit Citratpuffer (pH 6,0) ab. Inkubieren Sie in 0,3%H2O2in Methanol für 30 min, um endogene Peroxidase zu quenken.
  3. Blockieren Sie die 5 μm dicken Paraffinschnitte mit normalem Serum.
  4. Inkubieren Sie mit primären Anti-CD68- und CD3-Antikörpern (siehe Tabelle) über Nacht bei 4 °C.
  5. Spülen Sie die Abschnitte in PBS und inkubieren Sie sie in HRP-Polymer mit einem Detektionskit.
    HINWEIS: Immunostaining wurde mit Diaminobenzidin als Chromogen entwickelt.

9. Western Blotting

  1. Lyse der UMR-106-Zellen in 200-300 μL Lysepuffer14, um Standard-Gelelektrophorese und Western Blotting durchzuführen.
  2. Verwenden Sie 4% bis 12% Bis-Tris Gele.
  3. Inkubieren sie in Anti-ErbB2-, Anti-ErbB4-, Anti-EGFR-, Anti-ERK-, β-Aktin- oder Anti-Maus-β2-AR-Primärantikörpern (siehe Tabelle) und Meerrettichperoxidase-verknüpften sekundären Antikörpern.
  4. Fügen Sie das chemilumineszierende Substrat hinzu. Setzen Sie die Membranen einem Röntgenfilm aus.
    HINWEIS: β-Aktin-Gehalte werden als Belastungskontrollen verwendet.

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Ergebnisse

Für diese OS-Studien werden immunkompetente SD-Outzüchtungsratten verwendet, die ein Tiermodell mit einem intakten Immunsystem bieten. Wir haben die UMR106-Zelllinie von ATCC verwendet, die aus Zellen entwickelt wurde, die ursprünglich aus einem OS einer SD-Ratte isoliert wurden. Wir implantierten die Zellen in SD-Ratten und lieferten so ein syngenes Modell für OS. UMR106-Zellen werden in die Tibia von 3 Wochen alten männlichen und weiblichen SD-Ratten implantiert und simulieren ein pädiatrisches OS-Modell. Darüber hinau...

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Diskussion

Ratten mit OS-Tibiaimplantaten entwickeln messbare Tumore bis 3 Wochen nach der Implantation. Wenn Gliedmaßen mit Tumoren 3 Wochen nach der Implantation amputiert werden, ist die Inzidenz von Lungenmetastasen signifikant reduziert. Betriebssysteme sind sowohl osteolytisch als auch osteoblastisch. Ratten ohne Amputation entwickeln Lungenmetastasen, die multiple und variabel groß sind, beobachtet durch Radiographie oder bei Nekropsie bis 7 Wochen nach der Implantation. EGFR, ErbB2 und ErbB4 werden in Ratten UMR106 OS expri...

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Offenlegungen

Keine Offenlegung zu deklarieren.

Danksagungen

NIH-Finanzierung durch das National Cancer Institute, Zuschuss # CA228582. Shun Ishiyama erhält derzeit einen Zuschuss von Toray Medical Co., Ltd.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AKTCell Signaling TECHNOLOGY4685S resorbierbares
NahtmaterialEthiconJ214H
β-AktinSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-47778
β 2-AR AntikörperSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-569ersetzt durch β 2-AR (E-3): sc-271322
Bis– Tris-GeleThermo FisherNP0321PK2
Buprenorphin SR LabZooPharmIZ-70000-201908
CD3-AntikörperDako#A0452
CD68-AntikörpereBioscience#14-0688-82
Chemilumineszenz-SubstratCytivaRPN2232
CL-Xposure-FilmThermo Fisher34089
Komplettes AnästhesiesystemEVETEQUIP922120
DiaminobenzidinVECTOR LABORATORIESSK-4100
DoxorubicinActavisNDC 45963-733-60
EGFR AntikörperSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-03ersetzt durch EGFR (A-10): sc-373746
ERBB2 AntikörperSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-284ersetzt durch Neu (3B5): sc-33684
ERBB4 AntikörperSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-283ersetzt durch ErbB4 (C-7): sc-8050
ERK AntikörperSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-514302
AugengleitmittelPHARMADERMNDC 0462-0211-38
Hamilton Spritze (100 µ L)HamiltonModell 1710 SN SYR
Meerrettichperoxidase-gebundener SekundärantikörpercytivaNA934
HRP Polymer-NachweiskitVECTOR LABORATORIESMP-7401
HRP Polymer-NachweiskitVECTOR LABORATORIESMP-7402
IsofluranBUTLER SCHEINNDC 11695-6776-2
Isofluran VaporizerEVETEQUIP911103
UMR-106 ZelleATCCCRL-1661
RöntgenFaxitronUltraFocus
RöntgenprozessorHope X-Ray Peoducts IncMicroMax RöntgenprozessorHope Prozessoren sind in USA nicht mehr erhältlich
gewickelte ClipsBECTON DICKINSON427631

Referenzen

  1. Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
  2. Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
  3. Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B. Recent advances in osteosarcoma. Current Opinion in Pharmacology. 16, 15-23 (2014).
  4. Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
  5. Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P. Animal models in osteosarcoma. Frontiers Oncology. 4, 189(2014).
  6. Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
  7. Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271(2012).
  8. Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
  9. Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
  10. Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
  11. Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
  12. Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
  13. Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
  14. Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
  15. Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
  16. Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
  17. Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
  18. Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
  19. Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).

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Ein syngenes orthotopes Osteosarkom Sprague Dawley Rattenmodell mit Amputation zur Kontrolle der Metastasenrate
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