Durchflusszytometrie und konfokale bildgebende Analyse niedriger Wnt-Expression in Axin2-mTurquoise2-Reporter-Thymozyten

Jolanda J. D. de Roo; Brigitta A.E. Naber; Sandra A. Vloemans; Edwin F.E. de Haas; Annelies M.A. van der Laan; Frank J.T Staal

doi:10.3791/62141

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Methodenartikel

Durchflusszytometrie und konfokale bildgebende Analyse niedriger Wnt-Expression in Axin2-mTurquoise2-Reporter-Thymozyten

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DOI:

10.3791/62141

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24. September 2021

Jolanda J. D. de Roo¹ , Brigitta A.E. Naber¹ , Sandra A. Vloemans¹ , Edwin F.E. de Haas¹ , Annelies M.A. van der Laan² , Frank J.T Staal¹

¹Department of Immunology, Leiden University Medical Center, ²Department of Cell and Chemical Biology, Leiden University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es ist bekannt, dass die Signalträger das Zellschicksal regulieren, was darauf hindeutet, dass die Regulation des Wnt-Signalwegs ein interessantes therapeutisches Ziel darstellt. In dieser Arbeit beschreiben wir Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie-Analysemethoden für ein robustes murines kanonisches Wnt-Signalreportermodell, das unterschiedliche Wnt-Signalgebungsniveaus misst.

Zusammenfassung

Die Messung der Wnt-Expressionsniveaus ist unerlässlich, wenn es darum geht, neue therapeutische Ziele für Wnt zu identifizieren oder zu testen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die kanonische Wnt-Signalgebung über einen dosisgesteuerten Mechanismus funktioniert, was die Notwendigkeit motiviert, die Wnt-Signalgebung in verschiedenen Zelltypen zu untersuchen und zu messen. Obwohl mehrere Reportermodelle vorgeschlagen wurden, um die physiologische Wnt-Expression darzustellen, beeinflusste entweder der genetische Kontext oder das Reporterprotein die Validität, Genauigkeit und Flexibilität dieser Werkzeuge stark. In dieser Arbeit werden Methoden zur Erfassung und Analyse von Daten beschrieben, die mit dem Axin2-mTurquoise2-Maus-Wnt-Reportermodell erhalten wurden, das ein mutiertes Axin2^{em1Fstl-Allel} enthält. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung des endogenen kanonischen Wnt-Signalwegs in einzelnen Zellen über einen weiten Bereich der Wnt-Aktivität.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Aktivität von Axin2-mTurquoise2-Reportern mithilfe der Zellpopulationsanalyse des hämatopoetischen Systems in Kombination mit Zelloberflächenmarkern oder intrazellulärer β-Catenin-Färbung vollständig erfasst werden kann. Diese Verfahren dienen als Grundlage für die Implementierung und Reproduktion in anderen Geweben oder Zellen von Interesse. Durch die Kombination von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung und konfokaler Bildgebung können unterschiedliche kanonische Wnt-Expressionsniveaus sichtbar gemacht werden. Die empfohlenen Mess- und Analysestrategien liefern quantitative Daten über die Fluoreszenzexpressionsniveaus für eine präzise Beurteilung des kanonischen Wnt-Signalwegs. Diese Methoden sind nützlich für Forscher, die das Axin2-mTurquise2-Modell für kanonische Wnt-Expressionsmuster verwenden möchten.

Einleitung

Der kanonische Wnt-Signalweg ist ein konservierter Signalweg, der sowohl an der Homöostase von gesundem Gewebe als auch an Krankheiten beteiligt ist. Es hat sich gezeigt, dass eine präzise Regulation des Wnt-Signalwegs für die Embryonalentwicklung wichtig ist, aber auch in adulten Geweben von großer Bedeutung ist. Es wurde festgestellt, dass der kanonische Wnt-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Geweberegeneration verschiedener Organe wie dem Darm, der Haut und dem hämatopoetischen System spielt. Wenn die Wnt-Signalübertragung dereguliert wird, treten daher schwere Pathologien auf. Darm-, Leber- und Hautkrebs, neurologische Erkranku....