Porcine Hornhautgewebe Explant, um die Wirksamkeit von Herpes Simplex Virus-1 Antiviralen zu untersuchen

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Verwendung einer Schweinehornhaut, um die antivirale Wirksamkeit experimenteller Medikamente zu testen.

Zusammenfassung

Viren und Bakterien können eine Vielzahl von Augenoberflächendefekten und Degenerationen wie Wunden und Geschwüre durch Hornhautinfektionen verursachen. Mit einer Seroprävalenz, die weltweit zwischen 60 und 90% liegt, verursacht das Herpes-Simplex-Virus Typ-1 (HSV-1) häufig mukokutane Läsionen der orofazialen Region, die sich auch als Läsionen und infektionsbedingte Blindheit manifestieren. Während aktuelle antivirale Medikamente wirksam sind, erfordert das Auftreten von Resistenzen und die Persistenz toxischer Nebenwirkungen die Entwicklung neuartiger antiviraler Medikamente gegen diesen allgegenwärtigen Erreger. Obwohl die In-vitro-Bewertung einige funktionelle Daten zu einem aufkommenden antiviralen Mittel liefert, zeigen sie nicht die Komplexität des Augengewebes in vivo. In-vivo-Studien sind jedoch teuer und erfordern geschultes Personal, insbesondere bei der Arbeit mit viralen Wirkstoffen. Daher sind Ex-vivo-Modelle effiziente und dennoch kostengünstige Schritte für antivirale Tests. Hier diskutieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Infektion mit HSV-1 unter Verwendung von Schweinehornhäuten ex vivo und eine Methode, um sie topisch mit bestehenden und neuartigen antiviralen Medikamenten zu behandeln. Wir demonstrieren auch die Methode zur Durchführung eines Plaque-Assays mit HSV-1. Die detaillierten Methoden können verwendet werden, um ähnliche Experimente durchzuführen, um Infektionen zu untersuchen, die dem HSV-1-Erreger ähneln.

Einleitung

Menschen, die an Augeninfektionen leiden, erleiden häufig Sehverlust¹. Mit einer weltweit hohen Seroprävalenz leiden HSV-infizierte Personen an wiederkehrenden Augeninfektionen, die zu Hornhautvernarbungen, Stromakeratitis und Neovaskularisation führen^2,3,4,5. HSV-Infektionen haben auch gezeigt, dass sie weniger häufig eine Reihe von schweren Erkrankungen bei immungeschwächten, unbehandelten Patienten wie Enzephalitis und systemische Morbidität verursachen^6,7,8. Medikamente wie Aciclovir (ACV) und seine Nukleosidanaloga haben einen konsistenten Erfolg bei der Eindämmung der HSV-1-Infektion und sogar der Kontrolle der Reaktivierung gezeigt, aber der längere Gebrauch dieser Medikamente ist mit Nierenversagen, fetalen Anomalien und dem Versagen verbunden, die Entstehung von Arzneimittelresistenzen gegen sich entwickelnde Virusstämme einzuschränken^{9,10,11,12,13}. Komplexitäten im Zusammenhang mit HSV-1-Augeninfektionen wurden zuvor in vitro mit Monoschichten und 3D-Kulturen menschlicher Hornhautzellen und in vivo mit murinen oder Kaninchen-Augeninfektionen untersucht. Während diese In-vitro-Modelle signifikante Daten über die zellbiologischen Komponenten von HSV-1-Infektionen liefern, können sie jedoch die komplizierte Komplexität des Hornhautgewebes nicht nachahmen und tun wenig, um die dendritische Ausbreitung des Virus zu^{beleuchten 14}. Im Gegensatz dazu, obwohl In-vivo-Systeme aufschlussreicher sind, um die Ausbreitung von Infektionen in Hornhäuten und Immunaktivierungsreaktionen während der HSV-1-Infektion zu zeigen, haben sie den Vorbehalt, dass sie geschulte Ermittler und große Einrichtungen für die Tierpflege benötigen, um die Experimente zu übersehen.

Hier verwenden wir Schweinehornhäute als Ex-vivo-Modell, um das HSV-1-infektionsinduzierte Wundsystem zu untersuchen. Sowohl die potenzielle Pharmakologie bestimmter Medikamente als auch die Zell- und Molekularbiologie des durch die Infektion verursachten Wundsystems können durch Gewebeentsteigungskulturen untersucht werden. Dieses Modell kann auch für die Verwendung bei anderen viralen und bakteriellen Infektionen geändert werden. In dieser Studie wurden Schweinehornhäute verwendet, um die antivirale Wirksamkeit eines präklinischen kleinen Moleküls, BX795, zu testen. Die Verwendung von Schweinehornhäuten wurde aufgrund des einfachen Zugangs und der Kosteneffizienz bevorzugt. Darüber hinaus sind Schweinehornhautmodelle gute Modelle der menschlichen Augen, wobei die Hornhäute leicht zu isolieren sind, ausreichend für Infektionen und Visualisierungen dimensioniert und robust sind, um¹⁵zu handhaben. Schweinehornhäute sind auch vergleichbar mit der Komplexität menschlicher Hornhautmodelle sowohl in der transkornealen Permeabilität als auch in der systemischen Absorption¹⁵. Durch die Verwendung dieses Modells für die Studie konnten wir aufklären, wie BX795 als kompetenter Inhibitor der HSV-1-Virusinfektion einer weiteren Untersuchung würdig ist und die Literatur zur Klassifizierung als potenzielle niedermolekulare antivirale Verbindung^{ergänzt 16}.

Protokoll

Das gesamte in dieser Studie verwendete Schweinegewebe wurde von einer privaten Drittorganisation zur Verfügung gestellt, und keiner der Tierhandhabung wurde von Mitarbeitern der University of Illinois in Chicago durchgeführt.

1. Materialien

1. Reagenzien
   1. Verwenden Sie folgende Reagenzien für den Plaque-Assay: Pulvermethylcellulose, Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM), fetales Rinderserum (FBS), Penicillin und Streptomycin (P / S) für den Plaque-Assay.
   2. Verwenden Sie kristallviolette Tabletten und Ethanol (molekularbiologische Qualität) zur Herstellung von Kristallviolettlösung für den Plaque-Assay.
2. Vero Zellwachstumsmedien - DMEM ganze Medien
   1. Öffnen Sie die DMEM-Medienflasche in der Gewebekulturhaube. 55 ml Medium mit einer serologischen Pipette aus der Flasche entnehmen und entsorgen. Fügen Sie 50 ml FBS P / S zu DMEM hinzu. Bei 4 °C kühlen.
3. Plaque-Assay-Medien - Bestand an 5% Methylcellulose-Medien
   1. Messen Sie 2,5 g Methylcellulosepulver mit einem Rührmagneten in einer 500 ml Glasflasche und autoklavieren Sie sie. Nachdem die Flasche auf Raumtemperatur abgekühlt ist, nehmen Sie 500 ml DMEM-Ganzes mit 50 ml FBS und 5 ml P / S und geben Sie es in eine Glasflasche mit Methylcellulose.
   2. Diesen bei 4 °C 2 Tage lang mit einem Magnetrührer umrühren. Bei 4 °C kühlen.
4. Medienvorbereitung für herausgeschnittene Schweinehornhaut
   1. Öffnen Sie eine MEM-Flasche (Minimum Essential Media) in der Gewebekulturhaube. Entsorgen Sie 10 ml MEM aus der Flasche mit einer serologischen Pipette.
   2. 5 ml Insulin-Transferrin-Selen (ITS) und 5 ml Antimykotika-Antibiotikum (AA) in das Medium geben und bei 4 °C kühlen.
5. Master und Arbeitsmaterial von Kristallviolett:
   1. Um die kristallviolette Stammlösung herzustellen, fügen Sie 1 g kristallviolettes Pulver zu 100 ml 20% Ethanol in Wasser hinzu. Diese Brühe (1% w/v Kristallviolett) kann bis zu einem Jahr gelagert und verwendet werden, wenn sie an einem dunklen Ort gelagert wird.
   2. Um daraus einen Arbeitsstock herzustellen, fügen Sie 50 ml Original-Stammlösung zu 350 ml Wasser hinzu. Fügen Sie dieser Lösung 100 ml Ethanol hinzu, um eine 500 ml arbeitskristalline Lösung (0,1% w / v Kristallviolett) herzustellen.
      HINWEIS: Beide Lösungen müssen im Dunkeln gelagert werden.

2. Verfahren

1. Isolierung der Schweinehornhäute von ganzen Augen¹⁷
   1. Nachdem Sie die Schweineaugen von einem geeigneten Anbieter erhalten haben, lagern Sie sie auf Eis, wenn es zu einer Verzögerung bei der Gewebeverarbeitung kommt, wie in Abbildung 1 dargestellt.
   2. Stellen Sie sicher, dass während dieses Verfahrens persönliche Schutzausrüstung verwendet und getragen wird, um Kontaminationen sowie Unfälle durch verschütteten Glaskörper zu vermeiden.
   3. Besprühen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol, um ihn zu reinigen und zu desinfizieren. Um sicherzustellen, dass der Arbeitsbereich stabil ist, verteilen Sie eine Tischabdeckung und kleben Sie die Seiten sicher ab, wie in Abbildung 2 dargestellt.
   4. Legen Sie die Augen von Schweinen auf Gaze (Abbildung 3). Halten Sie mit 50-mm-Gaze den hinteren Abschnitt (Abbildung 4A) der Schweineaugen wie in Abbildung 4B gezeigt mit einer Hand.
   5. Mit einer 30 G Nadel vorsichtig einen einzelnen Stoß in etwa der Mitte der Epitheloberfläche des Auges vorsichtig machen und sicherstellen, dass keine Schädigung des Stromas vorliegt (Abbildung 5). Der Stoß sollte auf das Epithel (~ 100-200 μm) beschränkt sein, um eine Stromabeteiligung zu vermeiden.
   6. Machen Sie mit einer scharfen sterilisierten Klinge einen kleinen Schnitt an der Sklera in 1 mm Abstand von der Hornhaut. Schneiden Sie den Rand der Hornhaut ab, um sicherzustellen, dass der Glaskörper nicht durch eine schnelle und sanfte Drehbewegung der Hand austritt (Abbildung 6A). Indem Sie die Hornhaut mit einer flachen Pinzette am Hornhaut-Sklera-Rand halten, schneiden Sie die verbleibenden Bindemembranen des Auges mit der Klinge ab (Abbildung 6B).
   7. Nehmen Sie die Hornhaut und legen Sie sie in eine 12-Well-Platte, die mit 2 ml Hornhautmedium überlagert ist. Die Hornhaut sollte nach oben gerichtet werden, wie in einer Reihe von Schritten in den Abbildungen 7A-D, Abbildung 8) gezeigt wird.
   8. 5 μL der Viruslösung, die 5 x 10⁵ Plaquebildungseinheiten (PFU) von 17 GFP enthält, werden an die debrided Stelle auf der Hornhautoberfläche geben. Legen Sie die 12-Well-Platte mit infizierten Schweinehornhäuten für 72 h in einen Inkubator mit_5% CO 2.
   9. Sprühen Sie alle zusätzlichen Augen, die nicht im Experiment verwendet wurden, mit 10% Bleichmittel und entsorgen Sie sie sicher in Biogefahrenbeuteln.
2. Visualisierung
   HINWEIS: Das Virus sollte jeden Tag vor der Zugabe von Medikamenten visualisiert werden.
   1. Schalten Sie das Stereomikroskop und die LED-Lichtquelle ein und lassen Sie die Lampe der Maschine aufwärmen, bevor Sie die Hornhaut abbilden. Tragen Sie die Hornhautplatte vorsichtig zum Instrument, ohne die Lösung zu stören. Ändern Sie den Filter so, dass GFP (380-460 nm) zum Betrachten von Proben verwendet wird. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 500 ms ein, um Bilder aufzunehmen.
   2. Legen Sie zunächst die Hornhautplatte unter das Stereoskop und nehmen Sie die Bilder mit der niedrigsten Vergrößerung von 7,5x auf. Anschließend folgt eine Reihe von Bildern mit zunehmender Vergrößerung (z. B. 15x, 25x, 35x), so dass die gesamte Virusausbreitung und Dendritenbildung klar visualisiert wird
   3. Stellen Sie sicher, dass die infizierten Hornhäute wieder in den Gewebekulturinkubator zurückgeführt werden und speichern Sie alle aufgenommenen Bilder.
3. Quantifizierung der Virusinfektion
   HINWEIS: Virustiter aus Schweinehornhäuten sollten jeden Tag ausgewertet werden, um die Wirkung der medikamentösen Behandlung zu analysieren.
   1. Um das Virus zu quantifizieren, säen Sie Vero-Zellen mit einer Dichte von 5 x^{10 5} Zellen pro Vertiefung, wenn Sie eine 6-Well-Platte verwenden, wie in diesem Experiment. Tun Sie dies einen Tag vor der Infektion. Inkubieren Sie die plattierten Zellen über Nacht, um sicherzustellen, dass sie für die Virusquantifizierung konfluent sind.
   2. Aliquot 500 μL serumfreie Medien in mehrere Mikrozentrifugenröhrchen. Setzen Sie sterilen Wattestupfer ein, der in die mit serumfreien Medien gefüllten Röhrchen getaucht ist. Die Wattestäbchen müssen vor dem Gebrauch mindestens 5 Minuten lang getaucht und benetzt werden.
   3. Ohne die darunter liegenden Medien zu stören, transportieren Sie die infizierte Hornhautplatte in eine Biosicherheitswerkbank. Machen Sie mit den nassen Wattestäbchen 3 Umdrehungen im Uhrzeigersinn und 3 Umdrehungen gegen den Uhrzeigersinn bei einem Durchmesser von 5 mm von der Mitte der infizierten Schweinehornhaut, ohne übermäßigen Druck auszuüben.
   4. Führen Sie den Wattestäbchen wieder in das serumfreie mediengefüllte Mikrozentrifugenröhrchen ein und drehen Sie es 5 Mal im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn. Die Metallspitze des Wattestäbchens sollte kurz geschnitten werden, damit sie vollständig in das Mikrozentrifugenrohr passt und der Deckel geschlossen werden kann.
   5. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit der abgetupferten Baumwollspitze auf eine Wirbelmaschine und wirbeln Sie mit hoher Geschwindigkeit für 1 minute.
   6. Führen Sie die Virusquantifizierung über einen Plaque-Assay an diesen Proben durch.
      HINWEIS: Dieser Quantifizierungsschritt muss an den Tagen 2, 4 und optional an 6 Tagen nach der Infektion durchgeführt werden.
4. Virusquantifizierung durch Plaque-Assay
   HINWEIS: Um einen Plaque-Assay durchzuführen, wachsen und platten Vero-Zellen zu einer 6-Well-Platte und stellen Sie sicher, dass die Zellen vor Beginn des Assays zu 90% zusammenfließen. Verwenden Sie einen konfluenten 75 cm^{2 Kolben} dieser Zellen. Alle folgenden Schritte müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.
   1. Waschen Sie die konfluente Monoschicht der Vero-Zellen im Kolben mit 10 ml frischer Phosphatpuffersalzlösung (PBS) nach dem Absaugen des Kulturmediums. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal mit PBS, nachdem Sie den ersten Satz Waschlösung angesaugt haben.
   2. Fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin zur Zellmonoschicht hinzu. Den Kolben 5 min bei 37 °C inkubieren. Stellen Sie mit bloßem Auge sicher, dass sich die Zellen von der Innenfläche des Kolbens lösen. Wenn nicht, warten Sie weitere 5 Minuten, bevor Sie den Kolben erneut untersuchen. Wenn sich Zellen abzulösen scheinen, fügen Sie 9 ml des gesamten Mediums in die Monoschicht ein, um sicherzustellen, dass sich die Zellen vollständig von der Kolbenoberfläche lösen.
   3. Sammeln Sie alle Zellen aus dem Kolben zusammen mit dem gesamten Medium und legen Sie sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
   4. Verwenden Sie für jede Vertiefung der 6 Bohrplatten, die für den Plaque-Assay verwendet werden, 300 μL aus dem Zentrifugenröhrchen. Beladen Sie jede Vertiefung der 6-Brunnenplatte mit 2 ml ganzen Medien auf. Lassen Sie die Platten über Nacht im Inkubator, damit sie wachsen und in jedem Brunnen eine konfluente Monoschicht bilden können.
   5. Um einen Plaque-Assay durchzuführen, muss vor der Quantifizierung des Virus eine serielle Verdünnung der Proben durchgeführt werden.
   6. Führen Sie eine log₁₀1-fache Verdünnung des Virus in Mikrozentrifugenröhrchen mit serumfreien Medien durch, bis eine Verdünnung von 10^-8 erreicht ist. Wenn bei einer Verdünnung von^{10 -3} 1 ml der Verdünnung auf die Monoschicht der plattierten Zellen übertragen wird, nachdem das Wachstumsmedium von der 6-Well-Platte auf die Zellen abgesaugt wurde, ist dies der Infektionsschritt. Inkubieren Sie die infizierte Platte bei 37 °C Inkubator für 2 h.
   7. Saugen Sie die vorhandenen Infektionsmedien ab, waschen Sie sie zweimal vorsichtig mit PBS, um die Zellen zu beschichten, und fügen Sie allen 6 Vertiefungen 2 ml methylcellulosehaltige Medien pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie für 72 h oder bis die Bildung von Plaques zu sehen ist. Plaques können durch die Bildung kleiner Lücken zwischen den Zellen in der Zellmonoschicht identifiziert werden.
   8. Fügen Sie 1 ml Methanol langsam in die Ecke jedes Brunnens hinzu und verwenden Sie die Wand als Führungsspitze. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte bei Raumtemperatur für 15 min. Saugen Sie den Inhalt jedes Brunnens langsam von der Platte ab, ohne die Zellmonoschicht zu stören oder zu rühren.
   9. Fügen Sie 1 ml kristallviolette Arbeitslösung zu jeder Vertiefung von 6 Well-Platten hinzu, um sicherzustellen, dass alle Zellen bedeckt sind. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte 30 Minuten lang im Dunkeln. Entsorgen Sie die kristallviolette Lösung, indem Sie sie ansaugen und trocknen Sie die Vertiefungen auf einem Blatt saugfähigem Papier.
   10. Zählen Sie die Anzahl der Plaques in der höchsten Verdünnungsbohrung, um den Gesamtvirusgehalt in der Startlösung zu quantifizieren. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal, um den viralen Titer zu bestätigen.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit der experimentellen antiviralen Medikamente zu verstehen, müssen sie ausgiebig getestet werden, bevor sie für klinische In-vivo-Studien am Menschen geschickt werden. In diesem Zusammenhang müssen Positivkontroll-, Negativkontroll- und Testgruppen identifiziert werden. Trifluorthymidin (TFT) wird seit langem als bevorzugte Behandlung zur topischen Behandlung von Herpeskeratitis^{eingesetzt 16}. Als Positivkontrolle eingesetzt, zeigen die mit TFT behandelten Hornhautgruppen eine geri...

Diskussion

Frühere Forschungen haben gezeigt, dass BX795 eine vielversprechende Rolle als antivirales Mittel gegen HSV-1-Infektionen spielt. durch Hemmung der TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1)¹⁶. Sowohl TBK1 als auch Autophagie haben eine Rolle bei der Hemmung der HSV-1-Infektion gespielt, wie sie an menschlichen Hornhautepithelzellen gezeigt wurde. BX795 erwies sich als maximal wirksam bei antiviraler Aktivität in einer Konzentration von 10μM und sowohl unter Verwendung der Western-Blot-Analyse als auch der vi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
30 G Injektionsnadeln.	BD	305128
500 mL Glasflasche.	Thomas Scientific	844027
Antimykotikum und Antibiotikum (AA)	GIBCO	15240096	Aliquot in 5-ml-Röhrchen geben und bis zur Verwendung eingefroren aufbewahren
Benchtop-Vortexer.	BioDot	BDVM-3200
Biosicherheitswerkbank mit Bio-Safety Level-2 (BSL-2) Zertifizierung.	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" sterile Calciumalginat-Standardtupfer.	Puritan	22029501
Zellschaber - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
Kristallviolett	Sigma Aldrich	C6158	Bewahren Sie das Pulver an einem dunklen Ort auf
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium - DMEM	GIBCO	41966029	Lagern bei 4 > C bis zur Verwendung
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Fötales Rinderserum -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Aliquot in 50-ml-Röhrchen und bis zur Verwendung eingefroren aufbewahren
Pinzette mit flachen Kanten – 2.Harward	Instruments	72-8595
Gefrierschränke --80 °C. -	Thermofisher Scientific	13 100 790
Frische Schachtel mit Klingen.	Thomas Scientific	TE05091
Guaze	Johnson & Johnson		108 Quadratzoll Mappe 12-lagig
HSV-1 17GFP	gezüchtet im Haus	-	Original-Stamm von Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP exprimiert HSV-1 Stamm 17
Insulin, Transferrin, Selen - ITS	GIBCO	41400045	Aliquot in 5 mL Röhrchen und bis zur Verwendung eingefroren
Magnetrührer.	Thomas Scientific	H3710-HS
Metallische Schere.	Harward Instruments	72-8400
Mikropipetten 1 bis 1000 & micro;L.	Thomas Scientific	1159M37
Minimum Essential Medium - MEM	GIBCO	11095080	Bei 4 & Grad lagern; C bis zur Verwendung
OptiMEM	GIBCO	31985047	Store at 4° C bis zur Anwendung
von Penicillin/Streptomycin.	GIBCO	15140148	Aliquot in 5-ml-Röhrchen geben und bis zur Verwendung eingefroren aufbewahren
Phosphatpuffer Kochsalzlösung -PBS	GIBCO 10010072		Bei Raumtemperatur lagern
Schweinehornhaut	Park Packaging Co., Chicago, IL		Sonderbestellung auf Anfrage
Verfahren Bankabdeckungen - nach Bedarf.	Thermofisher Scientific	S42400
Serologische Pipetten	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serologische Pipettiergeräte.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
Stereoskop	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Rührmagnet.	Thomas Scientific	F37120
Gewebekulturflaschen, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Gewebekultur-Inkubatoren, die 5 % CO2 und 37 & deg halten können; C-Temperatur.	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Mit Gewebekulturen behandelte Platten (6 Wells).	Thomas Scientific	T1006
Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot	GIBCO	25-300-062	Aliquot in 10-ml-Röhrchen und bis zur Verwendung eingefroren aufbewahren
Vero-Zellen	Type Culture Collection ATCC	CRL-1586

American