Summary
Deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için bir porcine korneasının kullanımını açıklıyoruz.
Abstract
Virüsler ve bakteriler kornea enfeksiyonu yoluyla çeşitli oküler yüzey kusurlarına ve yaralar ve ülserler gibi dejenerasyona neden olabilir. Dünya çapında% 60-90 arasında değişen bir seroprevalans ile, Herpes Simpleks Virüs tip-1 (HSV-1) genellikle lezyonlar ve enfeksiyon ilişkili körlük olarak da kendini gösteren orofasiyal bölgenin mukokütanöz lezyonlarına neden olur. Mevcut antiviral ilaçlar etkili olmakla birlikte, toksik yan etkilerin direncinin ortaya çıkması ve kalıcılığı, bu her yerde bulunan patojene karşı yeni antivirallerin geliştirilmesini gerektirir. In vitro değerlendirme, ortaya çıkan bir antiviral ile ilgili bazı fonksiyonel veriler sağlasa da, in vivo oküler dokunun karmaşıklığını göstermez. Bununla birlikte, in vivo çalışmalar pahalıdır ve özellikle viral ajanlarla çalışırken eğitimli personel gerektirir. Bu nedenle ex vivo modelleri antiviral test için verimli ancak ucuz adımlardır. Burada, HSV-1'in porcine kornea ex vivo kullanarak enfeksiyonu incelemek için bir protokol ve mevcut ve yeni antiviral ilaçları kullanarak topikal olarak tedavi etmek için bir yöntem tartışıyoruz. Ayrıca HSV-1 kullanarak bir plak tahlilini gerçekleştirme yöntemini de gösteriyoruz. Ayrıntılı yöntemler, HSV-1 patojenine benzeyen enfeksiyonları incelemek için benzer deneyler yapmak için kullanılabilir.
Introduction
Oküler enfeksiyonlardan muzdarip insanlar genellikle görme kaybına maruz1. Dünya çapında yüksek seroprevalans ile, HSV enfekte bireyler kornea skarlaşmasına, stromal keratit ve neovaskülarizasyona yol açan tekrarlayan göz enfeksiyonlarından muzdariptir2,3,4,5. HSV enfeksiyonlarının da daha az sıklıkta, ensefalit ve sistemik morbidite6,7,8gibi immün sistemik olarak tedavi edilmemiş hastalar arasında bir dizi ciddi duruma neden olduğu gösterilmiştir. Acyclovir (ACV) ve nükleozid analogları gibi ilaçlar HSV-1 enfeksiyonunu frenlemede ve hatta yeniden etkinleştirmeyi kontrol etmede tutarlı bir başarı göstermiştir, ancak bu ilaçların uzun süreli kullanımı böbrek yetmezliği, fetal anormallikler ve gelişen viral suşlara karşı ilaç direncinin ortaya çıkmasını kısıtlamama ile ilişkilidir9,10,11,12,13. HSV-1 oküler enfeksiyonlarla ilişkili karmaşıklıklar, daha önce monolayerler ve insan kornea hücrelerinin 3D kültürleri kullanılarak in vitro ve murine veya tavşan oküler enfeksiyonları kullanılarak in vivo olarak çalışılmıştır. Bu in vitro modeller HSV-1 enfeksiyonlarının hücresel biyolojik bileşenleri hakkında önemli veriler sağlarken, kornea dokusunun karmaşık karmaşıklığını taklit edemezler ve virüsün dendritik yayılımını aydınlatmak için çok az şeyyaparlar 14. Buna karşılık, in vivo sistemler HSV-1 enfeksiyonu sırasında kornealarda enfeksiyon yayılımını ve immün aktivasyon yanıtlarını göstermede daha anlayışlı olsalar da, deneyleri göz ardı etmek için eğitimli araştırmacılara ve hayvan bakımı için büyük tesislere ihtiyaç duydukları uyarısıyla birlikte gelirler.
Burada HSV-1 enfeksiyon kaynaklı yara sistemini incelemek için ek vivo model olarak porcine korneaları kullanıyoruz. Hem bazı ilaçların potansiyel farmakolojisi hem de enfeksiyonun neden olduğu yara sisteminin hücre ve moleküler biyolojisi doku eksplant kültürleri üzerinden incelenebilir. Bu model diğer viral ve bakteriyel enfeksiyonlar için de kullanılabilir. Bu çalışmada, preklinik küçük bir molekül olan BX795'in antiviral etkinliğini test etmek için porsin korneaları kullanılmıştır. Erişim kolaylığı ve maliyet etkinliği nedeniyle porcine kornea kullanımı tercih edildi. Ek olarak, porcine kornea modelleri, korneaların izole edilmesi kolay, enfeksiyon ve görselleştirme için yeterli boyutta ve15'iidare etmek için sağlam olan iyi insan gözleri modelleridir. Porcine korneaları ayrıca hem trans kornea geçirgenliği hem de sistemik emilim15'te insan kornea modellerinin karmaşıklığı ile karşılaştırılabilir. Çalışma için bu modeli kullanarak, BX795'in HSV-1 virüs enfeksiyonunun yetkin bir inhibitörü olarak nasıl daha fazla araştırmaya layık olduğunu ve potansiyel bir küçük moleküllü antiviral bileşik olarak sınıflandırma literatürüne eklediğini ortaya çıkarabildik16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan tüm porcine dokusu üçüncü taraf bir özel kuruluş tarafından sağlanmıştır ve hayvan elleçlemelerinin hiçbiri Chicago'daki Illinois Üniversitesi personeli tarafından yapılmamıştır.
1. Malzemeler
-
Reaktif
- Plak tahlil için aşağıdaki reaktifleri kullanın: toz metilselüloz, Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM), fetal sığır serumu (FBS), penisilin ve plak tahlil için streptomisin (P/S).
- Plak tahlil için kristal mor çözeltisi hazırlamak için kristal mor tabletler ve etanol (moleküler biyoloji sınıfı) kullanın.
-
Vero hücre büyüme ortamı - DMEM tüm medya
- Doku kültürü başlığının içindeki DMEM medya şişesini açın. Serolojik pipet kullanarak şişeden 55 mL medya çıkarın ve atın. DMEM'e 50 mL P/S FBS ekleyin. 4 °C'de soğutun.
-
Plak tahlil medya - %5 metilselüloz medya stoğu
- 2,5 g metilselüloz tozunun 500 mL'lik cam şişenin içinde karıştırma mıknatısı ile ölçün ve otoklavlayın. Şişe oda sıcaklığına soğuduktan sonra, 50 mL FBS ve 5 mL P/S içeren 500 mL DMEM tüm medyayı alın ve metilselüloz içeren cam şişeye ekleyin.
- Manyetik bir karıştırıcı kullanarak 2 gün boyunca 4 °C'de karıştırın. 4 °C'de soğutun.
-
Ekscised porcine kornea için medya hazırlığı
- Doku kültürü başlığının içinde minimum esansiyel ortam (MEM) şişesi açın. Serolojik pipet kullanarak şişeden 10 mL MEM atın.
- Medyaya 5 mL insülin transferin-selenyum (ITS) ve 5 mL antimykotik-antibiyotik (AA) ekleyin ve 4°C'de soğutun.
-
Kristal menekşe ustası ve çalışma stoğu:
- Kristal mor stok çözeltisini yapmak için, suya% 20 etanol 100 mL'ye 1 g kristal mor tozu ekleyin. Bu stok (%1 w/v kristal menekşe) karanlık bir yerde saklandığında bir yıla kadar saklanabilir ve kullanılabilir.
- Bundan bir çalışma stoğu yapmak için, 350 mL suya 50 mL orijinal stok çözeltisi ekleyin. 500 mL çalışan kristal mor çözelti (%0,1 w/v kristal mor) yapmak için bu çözeltiye 100mL etanol ekleyin.
NOT: Bu çözümlerin her ikisinin de karanlıkta saklanması gerekir.
2. Prosedür
- Porcine kornealarının tüm gözlerden izolasyonu17
- Porcine gözlerini uygun bir satıcıdan aldıktan sonra, Şekil 1'debelirtildiği gibi doku işlemede bir gecikme varsa buz üzerinde saklayın.
- Vitreus mizahının dökülmesinden kaynaklanan kazaların yanı sıra kirlenmeyi önlemek için bu işlem sırasında kişisel koruma ekipmanlarının kullanıldığından ve giyildiğinden emin olun.
- Temizlemek ve dezenfekte etmek için çalışma alanını% 70 etanol ile püskürtün. Çalışma alanının sabit olduğundan emin olmak için, Şekil 2'debelirtildiği gibi bir tezgah kapağı ve bantlayın.
- Gazlı bez üzerine gözenekli gözler yerleştirin (Şekil 3). 50 mm gazlı bez kullanarak, tek elleŞekil 4B'degösterildiği gibi gözenekli gözlerin arka bölümünü ( Şekil 4A ) tutun.
- 30 G'lik bir iğne ile, gözün epitel yüzeyinin yaklaşık merkezinde dikkatlice tek bir dürtme yapın ve stromaya zarar olmadığından emin olun (Şekil 5). Dürtme, stromal tutulumu önlemek için epitel (~100-200 μm) ile sınırlanmalıdır.
- Keskin bir sterilize bıçak kullanarak, korneadan 1 mm uzaklıktaki sklera üzerinde küçük bir kesi yapın. Elin hızlı ve pürüzsüz bir döner hareketi kullanarak vitreus mizahının sızmamasını sağlamak için korneanın kenarını kesin (Şekil 6A). Korneayı kornea-sklera kenarında düz bir cımbızla tutarak, bıçağı kullanarak gözün kalan bağlama zarlarını kesin (Şekil 6B).
- Korneayı alın ve 2 mL kornea ortamı ile kaplanmiş 12 kuyulu bir tabağa yerleştirin. Kornea yukarı bakacak şekilde yerlendirilmelidir, Şekil 7A-D, Şekil 8'debir dizi adımda gösterilmelidir.
- Kornea yüzeyindeki enkaz alanına 17 GFP'lik 5 x10 5 plak şekillendirme ünitesi (PFU) içeren 5 μL virüs çözeltisi ekleyin. Enfekte porcine korneaları içeren 12 kuyu plakasını 72 saat boyunca% 5 CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin.
- % 10 çamaşır suyu ile deneyde kullanılmayan ve biyolojik tehlike torbalarında güvenli bir şekilde atılan ek gözleri püskürtün.
- Görsel -leştirme
NOT: Virüs, ilaçların eklenmesinden önce her gün görselleştirilmelidir.- Stereo mikroskobu ve LED ışık kaynağını açın ve korneaları görüntülemeden önce makine lambasının ısınmasını sağlar. Kornea plakasını çözeltiyi bozmadan enstrümana dikkatlice taşıyın. Filtreyi, numunelere bakmak için GFP (380-460 nm) kullanılacak şekilde değiştirin. Görüntü yakalamak için pozlama süresini 500 ms olarak ayarlayın.
- İlk olarak, kornea plakasını stereoskopun altına yerleştirin ve görüntüleri 7,5x'lik en düşük büyütmede yakalayın. Bunu, tüm viral yayılma ve dendrit oluşumunun net bir şekilde görselleştirilmeleri için bir dizi artan büyütme görüntüsüyle (örneğin, 15x, 25x, 35x) takip edin
- Enfekte korneaları doku kültürü inkübatörüne geri verdiğinden ve çekilen tüm görüntüleri kaydettiğinden emin olun.
- Virüs enfeksiyonu nicelemesi
NOT: İlaç tedavisinin etkisini analiz etmek için her gün porcine kornealarından gelen virüs titreleri değerlendirilmelidir.- Virüsü ölçmek için, tohum Vero hücreleri 5 x 105 hücre yoğunluğunda, bu deneyde olduğu gibi 6 kuyulu bir plaka kullanıyorsanız. Bunu enfeksiyondan bir gün önce yap. Plakalı hücreleri bir gecede kuluçkaya yatırarak virüs nicelemesi için birleştiğinden emin olun.
- Birden fazla mikrosantrifüj tüpüne Aliquot 500 μL serumsuz ortam. Serumsuz ortam dolu tüplere batırılmış steril pamuk uçlu çubuk yerleştirin. Pamuklu çubukların kullanımdan önce en az 5 dakika batırılıp ıslatılması gerekir.
- Alttaki medyayı bozmadan, enfekte porcine kornea plakasını bir biyogüvenlik kabinine taşıyın. Islak pamuklu çubukları kullanarak, aşırı basınç uygulamadan enfekte porcine korneanın merkezinden 5 mm çapında saat yönünde 3 devir ve saat yönünün tersine 3 devir yapın.
- Pamuklu çubuğu serumsuz ortam dolu mikrosantrifüj tüpüne geri yerleştirin ve saat yönünde ve saat yönünün tersine 5 kez döndürün. Pamuklu çubuğun metal ucu tamamen mikrosantrifüj tüpüne sığacak şekilde kısa kesilmelidir ve kapak kapatılabilir.
- Sürünmüş pamuk ucunu içeren mikrosantrifüj tüpünü bir girdap makinesine ve girdabına 1 dakika boyunca yüksek hızda yerleştirin.
- Bu numuneler üzerinde bir plak tahlili ile virüs nicelemesi gerçekleştirin.
NOT: Bu niceleme adımının enfeksiyon sonrası 2, 4 ve isteğe bağlı olarak 6 gün sonra gerçekleştirilmesi gerekir.
- Plak tahlili ile virüs nicelemesi
NOT: Bir plak tahlilini gerçekleştirmek için, Vero hücrelerini 6 kuyu plakasına büyütüp tabaklamak ve tahlil başlamadan önce hücrelerin% 90 birleştirilmesini sağlamak. Bu hücrelerin 75 cm2 şişesi bir araya gelen kullanın. Aşağıdaki tüm adımların bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmesi gerekir.- Vero hücrelerinin birleştiği monolayerini, kültür ortamını epire ettikten sonra 10 mL taze fosfat tampon salin (PBS) ile şişede yıkayın. İlk yıkama solüsyon setini arzu ettikten sonra yıkama adımını PBS ile bir kez daha tekrarlayın.
- Hücre monolayerine %0,05 Trypsin'in 1 mL'sini ekleyin. Şişeyi 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çıplak gözle, hücrelerin şişenin iç yüzeyinden ayrıldığından emin olun. Değilse, şişeyi tekrar incelemeden önce 5 dakika daha bekleyin. Hücreler ayrılmış gibi göründüğünde, hücrelerin şişe yüzeyinden tamamen yerinden çıktığından emin olmak için monolayer'a 9 mL tüm ortam ekleyin.
- Tüm hücreleri tüm medya ile birlikte şişeden toplayın ve 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Plak tahlil için kullanılan 6 kuyu plakasının her kuyusu için santrifüj tüpünden 300 μL kullanın. 6 kuyu plakasının her bir kuyusunun her bir kuyusunun her bir kuyusunun 2 mL tamamının üzerine yerleştirin. Plakaları bir gecede inkübatörde bırakın, böylece her kuyuda bir eşken olur.
- Bir plak tahlilini gerçekleştirmek için, virüsün ölçülmesi öncesinde numunelerin seri seyreltilmesinin yapılması gerekir.
- 10-8'likbir seyreltme ulaşana kadar serumsuz ortam kullanarak mikro santrifüj tüplerinde virüsün 101 kat seyreltilmesini gerçekleştirin. 10-3 seyreltmede, 6 kuyu plakasından hücreler üzerindeki büyüme medyasını epire ettikten sonra seyreltmenin 1 mL'lik kısmını plakalı hücrelerin monolayerine aktarın, bu enfeksiyon adımı olacaktır. Enfekte plakayı 2 saat boyunca 37 °C inkübatörde kuluçkaya yatırın.
- Mevcut enfeksiyon medyasını aspire edin, hücreleri kaplamak için PBS ile iki kez nazikçe yıkayın ve 6 kuyuya da kuyu başına 2 mL metilselüloz yüklü ortam ekleyin. 72 saat boyunca veya plak oluşumu görülene kadar kuluçkaya yatırın. Plaklar hücre monolayerinde hücreler arasında küçük boşluklar oluşumu ile tanımlanabilir.
- Duvarı kılavuz uç olarak kullanarak her kuyunun köşesine yavaşça 1 mL metanol ekleyin. 6 kuyu plakasını oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre monolayerini rahatsız etmeden veya karıştırmadan her kuyunun içeriğini plakadan yavaşça emiş.
- Tüm hücrelerin kapsanmasını sağlamak için 6 kuyu plakasının her kuyusuna 1 mL kristal mor çalışma çözeltisi ekleyin. 6 kuyu plakasını 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın. Kristal mor çözeltiyi aspire ederek atın ve kuyuları emici bir kağıt tabakası üzerinde kurutun.
- Başlangıç çözeltisinde toplam virüs içeriğini ölçmek için plak sayısını en yüksek seyreltme kuyusunda sayın. Viral titreyi doğrulamak için işlemi iki kez tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel antivirallerin etkinliğini anlamak için, in vivo insan klinik deneyleri için gönderilmeden önce kapsamlı bir şekilde test edilmesi gerekir. Bu bakımdan pozitif kontrol, negatif kontrol ve test gruplarının belirlenmesi gerekiyor. Trifluorothymidine (TFT) uzun zamandır herpes keratitini topikal olarak tedavi etmek için tercih edilen tedavi olarak16. Pozitif kontrol olarak kullanılan TFT tedavi edilen kornea grupları daha düşük enfeksiyon yayılımı gösterir. Negatif kontrol olarak PBS'de çözünmüş DMSO veya araç kontrolü kullandık. BX795, deneysel preklinik ilaç test grubuydu. Her gruba toplam 4 kornea atanmış ve ilaçlar her gün 3 kez porcine kornealarına eklenmiştir. Stereoskopik floresan görüntülemeyi kullanan sonuçlarımız, BX795'in antiviral etkinliğinin viral yayılmayı kontrol etmede TFT'ye benzer olduğunu göstermektedir. Çalışmalarımızdaki viral yayılım stereoskoptaki yeşil floresan kanalının görüntülenmesi ile görselleştirilebiliyor. Aracın sadece negatif kontrol grubu kornealarını tedavi ettiğini gözlemledik, virüsün merkezi enfeksiyon bölgesinden çevresine ilk viral aşılamadan 6 gün sonra yayıldığını, her iki ilacın da (BX795 ve TFT) enfeksiyonu 4 - 6. günde temizlediğini gözlemledik (Şekil 9A). Benzer şekilde, enfeksiyon sonrası 2 ve 4. günlerde alınan oküler sürüntüler pozitif kontrolde ve BX795 tedavi edilen örneklerde tam bir virüs inhibisyonu gösterirken, negatif kontrol grubunda enfeksiyöz virüs titresinde keskin bir artış gözlenir (Şekil 9B).
Şekil 1: Doku işlenene kadar gözenekli gözler buzda tutulur. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Çalışma tezgahı kurulumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Gazlı bez üzerine yerleştirilen porcine gözler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 30G iğne resimli porcine göz. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 30 G iğne kullanıldı; epitel yüzeyin ortasına delik açılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Keskin sterilize bıçak (A,B) kullanarak kornea kenarını kesmek için kullanılan döner eylem, bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Kornea görüntüleri. (A,B) Kornea sonunda keskin makas kullanılarak kesilir (C) İzole kornea cımbızla tutulur (D) Tamamen izole kornea, kullanıma hazır Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: 12 kuyulu tabağa yerleştirilen ve 72 saat kuluçkaya yatırılan kornealar.
Şekil 9: Enfeksiyon seyri sırasında alınan viral yayılmanın ilerlemesi. Taze ekscislenmiş porcine korneaları HSV-1 17-GFP ve (A) enfeksiyon sonrası 2, 4 ve 6 günlerinde mikroskop kullanılarak görüntülendi. DMSO, TFT veya BX795 ile topikal tedaviye enfeksiyon sonrası 2. (B) Vero Cells üzerindeki porcine kornealarından alınan sürüntüler kullanılarak plak tahlilleri yapıldı. Tedavi grupları arasındaki önemli farklılıkları anlamak için iki yönlü ANOVA testi yapıldı. n=4, ****p=0,0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki araştırmalar BX795'in HSV-1 enfeksiyonuna karşı antiviral ajan olarak umut verici bir role sahip olduğunu göstermiştir; TANK bağlayıcı kinaz 1 (TBK1)16'yıinhibe ederek. Hem TBK1 hem de otofaji, insan kornea epitel hücrelerinde gösterildiği gibi HSV-1 enfeksiyonunu inhibe etmeye yardımcı olmuştur. BX795'in 10μM konsantrasyonda antiviral aktivite ile maksimum derecede etkili olduğu ve hem batı leke analizi hem de anahtar viral proteinlerin viral plak analizi kullanılarak, BX795'in TFT16aktivitesiyle karşılaştırılabilir HSV-1 enfeksiyonunu inhibe etmesi gösterilmiştir. Porcine korneaları üzerinde yapılan çalışma aynı analizi izledi ve yukarıda gösterildiği gibi benzer sonuçlar elde etti; BX795'in enfeksiyonu inhibe etmede TFT kadar etkili olduğu gösterilmiştir - enfeksiyonun 4 ve 6. gününde porcine kornealarının çekilen görüntüleri hem TFT hem de BX795'te karşılaştırılabilir sonuçlar göstermektedir. Salgılanan virionları ölçmek için yapılan plak tahlilleri de bu bulguları güçlendirir16. BX795 ayrıca in vitro antiviral etkilere sahip olduğunu göstermiştir ve in vivo fare modellerinde topikal kullanımı da kornea HSV-1 enfeksiyonunun baskılanması göstermiştir16.
Çalışma, BX795'in HSV-1 enfeksiyonuna karşı geniş spektrumlu antiviral uygulama için etkili ve lider bir bileşik olarak kurulmasına katkıda bulunmaktadır. BX795, porcine modellerindeki etkinliğini TFT ile karşılaştırılabilir olarak göstererek, birden fazla enfeksiyon modelinde başarılı olmaya devam ediyor16. Ek olarak, BX795, yaygın olarak kullanılan başka bir ilaç Acyclovir (ACV)16'yadirençli olan HSV-1 (KOS)tk12 bile birden fazla virüs suşunda etkili olduğu gösterildiği için önemlidir. BX975 tedavi edilen hücreler, HSV-1 virüsünün inhibisyon etkinliğini onaylayan HSV-1 viral protein gB'nin çok az ekspresyonunu göstermektedir. BX795 ayrıca diğer tedavilere ve anti-herpesvirüs tedavilerine kıyasla daha düşük dozlarda daha iyi anti-viral etkinlik göstermektedir. Ayrıca, BX795 terapötik konsantrasyonları (hatta önerilen 10 μM konsantrasyon) hücrelere karşı olumsuz sitotoksiklik göstermez - apoptoz indüklenmesi ve hücre ölümü yoktur, bu da yine TFT kontrolü ile karşılaştırılabilir16.
Protokol bölümündeki kritik adımlar arasında gözenekli korneanın tüm gözden izole edilmesi yer almaktadır. Bu, gözün merkezindeki korneanın bir iğne kullanılarak debridmanını içerir ve iris rahatsız etmeden korneayı oküler yüzeyden nazikçe çıkararak stromal tutulum sağlamak için çok az kuvvet gerektirir. Bir diğer kritik adım seti, pamuk uçlarını önceden ıslatma ve kornea yüzeyini temizlemeyi içeren parçaları içerir. Kornea epitelinin oküler yüzeyden yerinden çıkmadığından emin olmak için hareket nazik olmalıdır.
Epitel debridman adımında değişiklik yapılabilir. Deneyci, korneanın merkezinde tek bir dürtme yapmak için 30 G'lik bir iğne kullanmak yerine, kornea epiteline ızgara şeklinde çizikler yapmak için steril bir bıçak veya 30 G iğne kullanabilir. Bu epitel için sağlam enfeksiyon sağlar.
Porcine korneaları aynı tedarik gününde kullanılmalı ve 24 saatten uzun süre tutulmamalıdır. 4 saatten uzun süre buzda tutulan porcine korneaları, irisin korneaya yapışmasıyla sonuçlanacaktır. Bu, eksizyon sırasında korneayı gözün geri kalanından ayırmayı zorlaştırır. Tüm porcine korneaları aynı şekilde enfekte olmaz. Deneyci grup başına en az 5 göz enfekte etmeli ve daha sonra deneye devam etmek için enfeksiyon sonrası 2. günde eşit derecede enfekte korneaları seçmelidir.
Mevcut tekniğin önemi, insan korneaları üzerinde porcine kullanmanın maliyet etkinliğini içerir. Teknik, insan kornealarına kıyasla kullanılan korneaların göreceli tazeliği nedeniyle de önemlidir.
Mevcut tekniğin gelecekteki uygulamaları arasında ilaç geçirgenlik çalışmaları, ex vivo farmakokinetik ve farmakodinamik çalışmaların testinde kullanımı yer almaktadır ancak bunlarla sınırlı değildir. Porcine korneaları, antiviral ilaçlara ek olarak antibakteriyel ve antifungal ilaçları test etmek için de kullanılabilir. Kornealar, diyabetik yaraları incelemek için ex vivo yara iyileştirme tahlilleri için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması ve rakip finansal çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibeleri (R01 EY024710, RO1 AI139768 ve RO1 EY029426) tarafından D.S. A.A.'ya verilen F30EY025981 hibesi ile desteklendi. Çalışma, Park Ambalaj şirketi, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609'dan elde edilen porcine korneaları kullanılarak gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | - | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | Special order by request | |
| Procedure bench covers - as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
