Dieses Protokoll veranschaulicht ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem, um Kondensate auf Chromatin zu erzeugen. Die Bildung des Kernkörpers der promyelozytären Leukämie (PML) an Telomeren mit chemischen Dimerisatoren wird nachgewiesen. Tröpfchenwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung werden mit Lebendzellbildgebung, Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) überwacht.
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Methodenartikel
Chemische Dimerisierungsinduzierte Proteinkondensate auf Telomeren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Chromatin-assoziierte Kondensate sind an vielen Kernprozessen beteiligt, aber die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben schwer fassbar. Dieses Protokoll beschreibt ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem zur Herstellung von Kondensaten auf Telomeren. Der chemische Dimerizer besteht aus zwei verknüpften Liganden, die jeweils an ein Protein binden können: Halo-Ligand an Halo-Enzym und Trimethoprim (TMP) an E. coli dihydrofolat-Reduktase (eDHFR). Die Fusion des Halo-Enzyms zu einem Telomerprotein verankert Dimerizer an Telomeren durch kovalente Halo-Liganden-Enzymbindung. Die Bindung von TMP an eDHFR rekrutiert eDHFR-fusionierte Phasen, die Proteine an Telomere trennen und die Kondensatbildung induziert. Da die TMP-eDHFR-Wechselwirkung nicht kovalent ist, kann die Kondensation umgekehrt werden, indem überschüssiges freies TMP verwendet wird, um mit dem Dimerizer um die eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Ein Beispiel für die Induktion der Kernkörperbildung von promyelozytärer Leukämie (PML) auf Telomeren und die Bestimmung von Kondensatwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung wird gezeigt. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Kondensate an anderen genomischen Stellen zu induzieren, indem Halo zu einem Protein verschmiert wird, das direkt an das lokale Chromatin bindet, oder an dCas9, das mit einer Leit-RNA auf den genomischen Locus abzielt. Durch die Zeitauflösung, die für die Einzelzell-Live-Bildgebung erforderlich ist, während die Phasentrennung in einer Zellpopulation für biochemische Assays aufrechterhalten wird, eignet sich diese Methode sowohl für die Untersuchung der Bildung als auch der Funktion von Chromatin-assoziierten Kondensaten.
Einleitung
Viele Proteine und Nukleinsäuren durchlaufen eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) und setzen sich selbst zu biomolekularen Kondensaten zusammen, um die Biochemie in den Zellen1,2zu organisieren. LLPS von Chromatin-bindenden Proteinen führt zur Bildung von Kondensaten, die mit spezifischen genomischen Loci assoziiert sind und an verschiedenen lokalen Chromatinfunktionen beteiligt sind3. Zum Beispiel liegt LLPS des HP1-Proteins der Bildung von Heterochromatindomänen zugrunde, um das Genom zu organisieren4,5, LLPS von Transkr....
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Protokoll
1. Herstellung transienter Zelllinien
- Kultur U2OS Akzeptorzellen auf 22 x 22 mm Glasdeckschichten (für Live-Bildgebung) oder kreisförmigen Decklippen mit 12 mm Durchmesser (für IF oder FISH), die mit Poly-D-Lysin in 6-Well-Platte mit Wachstumsmedium (10% fetales Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung in DMEM) beschichtet sind, bis sie eine Konfluenz von 60-70% erreichen.
- Ersetzen Sie das Wachstumsmedium vor der Transfektion durch ein 1 ml Transfektionsmedium (Wachstumsmedium ohne Penicillin-Streptomycin-Lösung).
- Für jede Transfektionsbohrung 4 μL Transfektionsreagenz zu 150 μL reduzierten Serummedien hinzufügen....
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Ergebnisse
Repräsentative Bilder der telomeren Lokalisation von SUMO, identifiziert durch Telomer-DNA FISH und SUMO-Protein IF, sind in Abbildung 2 dargestellt. Zellen mit SIM-Rekrutierung angereichert SUMO1 und SUMO 2/3 auf Telomeren im Vergleich zu Zellen mit SIM-Mutanten-Rekrutierung. Dies deutet darauf hin, dass die SIM-Dimerisierungs-induzierte SUMO-Anreicherung an Telomeren von SUMO-SIM-Wechselwirkungen abhängt.
Ein repräsentativer Zeitrafferfilm von TRF1 und SIM nach .......
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Diskussion
Dieses Protokoll demonstrierte die Bildung und Auflösung von Kondensaten auf Telomeren mit einem chemischen Dimerisierungssystem. Die Kinetik der Phasentrennung und das durch die Tröpfchenfusion induzierte Telomerclustering werden mit Live-Bildgebung überwacht. Kondensatlokalisierung und -zusammensetzung werden mit DNA FISH und Protein IF bestimmt.
Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Die erste besteht darin, die Protein- und Dimerizerkonzentration zu bestimmen. Der Erfolg bei .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von US National Institutes of Health (1K22CA23763201 bis H.Z., GM118510 bis D.M.C.) und Charles E. Kaufman Foundation bis H.Z. Die Autoren danken Jason Tones für das Korrekturlesen des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin, 0,1 % EDTA in HBSS ohne Calcium-, Magnesium- und Natriumbicarbonat | Corning | MT25053CI | |
| 16 % Formaldehyd (w/v), methanolfrei | Thermo Scientific | 28906 | Bereiten Sie 1 % in 1x PBS |
| 6-Well-Kulturplatte | vor VWR | 10861-554 | |
| Aluminiumfolie | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry-Antikörper | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML-Antikörper | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1-Antikörper | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3-Antikörper | Zytoskelett | Asm23-Blockierungsreagenz | |
| Roche | 11096176001 | ||
| Rinderserumalbumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1,5ML | VWR | 89511-258 | |
| Kreis-Deckgläser | Thermo Scientific | 3350 | |
| Konfokalmikroskop | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI Fisher | Scientific | D1306 | |
| Dimethylsulfoxid | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM mit L-Glutamin, 4,5 g/l Glukose und Natriumpyruvat | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD-Kamera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen | Gibco | A4766801 | |
| Formamid, deionisiertes | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L), rekombinanter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L), rekombinanter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Hochpräzise gerade konische ultrafeine Punktpinzette/Pinzette | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser-Merge-Modul | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz | Invitrogen | 11668027 | |
| Figurenplotting-Software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nagellack | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Bildgebungssoftware, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7,4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| , 100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipettenspitzen | VWR | 10017 | |
| Glatte und mattierte Mikroskop-Objektträger mit abgeschnittenen Ecken | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysin-Lösung | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Natriumazid | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning-Scheibe | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Quadratische Deckgläser | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x Lösung | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthetisiert vom Chenoweth-Labor | Auf Anfrage | |
| erhältlich TNH | Synthetisiert von Chenoweth-Labor | Auf Anfrage | |
| Tris Lösung | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Lösung | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Präparat 0,5% in 1x PBS |
| U2Os Zelllinie | Aus dem E.V. Makayev Labor (Nanyang Technological University, Singapur) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium | Vector Laboratories | NC9524612 |
Referenzen
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
