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Methodenartikel

Chemische Dimerisierungsinduzierte Proteinkondensate auf Telomeren

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DOI:

10.3791/62173

⸱

12. April 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll veranschaulicht ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem, um Kondensate auf Chromatin zu erzeugen.  Die Bildung des Kernkörpers der promyelozytären Leukämie (PML) an Telomeren mit chemischen Dimerisatoren wird nachgewiesen. Tröpfchenwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung werden mit Lebendzellbildgebung, Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) überwacht.

Zusammenfassung

Chromatin-assoziierte Kondensate sind an vielen Kernprozessen beteiligt, aber die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben schwer fassbar. Dieses Protokoll beschreibt ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem zur Herstellung von Kondensaten auf Telomeren. Der chemische Dimerizer besteht aus zwei verknüpften Liganden, die jeweils an ein Protein binden können: Halo-Ligand an Halo-Enzym und Trimethoprim (TMP) an E. coli dihydrofolat-Reduktase (eDHFR). Die Fusion des Halo-Enzyms zu einem Telomerprotein verankert Dimerizer an Telomeren durch kovalente Halo-Liganden-Enzymbindung. Die Bindung von TMP an eDHFR rekrutiert eDHFR-fusionierte Phasen, die Proteine an Telomere trennen und die Kondensatbildung induziert. Da die TMP-eDHFR-Wechselwirkung nicht kovalent ist, kann die Kondensation umgekehrt werden, indem überschüssiges freies TMP verwendet wird, um mit dem Dimerizer um die eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Ein Beispiel für die Induktion der Kernkörperbildung von promyelozytärer Leukämie (PML) auf Telomeren und die Bestimmung von Kondensatwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung wird gezeigt. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Kondensate an anderen genomischen Stellen zu induzieren, indem Halo zu einem Protein verschmiert wird, das direkt an das lokale Chromatin bindet, oder an dCas9, das mit einer Leit-RNA auf den genomischen Locus abzielt. Durch die Zeitauflösung, die für die Einzelzell-Live-Bildgebung erforderlich ist, während die Phasentrennung in einer Zellpopulation für biochemische Assays aufrechterhalten wird, eignet sich diese Methode sowohl für die Untersuchung der Bildung als auch der Funktion von Chromatin-assoziierten Kondensaten.

Einleitung

Viele Proteine und Nukleinsäuren durchlaufen eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) und setzen sich selbst zu biomolekularen Kondensaten zusammen, um die Biochemie in den Zellen1,2zu organisieren. LLPS von Chromatin-bindenden Proteinen führt zur Bildung von Kondensaten, die mit spezifischen genomischen Loci assoziiert sind und an verschiedenen lokalen Chromatinfunktionen beteiligt sind3. Zum Beispiel liegt LLPS des HP1-Proteins der Bildung von Heterochromatindomänen zugrunde, um das Genom zu organisieren4,5, LLPS von Transkriptionsfaktoren bildet Transkriptionszentren zur Regulierung der Transkription6, LLPS von entstehenden mRNAs und multisexuellem Kämmprotein erzeugt Histon-Locus-Körper, um die Transkription und Verarbeitung von Histon-mRNAs zu regulieren7.  Trotz vieler Beispiele für chromatin-assoziierte Kondensate sind die zugrunde liegenden Mechanismen der Kondensatbildung, -regulierung und -funktion jedoch nach wie vor wenig verstanden. Insbesondere werden nicht alle Chromatin-assoziierten Kondensate durch LLPS gebildet und sorgfältige Auswertungen der Kondensatbildung in lebenden Zellen sind noch erforderlich8,9. Zum Beispiel wird gezeigt, dass HP1-Protein in der Maus nur eine schwache Fähigkeit hat, flüssige Tröpfchen in lebenden Zellen zu bilden, und Heterochromatinherde verhalten sich wie kollabierte Polymerkügelchen10. Daher sind Werkzeuge zur Induktion von De-novo-Kondensaten auf Chromatin in lebenden Zellen wünschenswert, insbesondere solche, die die Verwendung von Live-Imaging und biochemischen Assays ermöglichen, um die Kinetik der Kondensatbildung, die physikalischen und chemischen Eigenschaften der resultierenden Kondensate und die zellulären Folgen der Kondensatbildung zu überwachen.

Dieses Protokoll berichtet von einem chemischen Dimerisierungssystem, um Proteinkondensate auf Chromatin11 zu induzieren (Abbildung 1A). Der Dimerizer besteht aus zwei miteinander verbundenen protein-interagierenden Liganden: Trimethoprim (TMP) und Halo-Ligand und kann Proteine dimerisieren, die mit den verwandten Rezeptoren verschmolzen sind: Escherichia coli dihydrofolat-Reduktase (eDHFR) und ein bakterielles Alkyldehalogenase-Enzym (Halo-Enzym), jeweils12. Die Interaktion zwischen Halo-Ligand und Halo-Enzym ist kovalent, so dass das Halo-Enzym als Anker verwendet werden kann, indem es mit einem Chromatin-bindenden Protein verschmolzen wird, um ein phasenseparierendes Protein zu rekrutieren, das mit eDHFR zu Chromatin verschmolzen ist. Nach der anfänglichen Rekrutierung übergibt eine erhöhte lokale Konzentration des phasenseparierenden Proteins die für die Phasentrennung erforderliche kritische Konzentration und keimt somit ein Kondensat am Anker ein (Abbildung 1B). Durch die Verschmelzung fluoreszierender Proteine (z.B. mCherry und eGFP) zu eDHFR und Halo können Keimbildung und Wachstum von Kondensaten in Echtzeit mit Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Da die Interaktion zwischen eDHFR und TMP nicht kovalent ist, kann überschüssiges freies TMP hinzugefügt werden, um mit dem Dimerizer für die eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Dadurch wird dann das Phasentrennprotein aus dem Anker freisenden und das Chromatin-assoziierte Kondensat gelöst.

Wir haben dieses Werkzeug verwendet, um die De novo promyelozytäre Leukämie (PML) Kernkörperbildung auf Telomeren in Telomeren in Telomerase-negativen Krebszellen zu induzieren, die einen alternativen Verlängerungsweg der Telomere (ALT) für die Telomererhaltung verwenden13,14.  PML-Kernkörper sind membranlose Kompartimente, die an vielen Kernprozessen beteiligt sind15,16 und sind einzigartig auf ALT-Telomere lokalisiert, um APBs zu bilden, für ALT-Telomer-assoziierte PML-Körper17,18. Telomere clustern sich innerhalb von APBs, vermutlich um Reparaturvorlagen für die homologiegerichtete Telomer-DNA-Synthese in ALT19bereitzustellen. Tatsächlich wurde die Telomer-DNA-Synthese in APBs nachgewiesen und APBs spielen eine wesentliche Rolle bei der Anreicherung von DNA-Reparaturfaktoren auf Telomeren20,21. Die Mechanismen, die der APB-Assemblierung und dem Telomer-Clustering innerhalb von APBs zugrunde liegen, waren jedoch unbekannt. Da Telomerproteine in ALT-Zellen durch kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikatoren (SUMOs)22eindeutig modifiziert werden, viele APB-Komponenten Sumoylierungsstellen 22,23,24,25 und/oder SUMO-interagierende Motive (SIMs)26,27 und SUMO-SIM-Wechselwirkungen die Phasentrennung28antreiben, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Sumoylation auf Telomeren zur Anreicherung von SUMO/SIM-haltigen Proteinen führt und SUMO-SIM-Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen führen zur Phasentrennung.  PML-Protein, das drei Sumoylationsstellen und eine SIM-Stelle hat, kann zu sumoylierten Telomeren rekrutiert werden, um APBs zu bilden, und die Koaleszenz flüssiger APBs führt zu Telomerclustern. Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir das chemische Dimerisierungssystem, um die sumoylationsinduzierte APB-Bildung nachzuahmen, indem sim zu Telomeren rekrutiert wurde (Abbildung 2A)11. GFP wird zur Visualisierung mit Haloenzym und mit dem Telomer-bindenden Protein TRF1 verschmolzen, um den Dimerizer an Telomeren zu verankern. SIM ist mit eDHFR und mCherry verschmolzen. Die Kinetik der Kondensatbildung und die durch Tröpfchenfusion induzierte Telomerclusterung werden mit der Bildgebung von lebenden Zellen verfolgt.  Die Phasentrennung wird durch Zugabe von überschüssigem freiem TMP umgekehrt, um mit der eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) werden verwendet, um die Kondensatzusammensetzung und die telomerische Assoziation zu bestimmen. Recruiting SIM reichert SUMO auf Telomere an und die induzierten Kondensate enthalten PML und sind daher APBs. Die Rekrutierung einer SIM-Mutante, die nicht mit SUMO interagieren kann, reichert SUMO nicht an Telomeren an oder induziert keine Phasentrennung, was darauf hindeutet, dass die grundlegende treibende Kraft für die APB-Kondensation die SUMO-SIM-Interaktion ist. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung können PolySUMO-PolySIM-Polymere, die mit einem TRF2-Bindungsfaktor RAP1 verschmolzen sind, auch die APB-Bildung29induzieren. Im Vergleich zum polySUMO-polySIM-Fusionssystem, bei dem die Phasentrennung erfolgt, solange genügend Proteine produziert werden, induziert der hier vorgestellte chemische Dimerisierungsansatz die Phasentrennung bei Bedarf und bietet somit eine bessere zeitliche Auflösung, um die Kinetik der Phasentrennung und des Telomerclustering-Prozesses zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht dieses chemische Dimerisierungssystem die Rekrutierung anderer Proteine, um ihre Fähigkeit zur Induktion von Phasentrennung und Telomerclustering zu bewerten. Zum Beispiel kann ein ungeordnetes Protein, das zu Telomeren rekrutiert wird, auch Tröpfchen und Cluster-Telomere bilden, ohne die APB-Bildung zu induzieren, was darauf hindeutet, dass die Telomerclusterung unabhängig von der APB-Chemie ist und nur auf der APB-Flüssigkeitseigenschaft11beruht.

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Protokoll

1. Herstellung transienter Zelllinien

  1. Kultur U2OS Akzeptorzellen auf 22 x 22 mm Glasdeckschichten (für Live-Bildgebung) oder kreisförmigen Decklippen mit 12 mm Durchmesser (für IF oder FISH), die mit Poly-D-Lysin in 6-Well-Platte mit Wachstumsmedium (10% fetales Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung in DMEM) beschichtet sind, bis sie eine Konfluenz von 60-70% erreichen.
  2. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium vor der Transfektion durch ein 1 ml Transfektionsmedium (Wachstumsmedium ohne Penicillin-Streptomycin-Lösung).
  3. Für jede Transfektionsbohrung 4 μL Transfektionsreagenz zu 150 μL reduzierten Serummedien hinzufügen, Wirbel für 10 Sekunden und dann für 5 Minuten inkubieren.
  4. Fügen Sie für jede Vertiefung Halo-Konstruktplasmid (Halo-GFP-TRF1 oder Halo-TRF1) und eDHFR-Konstruktplasmid (mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDHFR-SIM-Mutante) in einem Massenverhältnis von 1:1 (0,5 μg Halo-Konstruktplasmid mit 0,5 μg eDHFR-Konstruktplasmid) zu 150 μL reduzierten Serummedien tropfenweise hinzu, mischen Sie durch Pipettieren.
    HINWEIS: Die Tags sind relativ klein (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) und es wurde kein Einfluss auf die Phasentrennung beobachtet. Es wird jedoch empfohlen, Mutanten wie SIM-Mutanten zu verwenden, die hier verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Phasenverhalten empfindlich auf die Mutationen und nicht auf die Tags reagiert. SIM ist von PIASx28,30. SIM-Sequenz ist AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGAAGAAGACCACCGGCTAAACGT. SIM-Mutante wird durch Mutation der SIM-Aminosäuren VIDL zu VADA28erzeugt, und die Sequenz ist AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGAAGAAGACCACCGGCTAAACGT. Wir haben unsere Plasmide abgelegt, um ein Addgen hinzuzufügen: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM Mutante.
  5. Fügen Sie 150 μL Transfektionsreagenz-reduzierte Serummedienmischung zu 150 μL reduzierten Serummedien mit DNA hinzu, tropfenweise, mischen Sie durch Pipettieren, inkubieren Sie für 5 Minuten.
  6. Fügen Sie die 300 μL Transfektionsreagenz-DNA-Mischung den Zellen tropfenweise hinzu und legen Sie die Zellen dann wieder in den Inkubator.
  7. Warten Sie 24-48 Stunden vor Live-Bildgebung, Immunfluoreszenz (IF) oder Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH).

2. Dimerisierung auf Telomeren

  1. Dimerisatoren in Dimethylsulfoxid bei 10 mM auflösen und in Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff bei −80 °C zur Langzeitlagerung lagern.
    HINWEIS: Anstatt den Dimerizer mit TMP zu verwenden, der direkt mit Halo (TMP-Halo, TH) verbunden ist, wird der Dimerizer TMP-NVOC-Halo (TNH) verwendet, der einen lichtempfindlichen Linker, 6-Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), zwischen TMP und Haloligand hat31. Dies liegt daran, dass TNH (~ 5 Minuten) weniger Zeit in die Zelle diffundiert als TH (~ 20 Minuten). Die hier gezeigten Ergebnisse können auch mit TH erzielt werden. Achten Sie bei der Verwendung von TNH darauf, den Dimerizer nicht Licht auszusetzen, um eine NOVC-Spaltung zu vermeiden. Behandeln Sie TNH in einem dunklen Raum mit einer schwachen Rotlichtlampe, lagern Sie den Dimerizer in bernsteinfarbenen Kunststofftuben und wickeln Sie den Behälter mit TNH oder behandelten Zellen mit Aluminiumfolie ein. Die Bildgebung von TNH mit DIC ist sicher.
  2. Nehmen Sie ein Aliquot von 10 mM Dimerizer von −80 °C und verdünnen Sie es im Bildmedium auf eine Stammkonzentration von 10 μM und lagern Sie es bei −20 °C.
  3. Bei gebrauchsfertiger Verdünnung von Dimerisatoren aus 10 μM Stammlösung auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 100 nM in Wachstumsmedium (für feststehende Bildgebung) oder Bildmedium. Behandeln Sie Zellen mit 100 nM-Dimerisatoren (Endkonzentration) auf der Bühne für die Live-Bildgebung oder inkubieren Sie sie für 4-5 Stunden für Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH).
    HINWEIS: Die Konzentration der verwendeten Dimerisatoren beeinflusst die Dimerisierungseffizienz und damit die Phasentrennung. Die Dimerizerkonzentration, die eine maximale Dimerisierungseffizienz ermöglicht, hängt vom Zelltyp und der Ankerproteinkonzentration ab, so dass sie für verschiedene Experimente bestimmt werden muss. Eine einfache Möglichkeit besteht darin, Zellen zu inkubieren, die das Ankerprotein und mCherry-eDHFR exprimieren (ohne mit dem phasenseparierenden Protein zu verschmelzen oder mit einer nicht phasenseparierenden Mutante verschmolzen zu sein) und die Dimerizerkonzentration zu identifizieren, bei der die höchste mCherry-Intensität am Anker erreicht wird. Ein systematischerer Ansatz besteht darin, Zellen zu inkubieren, die den Anker nur mit unterschiedlichen Konzentrationen von Dimerisatoren und dann mit einem Halo-Bindungsfarbstoff exprimieren, um die Dimerizer-Konzentration zu bestimmen, bei der die Halo-Bindungsfarbstoffintensität zu stagnieren beginnt (dh alle Halo-verschmolzenen Anker sind vom Dimerizer besetzt und nicht mehr für den Halo-Bindungsfarbstoff übrig)32.
  4. Um die Dimerisierung umzukehren, inkubieren Sie die Zellen mit Dimerizern für 2-5 Stunden (mit oder ohne Live-Bildgebung) oder bis die gewünschte Tröpfchengröße erreicht ist, und fügen Sie den Zellen 100 μM freieS TMP (Endkonzentration) hinzu, das im Bildmedium verdünnt ist.

3. Immunfluoreszenz (IF)

  1. Säen Sie 105 Zellen auf kreisförmigen Deckgläsern mit 12 mm Durchmesser, die mit Poly-D-Lysin in 6-Well-Platte beschichtet sind. Transfizieren Sie dann die beiden Plasmide (Halo-GFP-TRF1 mit mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDHFR-SIM Mutante) und warten Sie 24-48 Stunden, bevor Sie mit der Immunfluoreszenz fortfahren.
    HINWEIS: Warten Sie mehr als einen Tag, nachdem die Transfektion eine höhere Expression erhalten kann.
  2. Dimerisatoren mit Wachstumsmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 100 nM zu erreichen, verdünnte Dimerizer zu den Zellen geben und bei 37 °C für 4-5 Stunden inkubieren.
    HINWEIS: Die Phasentrennung wird nach Zugabe von Dimerizern schnell induziert (< 30 Minuten). Längere Inkubation hilft, Tröpfchen in größere Größen zu vergröbern. Nach dem Tröpfchenwachstum mit Live-Imaging kann die Zeit bestimmt werden, die es dauert, bis Tröpfchen einen gewünschten Zustand erreichen.
  3. Fixieren Sie Zellen in PBS-Lösung mit 4% Formaldehyd und 0,1% Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um Zellen zu permeabilisieren. Waschen Sie Zellen 3 mal mit PBS.
    HINWEIS: Nach diesem Schritt kann es pausiert und Zellen können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
    Achtung: Formaldehyd ist beim Einatmen schädlich und reizt beim Verschlucken auch Augen, Atemwege und Haut und ist eine mögliche Krebsgefahr. Müssen persönliche Schutzausrüstung tragen, nur in einem chemischen Abzug verwenden. Legen Sie es auch nach Gebrauch in einen Abfallbehälter, entsorgen Sie es nicht in der Spüle.
  4. Abdecklappen zweimal mit 50 μL TBS-Tx und einmal mit 50 μL Antikörperverdünnungspuffer (AbDil) waschen. TBS-Tx wurde durch TBS, 0,1% Triton X-100 und 0,05% Na-Azid hergestellt. AbDil wurde von TBS-Tx, 2% BSA und 0,05% Na-Azid hergestellt.
  5. Inkubieren Sie jeden Coverslip mit 50 μL primärem Anti-PML (1:50 Verdünnung in AbDil) / Anti-SUMO1 (1:200 Verdünnung in AbDil) / Anti-SUMO2/3 Antikörper (1:200 Verdünnung in AbDil) bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer über Nacht. mCherry-Antikörper können auch verwendet werden (1:200 Verdünnung in AbDil), um das mCherry-Signal für FISH zu erkennen.
    HINWEIS: FISH löscht das mCherry-Fluoreszenzsignal, was es schwierig macht, Zellen, die mit mCherry-Plasmiden transfiziert wurden, von denen zu unterscheiden, die in FISH-Experimenten nicht transfiziert wurden. Die Verwendung von mCherry-Antikörpern wird empfohlen. Alternativ kann man eine stabile Zelllinie herstellen, die eDHFR-haltiges Protein exprimiert.
  6. Abdecklappen 3 mal mit AbDil waschen, um ungebundene primäre Antikörper zu entfernen.
  7. Inkubieren Sie Zellen mit sekundären Antikörpern [Anti-Maus-IgG (H + L) sekundärer Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 647 für PML und SUMO, Anti-Kaninchen-IgG (H + L) sekundärer Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 555 für mCherry, beide bei 1:1000 Verdünnung in AbDil] für 1 Stunde in dunkler Box bei Raumtemperatur.
  8. Deckenlippen 3 mal mit TBS-Tx waschen.
  9. Etikettenobjektträger, DAPI in Montagemedien verdünnen, um eine DAPI-Endkonzentration von 1 μg/ml zu erreichen. Dann 2 μL verdünntes DAPI auf den Objektträger geben. Drehen Sie die Coverlips um und legen Sie sie auf DAPI Drop, streben Sie zusätzliche Flüssigkeit vom Rand des Coverslip an.
  10. Mit Nagellack versiegeln, trocknen lassen und von oben auf dem Abdeckt mit Wasser abspülen. Im Gefrierschrank für die Bildgebung aufbewahren.

4. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

  1. Säen Sie 105 Zellen auf kreisförmigen Deckgläsern mit 12 mm Durchmesser, die mit Poly-D-Lysin in 6-Well-Platte beschichtet sind. Transfizieren Sie Zellen mit Halo-TRF1 und mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDHFR-SIM mutierten Plasmiden und warten Sie 24-48 h, bevor Sie mit FISH fortfahren. Der Dimerisierungsschritt ist derselbe wie in 3.2 beschrieben.
    HINWEIS: Hier wird TRF1 nicht mit GFP verschmolzen, so dass der grüne Kanal für die Telomer-DNA-Sonde frei wird.
  2. Zellen mit 4% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren und 4 mal mit PBS waschen. Für IF-FISH fahren Sie von hier aus mit dem IF-Protokoll fort und nach dem Abwaschen des sekundären Antikörpers in IF (3.8), fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
  3. Dehydrat-Coverlips in einer Ethanol-Serie (70%, 80%, 90%, jeweils 2 Minuten).
  4. Inkubieren Sie Abdecklips mit 488-telC-PNA-Sonde (Verhältnis 1:2000) in 5 μL Hybridisierungslösung bei 75 °C für 5 Minuten. Hybridisierungslösung enthält 70% deionisiertes Formamid, 10 mM Tris (pH 7,4), 0,5% blockierendes Reagenz. Dann über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Abdecklappen mit Waschpuffer (70% Formamid, 10 mM Tris) 2 Min. 3 mal bei Raumtemperatur waschen und mit 1 μg/mL DAPI in Montagemedien für die Bildgebung montieren.
    HINWEIS: Das FISH-Protokoll ist ein veröffentlichtes Protokoll33'34.

5. Live-Bildgebung

  1. Wenn die Zellen für die Bildgebung bereit sind, montieren Sie Abdeckungen in magnetischen Kammern mit Zellen, die in 1 ml Bildgebungsmedium ohne Phenolrot auf einer beheizten Stufe in einer Umweltkammer gehalten werden.
  2. Richten Sie Mikroskope und Umweltkontrollgeräte ein. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop mit einem 100x 1,4 NA-Objektiv, einem Piezo-Z-Drive, einer EMCCD-Kamera (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) und einem Laser-Merge-Modul mit 455-, 488-, 561-, 594- und 647-nm-Lasern aufgenommen, die von bildgebungsähnlicher Software gesteuert werden. Die Ausgangsleistungen für alle Laser betragen 20 mW, gemessen am Faserende.
  3. Lokalisieren Sie Zellen mit hellem GFP-Signal auf Telomeren und diffus lokalisiertem mCherry-Signal im Nukleoplasmus. Finden Sie etwa 20 Zellen, merken Sie sich jede Position mit x-, y-, z-Informationen und richten Sie Parameter für die Zeitraffer-Bildgebung mit 0,5 μm Abstand für insgesamt 8 μm in Z und 5-Minuten-Zeitintervall für 2-4 Stunden für GFP- und mCherry-Kanäle ein. Verwenden Sie 30% von 594 nm und 50% von 488 nm Leistungsintensität, mit Belichtungszeiten von 200 ms und Kameraverstärkung 300.
    HINWEIS: Die Ausgangsleistung von Lasereinheiten beträgt 20 mW. Helle GFP-Herde weisen auf eine größere Ankergröße hin, die Kondensate leichter nukleieren kann. Finden Sie Zellen mit einem breiten Spektrum an mCherry-Signalen, da die Phasentrennung von der SIM-Konzentration in der Zelle abhängt. Zellen mit zu schwachem oder zu hellem mCherry-Signal trennen sich möglicherweise nicht phasenweise. Um Photobleaching zu vermeiden, verwenden Sie nicht zu viel Laserleistung oder zu lange Belichtungszeit.
  4. Beginnen Sie mit der Bildgebung und nehmen Sie die einmalige Schleife als Vordimerisierung. Halten Sie die Bildgebung an, fügen Sie 0,5 ml Bildgebungsmedien mit 15 μL 10 μM Dimerizer in die Bildgebungskammer auf der Bühne hinzu, so dass die endgültige Dimerizerkonzentration 100 nM beträgt. Setzen Sie die Bildgebung fort.
  5. Wenn Sie bereit sind, die Dimerisierung umzukehren, die Bildgebung zu unterbrechen, fügen Sie 0,5 ml Bildgebungsmedien mit 2 μL 100 mM Standard-TMP in die Bildgebungskammer auf der Bühne hinzu, um eine Endkonzentration von 100 μM TMP zu erhalten. Setzen Sie die Bildgebung der Zellen für 1-2 Stunden fort.

6. Feste Bildgebung

  1. Gleiches Mikroskop wie Live-Imaging, Bühnenheizung ist nicht erforderlich. Verwenden Sie 488 nm für die Abbildung von Telomer FISH, 561 nm für mCherry IF und 647 nm für PML oder SUMO IF.
    HINWEIS: Wenn Sie keinen mCherry-Antikörper verwenden, stellen Sie einfach das mCherry-Protein direkt ab, aber das Signal kann aufgrund des Abschreckens in FISH schwach sein.  Verwenden Sie immer noch 561 nm anstelle eines 594 nm Lasers, um mCherry abbilden, um signalbefleckt von Cy5 zu mCherry zu vermeiden.
  2. Lokalisieren Sie etwa 30-50 Zellen mit rotem Signal (mCherry oder mCherry IF), um nach transfizierten Zellen auszuwählen.
  3. Die Bilder wurden mit einem Abstand von 0,3 μm für insgesamt 8 μm in Z aufgenommen, um mehr Signale zu sammeln. Verwenden Sie 80% von 647 nm, 80% von 561 nm und 70% von 488 nm Leistungsintensität mit Belichtungszeiten von 600 ms und Kameraverstärkung 300.

7. Zeitrafferbilder verarbeiten

  1. Binärdatei für Telomere definieren
    Wählen Sie eine Zelle mit allen Zeit- und Z-Stack-Informationen, wählen Sie nur den GFP-Kanal und erstellen Sie eine binäre Schicht, indem Sie den Schwellenwert definieren. Passen Sie die unteren und oberen Werte des Schwellenwerts an und verwenden Sie Funktionen wie "Glätten", "Reinigen" und "Löcher füllen", um zu sehen, wie gut der Schwellenwert die gewünschten Objekte durch alle Zeitpunkte aufnimmt.
  2. Hintergrund subtrahieren
    Wählen Sie alle Kanäle aus, zeichnen Sie das Rechteck Region of Interest (ROI) auf dem Hintergrund (neben der Zelle). Definieren Sie diesen ROI als Hintergrund und subtrahieren Sie dann die Hintergrundintensität.
  3. Telomerbinär mit Telomerintensität verknüpfen
    Wählen Sie Telomer-Binär und verknüpfen Sie es mit dem GFP-Kanal, um die GFP-Intensität in den binären Objekten als Telomerintensität zu berechnen.
  4. Telomeranzahl und -intensität im Zeitverlauf berechnen
    Geben Sie an, welche Informationen exportiert werden sollen, z. B. Zeit, Objekt-ID, mittlere Intensität, Summenintensität und Exportdaten. Verwenden Sie die Zahlendiagrammsoftware, um die exportierte Tabelle zu lesen und Zahlen der Telomerzahl und Telomerintensität (fassen Sie die Intensität über das Volumen in jedem Telomer zusammen und dann den Mittelwert über alle Telomere in einer Zelle) im Laufe der Zeit.

8. Verarbeiten von Bildern mit festen Zellen

  1. Binäres für APBs definieren
    Wählen Sie transfizierte Zellen für die Analyse aus, indem Sie nach Signalen im 561nm-Kanal suchen. Definieren Sie nach dem Verfahren in 7.1 den Schwellenwert sowohl im GFP- (Telomer-DNA-FISH) als auch im Cy5-Kanal (PML oder SUMO IF), um binär für Telomere und PML-Körper bzw. SUMO zu generieren. Verschmelzen Sie GFP- und Cy5-Binärschichten und erstellen Sie eine neue Schicht mit Partikeln, die sowohl GFP- als auch Cy5-Signal haben, um die Co-Lokalisierung des PML-Körpers auf Telomeren, also APBs, darzustellen.
  2. APB/SUMO-Zahl und -Intensität berechnen
    Subtrahieren Sie den Bildhintergrund nach 7.2. Verbinden Sie die APB/SUMO-Binärschicht mit dem Cy5-Kanal nach 7.3. Berechnen Sie APB/SUMO-Anzahl und -Intensität. Exportieren und Plotten von Daten nach 7.4.

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Ergebnisse

Repräsentative Bilder der telomeren Lokalisation von SUMO, identifiziert durch Telomer-DNA FISH und SUMO-Protein IF, sind in Abbildung 2 dargestellt. Zellen mit SIM-Rekrutierung angereichert SUMO1 und SUMO 2/3 auf Telomeren im Vergleich zu Zellen mit SIM-Mutanten-Rekrutierung. Dies deutet darauf hin, dass die SIM-Dimerisierungs-induzierte SUMO-Anreicherung an Telomeren von SUMO-SIM-Wechselwirkungen abhängt.

Ein repräsentativer Zeitrafferfilm von TRF1 und SIM nach ...

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Diskussion

Dieses Protokoll demonstrierte die Bildung und Auflösung von Kondensaten auf Telomeren mit einem chemischen Dimerisierungssystem. Die Kinetik der Phasentrennung und das durch die Tröpfchenfusion induzierte Telomerclustering werden mit Live-Bildgebung überwacht. Kondensatlokalisierung und -zusammensetzung werden mit DNA FISH und Protein IF bestimmt.

Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Die erste besteht darin, die Protein- und Dimerizerkonzentration zu bestimmen. Der Erfolg bei ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von US National Institutes of Health (1K22CA23763201 bis H.Z., GM118510 bis D.M.C.) und Charles E. Kaufman Foundation bis H.Z. Die Autoren danken Jason Tones für das Korrekturlesen des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin, 0,1 % EDTA in HBSS ohne Calcium-, Magnesium- und NatriumbicarbonatCorningMT25053CI
16 % Formaldehyd (w/v), methanolfreiThermo Scientific28906Bereiten Sie 1 % in 1x PBS
6-Well-Kulturplattevor VWR10861-554
AluminiumfolieFisher Scientific01-213-101
Anti-mCherry-AntikörperAbcamAb183628
Anti-PML-AntikörperSanta Cruzsc966
Anti-SUMO1-AntikörperAbcamAb32058
Anti-SUMO2/3-AntikörperZytoskelettAsm23-Blockierungsreagenz
Roche11096176001
Rinderserumalbumin (BSA)Fisher ScientificBP9706100
BTX Tube micro 1,5ML VWR89511-258
Kreis-DeckgläserThermo Scientific3350
KonfokalmikroskopNikonMQS31000
DAPI FisherScientificD1306
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich472301
DMEM mit L-Glutamin, 4,5 g/l Glukose und NatriumpyruvatCorningMT10017CV
EMCCD-KameraiXon Life 897
EthanolFisher Scientific4355221
fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene RegionenGibcoA4766801
Formamid, deionisiertesMilliporeSigma46-101-00ML
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L), rekombinanter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647InvitrogenA28181
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L), rekombinanter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647InvitrogenA32733
Hochpräzise gerade konische ultrafeine Punktpinzette/PinzetteFisher Scientific12-000-122
Laser-Merge-Modul NikonNIIMHF47180
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzInvitrogen11668027
Figurenplotting-Software, MATLABThe MathWorks
Microscope Slide BoxFisher Scientific34487
NagellackFisher Scientific50-949-071
Bildgebungssoftware, NIS-Elements Nikon
Opti-MEM Reduced Serum MediaGibco51985091
ParafilmBemis13-374-12
PBS 10x, pH 7,4Fisher Scientific70-011-044
, 100XGibco15140122
Piezo Z-Drive Physik Instrumente (PI)91985
PipettenspitzenVWR10017
Glatte und mattierte Mikroskop-Objektträger mit abgeschnittenen EckenFisher Scientific22-037-246
Poly-D-Lysin-LösungSigma-AldrichA-003-E
NatriumazidFisher ScientificBP922I-500
Spinning-ScheibeYokogawaCSU-X1
Quadratische DeckgläserThermo Scientific3305
TBS 10x LösungFisher ScientificBP2471500
TelC-Alexa488PNA BioF1004
TMPSynthetisiert vom Chenoweth-LaborAuf Anfrage
erhältlich TNHSynthetisiert von Chenoweth-LaborAuf Anfrage
Tris LösungFisher Scientific92-901-00ML
Triton X-100 10% LösungMilliporeSigma64-846-350MLPräparat 0,5% in 1x PBS
U2Os ZelllinieAus dem E.V. Makayev Labor (Nanyang Technological University, Singapur)HTB-96
VECTASHIELD Antifade EindeckmediumVector LaboratoriesNC9524612
Penicillin-Streptomycin-Lösungerhältlich

Referenzen

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