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Methodenartikel

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

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DOI:

10.3791/62145

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26. Februar 2021

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1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 4Max Delbrück Center for Molecular Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Transinfektion primärer Iris- und retinaler Pigmentepithelzellen aus verschiedenen Säugetieren (Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine und Rinder) vorgestellt. Die Methode eignet sich ideal, um okuläre Gentherapieansätze in verschiedenen Setups für Ex-vivo-Analysen und auf den Menschen übertragbare In-vivo-Studien zu untersuchen.

Zusammenfassung

Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Patienten >60 Jahren und betrifft weltweit ~ 30 Millionen Menschen. AMD ist eine multifaktorielle Erkrankung, die von Umwelt- und genetischen Faktoren beeinflusst wird, die aufgrund einer degeneration retinaler Pigmentepithelzellen (RPE) mit anschließendem Abbau des Photorezeptors zu einer funktionellen Beeinträchtigung der Netzhaut führen. Eine ideale Behandlung wäre die Transplantation gesunder RPE-Zellen, die neuroprotektive Faktoren sezernieren, um den RPE-Zelltod und die Degeneration des Photorezeptors zu verhindern. Aufgrund der funktionellen und genetischen Ähnlichkeiten und der Möglichkeit einer weniger invasiven Biopsie wurde die Transplantation von Irispigmentepithelzellen (IPE) als Ersatz für die degenerierte RPE vorgeschlagen. Die Sekretion neuroprotektiver Faktoren durch eine geringe Anzahl subretinal transplantierter Zellen kann durch transpononvermittelte Transfektion von Dornröschen (SB100X) mit Genen erreicht werden, die für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) und/oder den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kodieren. Wir etablierten die Isolierung, Kultur und SB100X-vermittelteTransfektion von RPE- und IPE-Zellen verschiedener Spezies, darunter Nagetiere, Schweine und Rinder. Globen werden explantiert und die Hornhaut und linse werden entfernt, um Zugang zur Iris und zur Netzhaut zu erhalten. Mit einem speziell angefertigten Spatel werden IPE-Zellen aus der isolierten Iris entfernt. Um RPE-Zellen zu ernten, kann je nach Art eine Trypsin-Inkubation erforderlich sein. Dann werden die Zellen mit RPE-angepasstem Spatel im Medium suspendiert. Nach der Aussaat werden die Zellen zweimal pro Woche überwacht und nach Erreichen des Zusammenflusses durch Elektroporation transfiziert. Genintegration, Expression, Proteinsekretion und -funktion wurden durch qPCR, WB, ELISA, Immunfluoreszenz und funktionelle Assays bestätigt. Je nach Art können pro Auge 30.000-5 Millionen (RPE) und 10.000-1,5 Millionen (IPE) Zellen isoliert werden. Genetisch veränderte Zellen zeigen eine signifikante PEDF/GM-CSF-Überexpression mit der Fähigkeit, oxidativen Stress zu reduzieren, und bieten ein flexibles System für Ex-vivo-Analysen und In-vivo-Studien, die auf den Menschen übertragbar sind, um okuläre Gentherapieansätze zu entwickeln.

Einleitung

Unsere Gruppe konzentriert sich auf die Entwicklung regenerativer Ansätze zur Behandlung der neuroretinalen Degeneration, d.h. AMD, durch RPE- und IPE-basierte nicht-virale Gentherapie. Die präklinische Etablierung solcher Therapien erfordert auf den Menschen übertragbare In-vitro-Modelle. Ziel der hier vorgestellten Studie ist es daher, Protokolle für die Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären RPE- und IPE-Zellen bereitzustellen. Die Begründung für die Isolierung von PE-Zellen aus mehreren Spezies besteht darin, die Sicherheit und Effizienz des Ansatzes robust zu bestätigen und seine Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit zu erhöhen. Die verfügbare humane RPE-Zelllinie ARPE-19 unterscheidet sich von Primärzellen (z.B. sind sie weniger pigmentiert) und ist daher für präklinische Analysen nur von begrenztem Wert1. Darüber hinaus können nicht-menschliche Säugetierzellen für weniger Kosten und in größeren Mengen gekauft werden; menschliches Spendergewebe kann aus verschiedenen Augenbanken bezogen werden, aber die Verfügbarkeit ist begrenzt und teuer. Schließlich müssen neue Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMP, d. h. Zell-, Gewebe- oder Gentherapeutikum) in mindestens zwei verschiedenen Spezies angewendet werden, bevor sie an Patienten getestet werden, und diese In-vivo-Studien erfordern die Vorbereitung allogener Zelltransplantate.

Retinale neurodegenerative Erkrankungen sind die Hauptursache für Blindheit in Industrieländern und umfassen häufige Erkrankungen wie AMD sowie seltene Krankheiten wie Retinitis pigmentosa, bei denen der retinale Zelltod schließlich zur Erblindung führt. RPE-Zellen, Photorezeptoren und retinale Ganglienzellen (RGC) können in einigen Fällen verlangsamt werden, aber es gibt derzeit keine kurativen Therapien. ATMPs bieten das Potenzial, Gendefekte zu korrigieren, therapeutische Gene zu integrieren oder degenerierte Zellen zu ersetzen, wodurch die Entwicklung regenerativer und kurativer Therapien für Krankheiten wie AMD ermöglicht wird; 13 Gentherapien haben bereits die Marktzulassung erhalten, darunter eine Therapie zur Behandlung der RPE65-Mutation-assoziierten Netzhautdegeneration2,3. Unter den älteren Erwachsenen (>60 Jahre) sind weltweit ~ 30 Millionen Menschen entweder von neovaskulärer (nvAMD) oder avaskulärer (aAMD) AMD4betroffen. Beide Formen werden durch altersbedingte Auslöser induziert, darunter oxidative Schäden, Funktionsstörungen und Verlust von RPE-Zellen, gefolgt von einem Photorezeptorabbau, unter anderem (z. B. genetische Risikoallele, Rauchen, Bluthochdruck)5,6. Bei nvAMD wird die Pathogenese durch ein Ungleichgewicht von angiogenen und anti-angiogenen Faktoren zugunsten des angiogenen Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) verschlimmert, der die choroidale Neovaskularisation (CNV) induziert. Bisher ist nur nvAMD durch monatliche intravitreale Injektionen von Inhibitoren des VEGF-Proteins behandelbar, um das CNV zu unterdrücken; für aAMD6,7ist noch keine wirksame Behandlung verfügbar.

Mehrere Studien evaluierten zellbasierte Therapien, um die Anti-VEGF-Therapie zu ersetzen: Studien von Binder et al., in denen frisch geerntete autologe RPE-Zellen in Patienten mit nAMD 8,9,10transplantiert wurden, zeigten eine moderate visuelle Verbesserung, aber nur eine kleine Gruppe von Patienten erreichte eine endgültige Sehschärfe, die hoch genug war, um das Lesen zu ermöglichen. Kürzlich verwendete eine klinische Phase-I-Studie ein aus embryonalen Stammzellen gewonnenes RPE-Pflaster zur Behandlung von AMD mit vielversprechenden Ergebnissen; d. h. Wirksamkeit, Stabilität und Sicherheit des RPE-Pflasters für bis zu 12 Monate bei 2 der 10 behandelten Patienten11. Darüber hinaus haben mehrere Gruppen Studien veröffentlicht, in denen autologe RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Flecken aus der peripheren Netzhaut entnommen und in die Makula transplantiert wurden12,13,14; und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete RPE-Pflaster wurden für die Transplantation erzeugt15. Für aAMD wurden Antikörper, die auf den Komplementweg abzielen, in den klinischen Studien6,16 getestet und eine Phase-I-Studie unter Verwendung einer einzigen intravitrealen Injektion eines adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektors, der das Gen für den Faktor CD59 (AAVCAGsCD59) bei Patienten mit geografischer Atrophie (GA) kodiert, wurde abgeschlossen17; Die Kürzlich gestartete Phase-II-Studie zielt darauf ab, 132 Patienten mit fortgeschrittener aAMD zu rekrutieren und das Ergebnis 2 Jahre nach der Intervention zu bewerten18. Schließlich hat die FocuS-Studiengruppe eine multizentrische klinische Phase-I/II-Studie gestartet, in der die Sicherheit, das Dosis-Wirkungs-Verhältnis und die Wirksamkeit eines rekombinanten, nicht replizierenden AAV-Vektors untersucht wurden, der für einen menschlichen Komplementfaktor19kodiert.

Das Ziel einer regenerativen AMD-Therapie ist in erster Linie die Transplantation von funktionellen RPE-Zellen, die beschädigt wurden oder verloren gegangen sind. IPE- und RPE-Zellen teilen jedoch viele funktionelle und genetische Ähnlichkeiten (z. B. Phagozytose und Retinolstoffwechsel), und da IPE-Zellen besser geerntet werden können, wurden sie als RPE-Ersatz vorgeschlagen20. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass die IPE-Zelltransplantation die Photorezeptordegeneration in den Tiermodellen21,22 verzögert und die Sehfunktion bei Patienten mit nvAMD im Endstadium stabilisiert, wurde bei diesen Patienten keine signifikante Verbesserung beobachtet23. Der Mangel an Wirksamkeit kann auf die geringe Anzahl transplantierter Zellen und / oder das Ungleichgewicht neuroprotektiver Netzhautfaktoren zurückzuführen sein. Ein alternativer Ansatz wäre die Transplantation von transfizierten Pigmentepithelzellen, die neuroprotektive Faktoren überexprimieren, um die retinale Homöostase wiederherzustellen, verbleibende RPE-Zellen aufrechtzuerhalten und Photorezeptoren und RGCs vor Degeneration zu schützen. Daher schlagen wir eine neue Therapie vor, die die Transplantation von funktionellen RPE- oder IPE-Zellen umfasst, die gentechnikalisiert wurden, um neuroprotektive und antiangiogene Proteine wie PEDF, GM-CSF oder insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) abzusondern. Der Vorteil der Entwicklung und Analyse dieses Ansatzes in mehreren Spezies anstelle einer Zelllinie, nur einer Spezies oder menschlichem Gewebe ist: 1) erhöhte Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit der Ergebnisse, wie zahlreiche Studien in unabhängigen Labors und verschiedenen Spezies zeigen1,24,25; 2) Schweine- oder Rinderzellen sind ohne die Opfer zusätzlicher Tiere möglicherweise wegwerfbar; 3) Die Verfügbarkeit insbesondere von Schweine- und Rinderzellen ermöglicht große Versuchsreihen, um robuste Ergebnisse zu erzielen; 4) das Wissen, Zellen aus den am häufigsten verwendeten Modellen zu isolieren, zu kultivieren und genetisch zu verändern, ermöglicht In-vivo-Analysen bei mehreren Spezies24,25,26 und bietet somit ein verbessertes Nutzen-Risiko-Verhältnis für die ersten behandelten Patienten; 5) Die Flexibilität des vorgestellten Protokolls ermöglicht den Einsatz in verschiedenen Modellen und Versuchsanordnungen sowie für alle augenzellbasierten Therapien mit und ohne Gentechnik. Im Gegensatz dazu sind alternative Techniken wie Zelllinien oder menschliches Gewebe nur von begrenzter Übertragbarkeit und/oder begrenzter Verfügbarkeit. Zelllinien wie die ARPE-19 sind ideal für Vorversuche; Niedrige Pigmentierung und hohe Proliferation unterscheiden sich jedoch signifikant von Primärzellen1. RPE- und IPE-Zellen, die aus menschlichem Spendergewebe isoliert werden, bieten eine wertvolle Quelle für übertragbare In-vitro-Experimente; Wir beziehen jedoch menschliches Gewebe aus einer US-amerikanischen Augenbank, was bedeutet, dass das Gewebe mindestens zwei Tage alt ist (nach Enukleation) und einen langen und teuren Transport erfordert, aber lokales Spendergewebe nicht in ausreichenden Mengen für eine produktive Forschung zur Verfügung steht. Der Vorteil der Verwendung von Primärzellen wird durch mehrere Studien aus anderen Gruppen27,28bestätigt.

Für die Entwicklung einer zellbasierten nicht-viralen Gentherapie unter Verwendung des SB100X-Transposon-Systems zur Transfizierung primärer RPE- und IPE-Zellen mit den Genen, die für PEDF und/oder GM-CSF kodieren, zur Behandlung von nvAMD bzw. aAMD29,30,31,32, haben wir zunächst die Transfektion von ARPE-19-Zellen etabliert1 . Als nächstes wurden die Isolations- und Transfektionsprotokolle in leicht zugänglichen Primärzellen von Rindern und Schweinen etabliert. Jetzt wurde die Isolierung und Transfektion von primären RPE- und IPE-Zellen aus fünf verschiedenen Arten etabliert, von kleinen (als Maus) bis zu großen Säugetieren (als Rinder). Es wurde in primären RPE- und IPE-Zellen aus menschlichen Spenderaugen bestätigt30. Die GMP-konforme Produktion (Good Manufacturing Practices) des ATMP wurde ebenfalls unter Verwendung von menschlichem Spendergewebe validiert33. Schließlich wurden sowohl die Sicherheit als auch die Effizienz des Ansatzes in vivo bei drei verschiedenen Spezies bewertet, für die das Protokoll angepasst wurde: Maus, Ratte und Kaninchen. Im klinischen Aufbau wird eine Irisbiopsie vom Patienten geerntet und IPE-Zellen werden isoliert und im Reinraum transfiziert, bevor die Zellen subretinal in denselben Patienten zurück transplantiert werden. Der gesamte Prozess findet während einer einzigen chirurgischen Sitzung statt, die etwa 60 Minuten dauert. Die Entwicklung des Behandlungsansatzes und die Bewertung seiner Effizienz erforderten ausgezeichnete In-vitro- und Ex-vivo-Modelle, um robuste und effiziente Genliefermethoden zu implementieren, die Effizienz der Genabgabe, die therapeutische Proteinproduktion und die neuroprotektiven Wirkungen zu analysieren und Zelltransplantate zu produzieren, um den Ansatz in vivozu testen1,24,25,29,30 . Erwähnenswert ist, dass die Therapie von der Ethikkommission für Forschung des Kantons Genf (Nr. 2019-00250) über die ethische Genehmigung für eine klinische Phase-Ib/IIa-Studie verfügt und derzeit die letzten präklinischen Daten, die von den Schweizer Zulassungsbehörden zur Genehmigung angefordert wurden, mit dem vorgestellten Protokoll gesammelt werden. In dieser Hinsicht zeigten präklinische In-vivo-Daten eine signifikante Reduktion des CNV und eine ausgezeichnete Sicherheit24,25,31.

Hier wird die Isolierung und Kultur von RPE/IPE-Zellen aus Rind, Schwein, Kaninchen, Ratte und Maus sowie der Einsatz des integrativen TRANSPONON-Systems SB100X in Kombination mit der Elektroporation als effiziente Gen-Delivery-Methode beschrieben. Insbesondere primäre PE-Zellen wurden transfiziert, um PEDF und GM-CSF zu überexprimieren. Die Sammlung dieser Protokolle ermöglicht die Durchführung der In-vitro- und In-vivo-Studien in allen präklinischen Phasen der ATMP-Entwicklung. Darüber hinaus hat der Aufbau das Potenzial, an andere interessante Gene und Krankheiten angepasst zu werden.

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Protokoll

Die Protokolle, an denen Tiere beteiligt waren, wurden von zertifiziertem Personal und nach Genehmigung durch das kantonale Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale von Genf, Schweiz, und gemäß der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung (Genehmigungs-Nr. GE/94/17). Erwachsene gesunde Braune Wanderratten, C57BL/6-Mäuse und neuseeländische weiße Kaninchen wurden durch eine Überdosis Pentobarbital (150 mg/kg), verdünnt in 0,9% NaCl intraperitoneal injiziert, eingeschläfert und die Augen wurden unmittelbar nach dem Opfer enukleiert. Schweine- und Rinderaugen wurden innerhalb von 6 Stunden nach der Opferung aus einem örtlichen Schlachthof gewonnen und auf Eis ins Labor transportiert.

1. Vor der Zubereitung

  1. Bereiten Sie ein komplettes Medium vor (DMEM/Ham's F12 ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 80 U/ml Penicillin / 80 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B). Erhitzen Sie das Medium, 1x PBS und 0,25% Trypsin (falls erforderlich) in einem 37 °C warmen Wasserbad.
  2. Legen Sie einen sterilen Vorhang in die Haube, um einen aseptischen Arbeitsplatz vorzubereiten. Führen Sie alle benötigten sterilen Instrumente und Materialien in die Haube ein.
    HINWEIS: Nur die Enukleation der Augen und die Reinigung des verbleibenden Muskelgewebes und der Haut sind die Verfahren, die außerhalb der Haube durchgeführt werden, der Rest der Schritte muss innerhalb der Haube durchgeführt werden.

2. Isolierung von Ratten-/Maus-PE-Zellen

  1. Verwenden Sie eine gebogene Schere und eine Colibri-Pinzette, um die Augen nach dem Einschläfern des Tieres zu enukleieren. Reinigen Sie das restliche Muskelgewebe und die Haut mit einer Schere und einer Pinzette (nicht steril) von den Augen.
    HINWEIS: Die Größe der Schere und Pinzette, die für die Enukleation und Reinigung der Augen verwendet wird, hängt von der Art ab (z. B. für Ratte und Maus sind die Instrumente kleiner als die für Schweine und Rinder) (siehe Abbildung S1).
    1. Sammeln Sie die Augen in einem 50 ml Röhrchen, das mit unsterilem PBS gefüllt ist, und übertragen Sie das Röhrchen auf die Laminar-Flow-Haube. Desinfizieren Sie die Augen, indem Sie 2 minuten in jodhaltige Lösung eintauchen, und geben Sie sie dann in eine Petrischale, die mit sterilem PBS gefüllt ist.
  2. Öffnen der Glühbirne
    1. Nachdem Sie die Augen in eine sterile Petrischale gebracht haben, halten Sie eine mit Colibri oder einer spitzen Pinzette fest in der Nähe des Sehnervs. Stanzen Sie ein Loch in der Nähe der Grenze der Iris (zwischen Pars Plana und Ora Serrata) mit einer 18 G Nadel. Stecken Sie eine kleine Schere in das Loch und schneiden Sie um die Iris herum. Entfernen Sie das vordere Segment (Hornhaut, Linse und Iris) und legen Sie es in eine Petrischale. Lassen Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper, bis die RPE-Zellen isoliert sind.
  3. Isolierung von IPE-Zellen
    1. Entfernen Sie die Linse und ziehen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Iris heraus, die die IPE-Zellen enthält. Legen Sie die Iris in eine Petrischale, waschen Sie sie mit sterilem PBS und lassen Sie sie in PBS, bis mehr Iris vorbereitet ist.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 bis 2.3.1, damit alle Augen an diesem Tag vorbereitet sind.
    3. 50 μL 0,25% Trypsin pro Iris zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren. Trypsin entfernen, 150 μL komplettes Medium pro Iris hinzufügen und die IPE vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette abkratzen; Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Gewebe zu immobilisieren. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5 ml Röhrchen. Verwenden Sie 10 μL der Zellsuspension 1:3 mit Trypanblau verdünnt, um die Zellen in der Neubauer-Kammer34,35zu zählen.
    4. Wenn nicht sofort transfiziert, säen Sie 200.000 Zellen / Well in eine 24-Well-Platte (100.000 Zellen / cm2) in 1 ml vollständigem Medium (10% FBS) (für die Aussaat siehe Tabelle 1). Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 ° C, 5% CO2.
      HINWEIS: Es kann notwendig sein, mehrere Augen zu bündeln, um genügend Zellen für die Aussaat zu haben.
  4. Isolierung von RPE-Zellen
    1. Entfernen Sie Glaskörper und Netzhaut mit einer dünnen Pinzette aus dem hinteren Segment. Vermeiden Sie es, das retinale Pigmentepithel zu beschädigen.
    2. Schneiden Sie das Segment mit einem # 10-Skalpell in zwei Hälften, um den Globus vollständig zu öffnen und mit sterilem PBS zu waschen.
    3. 50 μL 0,25% Trypsin pro Auge zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren. Trypsin entfernen und 150 μL komplettes Medium pro Globus hinzufügen und die RPE-Zellen vorsichtig mit einem runden Skalpell abkratzen; Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Gewebe zu immobilisieren. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5 ml Röhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension; 1:4 mit Trypanblau verdünnen, um die Zellen in der Neubauerkammer zu zählen.
    4. Siehe Schritt 2.3.4.
      HINWEIS: Es kann notwendig sein, mehrere Augen zu bündeln, um genügend Zellen für die Aussaat zu haben.

3. Isolierung von Kaninchen-PE-Zellen

  1. Führen Sie die Reinigung und Desinfektion wie in den Schritten 2.1 bis 2.1.1 beschrieben durch.
  2. Legen Sie ein Auge auf eine sterile Mullkompresse und halten Sie sie fest in der Nähe des Sehnervs. Öffne das Auge mit dem Skalpell #11 und der Schere ca. 2 mm unter dem Limbus. Entfernen Sie das vordere Segment (Hornhaut, Linse und Iris) und legen Sie es in eine Petrischale. Lassen Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper, bis die RPE-Zellen isoliert sind.
  3. Isolierung von IPE-Zellen
    1. Führen Sie Schritt 2.3.1 aus. Entfernen Sie den Ziliarkörper von der Iris, indem Sie mit einem Skalpell #10 schneiden.
    2. Nach der Herstellung von 2 Iris mit 1 ml 0,25 % Trypsin bei 37 °C für 10 min inkubieren; während dieser Zeit können die RPE-Zellen isoliert werden (siehe Schritt 3.4). Entfernen Sie das Trypsin und geben Sie 1 ml komplettes Medium in die Iris und isolieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette kratzen. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 1:3 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
    3. Siehe Schritt 2.3.4.
  4. Isolierung von RPE-Zellen
    1. Führen Sie Schritt 2.4.1 aus.
    2. Legen Sie eine sterile Gaze in eine 12-Well-Platte und legen Sie die Glühbirne über die Gaze.
    3. Waschen Sie mit PBS und führen Sie Schritt 2.4.3 aus.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine gebogene, feuerpolierte Pasteurpipette.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min bei 120 x g.
    5. Siehe Schritt 2.3.4.

4. Isolierung von SCHWEINE-PE-Zellen

  1. Führen Sie die Reinigung wie in Schritt 2.1 beschrieben durch. Waschen Sie mit PBS und desinfizieren Sie die Augen, indem Sie 2 Minuten in jodhaltige Lösung eintauchen, mit PBS abspülen. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort.
  2. Isolierung von IPE-Zellen
    1. Führen Sie Schritt 3.3.1 aus. Nach der Herstellung von 2 Iris fügen Sie 1 ml komplettes Medium hinzu und isolieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette kratzen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 1:4 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
    2. Siehe Schritt 2.3.4.
  3. Isolierung von RPE-Zellen
    1. Führen Sie Schritt 2.4.1 aus. Legen Sie die Zwiebel in eine Petrischale und waschen Sie sie mit PBS. Füllen Sie die Glühbirne mit 1 ml komplettem Medium.
    2. Entfernen Sie die RPE-Zellen vorsichtig mit einer gebogenen, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Achten Sie darauf, von unten nach oben zu kratzen, um ein Abrutschen des Aderhaut-Bruch-Membrankomplexes zu vermeiden. Sammeln Sie die Zellsuspension in der Lampe mit einer 1.000 μL Pipette und geben Sie sie zur Wiederverwendung in ein 1,5 ml Röhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie 1:8 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
    3. Siehe Schritt 2.3.4.

5. Isolierung von bovinen PE-Zellen

  1. Führen Sie die Reinigung wie in Schritt 2.1 beschrieben durch. Waschen Sie mit PBS und desinfizieren Sie die Augen, indem Sie 2 Minuten in jodhaltige Lösung eintauchen, mit PBS abspülen. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort.
  2. Isolierung von IPE-Zellen
    1. Führen Sie Schritt 3.3.1 aus. Nach der Herstellung von zwei Iris, inkubieren Sie mit 2 ml 0,25% Trypsin bei 37 ° C für 10 min. Während dieser Zeit können die RPE-Zellen isoliert werden (siehe Schritt 5.3).
    2. Entfernen Sie das Trypsin und geben Sie 2 ml komplettes Medium in die Iris und isolieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette kratzen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min bei 120 x g. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 1:4 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
    3. Wenn nicht sofort transfiziert, säen Sie 320.000 Zellen / Well in eine 6-Well-Platte in 3 ml vollständigem Medium (10% FBS) (für die Aussaat siehe Tabelle 1). Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 ° C, 5% CO2.
  3. Isolierung von RPE-Zellen
    1. Folgen Sie Schritt 2.4.1. Legen Sie die Zwiebel in eine Petrischale und waschen Sie sie mit PBS. Nach der Zubereitung von 2 Augen die Zwiebel ca. 3/4 mit Trypsin füllen und für 25 min bei 37 °C mit dem Deckel der Petrischale auf der Oberseite der Bulbi inkubieren.
    2. Entfernen Sie das Trypsin und fügen Sie 1 ml komplettes Medium hinzu. Führen Sie Schritt 4.3.2 aus. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min bei 120 x g.
    3. Siehe Schritt 5.2.3.

6. Anbau - Mittlerer Wandel

  1. Kultur der Zellen in DMEM/Ham's F12, ergänzt mit 10% FBS, 80 U/ml Penicillin / 80 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B, bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Nach 3-4 Tagen pipettieren Sie auf und ab, um nicht adhärente Zellen zu sammeln und die Hälfte des Volumens in eine andere Vertiefung zu geben. Füllen Sie bis zu 1 ml mit komplettem Medium.
    HINWEIS: Dies ermöglicht eine Fläche, die groß genug ist, damit alle Zellen isoliert werden können, um die Ausgabe anzuhängen und zu maximieren.
  2. Nach weiteren 3-4 Tagen wiederholen Sie die Zellentnahme, aber diesmal durch Bündelung der nicht adhärenten Zellen aus zwei Vertiefungen in einer Vertiefung (z. B. A1 + B1 in C1). Fügen Sie allen Vertiefungen Medium hinzu. Beobachten Sie die Zellen und wechseln Sie das Medium 2 Mal pro Woche (für 6- und 24-Well-Platten verwenden Sie 3 bzw. 1 ml / Well). Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, wechseln Sie zu einem vollständigen Medium mit 1% FBS oder verwenden Sie die Zellen für Experimente (z. B. Transfektion).
    HINWEIS: RPE- und IPE-Zellen sind nach 3-4 bzw. 4-5 Wochen nach der Isolierung konfluent. Die Reinheit der Zellkultur wurde bestätigt, indem die Zellmorphologie (pigmentierte Zellen) und spezifische Marker überprüft wurden, wie von Johnen und Kollegenbeschrieben 36.

7. Elektroporation von primären PE-Zellen

  1. Elektroporation wie vor1,37beschrieben durchführen.
  2. Abhängig von der Anzahl der transfizierten Zellen verwenden Sie 6-, 24- oder 48-Well-Platten (siehe Tabelle 2), um die Zellen ohne Antibiotika oder Antimykotika in Medium zu säen. Für die folgenden 2 Wochen zweimal wöchentlich Tropfen mit Medium hinzufügen, das Penicillin (80 U / ml), Streptomycin (80 μg / ml) und Amphotericin B (2,5 μg / ml) enthält. Tauschen Sie das Medium 2 Wochen nach der Transfektion vollständig aus.
  3. Um das Zellwachstum, die Transfektionseffizienz und die Proteinsekretion zu bestimmen, überwachen Sie die Zellen wöchentlich durch Mikroskopie und analysieren Sie den Zellkulturüberstand durch Western Blot. Vor Beendigung der Kultur nehmen Sie einen 24-stündigen Zellkulturüberstand, um die Proteinsekretion per ELISA zu quantifizieren, zählen Sie die Zellen, messen Sie die Fluoreszenz durch bildbasierte Zytometrie (im Falle von Venus-transfizierten Zellen) gemäß den Anweisungen der Hersteller (siehe Materialtabelle)und sammeln Sie das Zellpellet für die RT-qPCR-basierte Genexpressionsanalyse.
    HINWEIS: Diese Methoden sind in der vorliegenden Arbeit nicht enthalten, da es nicht der Zweck ist, die Analyse der Zellen im Detail zu erklären, sondern ihre Isolierung. Die Zellsaatdichte ist für alle Arten gleich (100.000 Zellen/cm2),aber da die Anzahl der isolierten Zellen variiert, wurden unterschiedliche Platten verwendet. Darüber hinaus kann es für Mäuse, Ratten und Kaninchen notwendig sein, 2-3 Augen zu sammeln, um genügend Zellen für die Aussaat zu haben.
SpeziesTrypsin BehandlungN° IPE ZellenN° RPE ZellenPlatte für die Aussaat (100.000 Zellen/cm2)
Maus/RatteJa~50.000~150.00024-Well-Platten
KaninchenJa~350.000~2.500.00024-Well-Platten
SchweinNein~1.000.000~3.000.00024-Well-Platten
RindJa~1.700.000~5.000.0006-Well-Platten

Tabelle 1: Anzahl der primären PE-Zellen, die aus Augen verschiedener Spezies isoliert wurden.

NameFlächeVolumen mittelTrypsinLautstärke mittel, um die Wirkung von Trypsin zu stoppenAussaatdichte
6-Well-Platte9,6 cm²3,0 ml0,5 ml1,0 ml3x105
24-Well-Platte2,0 cm²1,0 ml0,2 ml0,8 ml5x104
48-Well-Platte1,1 cm²0,5 ml0,1 ml0,4 ml0,5-1x104

Tabelle 2: Zellkulturvolumina und Seeding-Dichten.

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Ergebnisse

PE-Isolierung aus verschiedenen Säugetierarten
Mit den oben genannten Protokollen wurden IPE- und RPE-Zellen erfolgreich isoliert und aus fünf verschiedenen Spezies kultiviert. Die Anzahl der Zellen, die aus jedem Verfahren gewonnen werden, hängt von der Art und Größe des Auges ab (Tabelle 1). Wie in Abbildung 1gezeigt, zeigen die Zellen eine typische PE-Zellmorphologie und Pigmentierung (mit Ausnahme der gezeigten Kaninchenzellen, die von Albino New Zeal...

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Diskussion

Standardisierte Methoden zur Isolierung und Kultivierung von PE-Zellen sind von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapieansätze für netzhautdegenerative Erkrankungen. Mit den hier vorgestellten Protokollen können PE-Zellen erfolgreich aus verschiedenen Spezies isoliert und über lange Zeiträume kultiviert werden (bisher wurde die längste Kultur 2 Jahre lang gepflegt1,38); typische PE-Zellmorphologie, Pigmentierung und Funktion wurde beobachtet (<...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Ein Dank gebührt Gregg Sealy und Alain Conti für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Kommission im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms, dem Schweizerischen Nationalfonds für Wissenschaften und der Schmieder-Bohrisch-Stiftung unterstützt. Das Z.I. wurde vom Europäischen Forschungsrat, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] und B.M.W. aus einem Fulbright Research Grant und einem Bundes-Exzellenz-Stipendium gefördert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Well-PlattenCorning353043
24-Well-PlattenCorning353047
48-Well-PlattenThermoFisher Scientific150687
6-Well-PlatteGreiner7657160
BetadineMundipharma
Bonn Mikropinzette flach
Colibri-Pinzette (steril)
CytoTox-Glo Zytotoxizitäts-AssayPromegaG9291
DMEM/Ham's F12Sigma-AldrichD8062
Tuch (steril)Mö lnlycke Health Care800530
Elektroporationspuffer 3P.143P Pharmazie
FBSBrunschwigP40-37500
Pinzette (andere Größe) (steril)
MullkompressePROMEDICAL AG25403
NaCl (0,9%)Laboratorium Dr. Bichsel AG1000090
Nadel (18G) TerumoTER-NN1838R
Neon Transfektion Set 10 & Mikro; LThermoFisher ScientificMPK1096
Neon TransfektionssystemThermoFisher ScientificMPK5000S
Neubauer KammerMarienfeld-superior640010
Pasteurpipette (feuerpoliert)Witeg4100150
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)Ospedalia AG31408025
PetrischaleThermoFisher Scientific150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-VenusPastor et al., 2018. Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Scherman und Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µ L)M&aakut; té S et al., 2009. Bereitgestellt von Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-VenusJohnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His Plasmid-DNA (250 ng/µ L)In unserem Labor kloniert
pT2-CMV-PEDF-His-Plasmid-DNA (250 ng/µ L)Pastor et al., 2018
scarpel Nr. 10Swann-Morton501
scarpel no. 11Swann-Morton503
Scharf-scharfe Spitze gebogen Extra feine Bonn Schere (steril) 
Scharfe Spitze gerade Extra feine Bonner Schere (steril)
Tali Bildbasiertes ZytometerThermoFisher ScientificT10796
Trypsin 0,25% ThermoFisher Scientific25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%Sigma-AldrichT4174
Vannas Federschere gebogen (steril)

Referenzen

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