Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines schnellen Gitterherstellungsgeräts sowohl für die schnelle Gitterherstellung als auch für das schnelle Mischen und Einfrieren, um zeitaufgelöste Experimente durchzuführen.

Zusammenfassung

Das Gebiet der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) entwickelt sich rasant mit neuer Hardware und Verarbeitungsalgorithmen, die Strukturen mit höherer Auflösung und Informationen über anspruchsvollere Systeme erzeugen. Die Probenvorbereitung für Kryo-EM erlebt eine ähnliche Revolution, wobei neue Ansätze entwickelt werden, um die traditionellen Blotting-Systeme zu ersetzen. Dazu gehören der Einsatz von piezoelektrischen Spendern, Pin-Druck und Direktspritzen. Als Ergebnis dieser Entwicklungen steigt die Geschwindigkeit der Netzvorbereitung von Sekunden auf Millisekunden, was neue Möglichkeiten bietet, insbesondere im Bereich der zeitaufgelösten Kryo-EM, wo Proteine und Substrate schnell gemischt werden können, bevor sie einfrieren und kurzlebige Zwischenzustände einfangen. Hier beschreiben wir im Detail ein Standardprotokoll zur Erstellung von Gittern auf unserem hauseigenen zeitaufgelösten EM-Gerät sowohl für die standardmäßige schnelle Netzvorbereitung als auch für zeitaufgelöste Experimente. Das Protokoll erfordert mindestens etwa 50 μL Proben in Konzentrationen von ≥ 2 mg/ ml für die Herstellung von 4 Gittern. Die Verzögerung zwischen Probenanwendung und Einfrieren kann bis zu 10 ms beträgen. Eine Einschränkung ist die erhöhte Eisdicke bei höheren Geschwindigkeiten und im Vergleich zur Blotting-Methode. Wir hoffen, dass dieses Protokoll anderen helfen wird, ihre eigenen Grid-Making-Geräte zu entwerfen und diejenigen, die an der Entwicklung zeitaufgelöster Experimente interessiert sind.

Einleitung

Hintergrund
Jüngste Entwicklungen in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben Strukturstudien von immer komplexeren Systemen mit hoher Auflösung ermöglicht. Mit wenigen Ausnahmen beschränkten sich solche Studien auf biologische Makromoleküle im Gleichgewicht¹ oder relativ langsame Reaktionen². Viele Prozesse in vivo laufen auf einer schnelleren Zeitskala (Millisekunden) ab und es besteht ein zunehmendes Interesse an zeitaufgelöster Kryo-EM (TrEM) auf diesen Zeitskalen³. Die herkömmliche Kryo-EM-Probenvorbereitung durch die Blotting-Methode ist jedoch zu langsam für Millisekunden-TrEM.

Die Blotting-Methode hat neben der schlechten Zeitauflösung noch andere Einschränkungen. Proteine und Proteinkomplexe können unter Denaturierung oder bevorzugter Orientierung auf Gittern^{leiden 4}. Es hat sich gezeigt, dass die Verringerung der Expositionszeit gegenüber der Luft-Wasser-Grenzfläche während der Probenvorbereitung die bevorzugte Orientierung und Proteindenaturierung verringert^5,6. So ermöglicht eine schnelle Netzvorbereitung nicht nur Millisekunden-TrEM, sondern kann auch die Netzqualität verbessern.

Derzeit gibt es drei verschiedene Ansätze zur automatisierten Netzvorbereitung. Der erste Ansatz verwendet einen Stift oder eine Kapillare, die eine kleine Menge an Probe enthält. Nach der Herstellung des Kontakts zwischen der Flüssigkeit und der Gitteroberfläche wird die Probe auf das Gitter^7,8"geschrieben". Der Beispielantragsprozess ist relativ langsam und dauert einige Sekunden. Ein alternativer Ansatz verwendet die kontrollierte Tröpfchenerzeugung durch einen Piezospender und selbstableitende Gitter⁹. Dies ermöglicht schnellere Dosier- bis Gefrierzeiten, ist aber immer noch durch Tröpfchen- und Dochtgeschwindigkeit begrenzt (derzeit 54 ms). Der bisher schnellste Ansatz ist der direkte Sprühansatz, bei dem die Probe in einer Sprühdüse zerstäubt wird und sich die kleinen (~ 10 - 20 μm) und schnellen (> 5 m/s) Tröpfchen bei Kontakt mit dem Kryo-EM-Gitter ausbreiten. Das Probenspray kann auf verschiedene Arten wie Luftstrahlzerstäuber, oberflächenakustische Wellen oder Ultraschallbefeuchter^{10 , 11,12,13}erzeugt werden. Nach unserer Erfahrung ist die Eisdicke beim direkten Sprühansatz größer, aber das direkte Sprühen ermöglicht das Dosieren gefrieren < 10 ms.

Dieses Protokoll beschreibt Schritt für Schritt, wie ein zeitaufgelöstes EM-Gerät (TED), das mit einer mikrofluidischen Sprühdüse ausgestattet ist, verwendet werden kann, um Gitter auf einer schnellen Zeitskala^{vorzubereiten 14,15}. Das Gerät wurde verwendet, um Gitter mit einer minimalen Verzögerungszeit von 6 ms zwischen Probenanwendung und Einfrieren vorzubereiten und zwei Proben schnell zu mischen und einzufrieren. Das Design des TED basiert auf einer Vorgängerversion¹⁶ und ähnelt anderen sprühbasierten zeitaufgelösten Kryo-EM-Geräten^17.

Zunächst werden die vier Hauptteile des TED-Setups beschrieben. Das Herzstück des TED ist die Liquid Handling Unit, die für die Probenabsaugung und -dosierung zuständig ist. Ein pneumatischer Kolben bewegt das Gitter durch das Spray in das flüssige Ethan. Die Erzeugung des Sprays erfolgt mit mikrofluidischen Sprühdüsen und das Einfrieren erfolgt in einem flüssigen Ethanbehälter, die kurz beschrieben werden. Schließlich werden die zusätzlichen Funktionen zur Steuerung der Netzumgebung, insbesondere der Luftfeuchtigkeit, hervorgehoben. Es folgen detaillierte Protokolle für den Betrieb des Gerätes und für die Durchführung von TrEM-Experimenten. Repräsentative Ergebnisse werden für eine schnelle Netzvorbereitung und ein einfaches TrEM-Experiment gegeben.

Versuchsaufbau

Die Liquid-Handling-Einheit
Das Liquid-Handling-System des TED besteht aus drei Spritzenantriebspumpen ("Pumpen 1 - 3"), die jeweils mit einer Zellenradschleuse ausgestattet sind (Abbildung 1). Ein Netzteil versorgt die Pumpen 1 - 3 mit 24 V DC. Die Kommunikation mit der Steuerungssoftware (geschrieben in Visual Basic und C++) erfolgt über eine RS232-Schnittstelle zu Pump 1. Die Befehle werden über die seriellen E/A-Erweiterungsports von Pumpe 1 bis Pumpen 2-3 verteilt. Die Pumpen 1-3 sind mit Glasspritzen ausgestattet ('Spritzen 1-3', wir verwenden hier 250 μL/Null Totvolumen spritzen). Jedes Ventil hat zwei Positionen, "Load" und "Dispense". Die "Last"-Position wird verwendet, um die Probe in die Spritze abzusaugen. Ein kurzes Stück (~ 3 - 4 cm) aus 1/16" O.D., 0,01′′ I.D. FEP-Schläuchen ist über ETFE/ETFE-Flansch-Verschlussstücke mit der "Last"-Position der Ventile 1-3 verbunden. Dieses kurze Stück Schlauch reicht in das Probenreservoir (typischerweise ein 1,5 ml oder 0,5 ml Kunststoffröhrchen). Die "Dispense"-Position führt zur Sprühdüse. Die Verbindung zwischen dem "Dispense"-Auslass und der Sprühdüse erfolgt durch PE-Schläuche (~ 20-30 cm Länge, 0,043" O.D., 0,015" I.D.), mit einem kurzen Stück Hülsenschlauch (~ 0,5 cm) und ETFE/ETFE-Flansch-Fittings.

Der pneumatische Kolben
Der TED verwendet einen pneumatischen Kolben, um das Gitter zu beschleunigen und es durch das Probenspray in den flüssigen Ethanbehälter zu bewegen. Eine Unterdruckpinzette hält das Gitter, das in eine selbstgebaute Halterung geschraubt wird, die an einem Doppelstab-Pneumatikzylinder montiert ist (Abbildung 2A).

Der Druck wird von einer großen Stickstoffgasflasche (Größe W) geliefert, die mit einem mehrstufigen Regler (0 - 10 bar, "Hauptdruck") ausgestattet ist. Flexibler verstärkter PVC-Schlauch (12 mm O.D.) verbindet den Regler mit einem 12-Port-Verteiler, in dem unter Druck stehender Stickstoff an die Düse und den pneumatischen Kolben abgegeben wird. Der Gasfluss durch die Düse ist konstant und wird direkt am Stickstoffzylinder geregelt (Hauptdruck). Die Verbindung zur Düse erfolgt mit PU-Schläuchen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), einem kurzen Stück PE-Schlauch (~ 8 cm Länge, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) und entsprechenden Anschlüssen. Der Druck auf den pneumatischen Kolben wird über ein Magnetventil gesteuert. PU-Schläuche (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) verbinden das Magnetventil mit einem Regler und dem pneumatischen Kolben, um einen reduzierten Tauchdruck (≤ Hauptdruck) zu ermöglichen. Das Magnetventil ist computergesteuert. Eine schematische Übersicht über das Setup finden Sie in Abbildung 2B.

Beachten Sie, dass bei diesem Setup der Tauchdruck immer gleich oder kleiner als der Sprühgasdruck (Hauptdruck) ist. Das Setup kann jedoch leicht geändert werden, indem ein zweiter Regler vor der Sprühdüse integriert wird, um höhere Tauchgeschwindigkeiten bei niedrigem Sprühgasdruck zu ermöglichen. Hohe Drücke (>> 2 bar) können die PDMS-Sprühdüse beschädigen.

ACHTUNG: Dies ist ein Drucksystem und der "Hauptdruck" sollte immer < 7 bar betragen.

Für den pneumatischen Kolben werden typischerweise Drücke zwischen 0,5 und 2 bar verwendet und zeigen ein annähernd lineares Verhältnis zwischen Druck und Geschwindigkeit (an der vertikalen Position des Sprays). Tauchgeschwindigkeiten werden mit einem Oszilloskop gemessen, das mit einem Schiebepotentiometer (10 kΩ) und parallel mit einem 2 kΩ-Widerstand verbunden ist(Abbildung 2C). Ein Netzteil versorgt das Potentiometer mit 9 V DC. Während die ungefähre Tauchgeschwindigkeit vor dem Experiment durch Einstellen des Tauchdrucks eingestellt wird, liefert das Potentiometer eine genaue Ablesung der Geschwindigkeit nach dem Experiment.

Sprühdüsen und Flüssigethanbehälter
Die Herstellung und der Betrieb gasdynamischer virtueller Düsen für die sprühbasierte Probenabgabe wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben¹⁵. Wie oben beschrieben, sind die "Dosierauslässe" der Ventile 1-3 mit den Flüssigkeitseinlässen der Düse verbunden (Abbildung 3A). Das unter Druck stehende Sprühgas wird mit dem Gaseinlass der Düse verbunden. Die Einlässe in den PDMS-Sprühdüsen sind so, dass 0,043" O.D. PE-Schläuche direkt ohne Armaturen verwendet werden können. Unser Düsendesign enthält eine "Jet-in-Jet"-Geometrie zum Mischen von zwei Proben, ähnlich der in Referenz 18 beschriebenen^Vorrichtung. Ein Schema des Designs ist in Abbildung 3Bdargestellt, ein mikroskopisches Bild einer Düse ist in Abbildung 3Cdargestellt. Das Layout des mikrofluidischen Geräts erfordert die Verwendung von drei Spritzen, um zwei Proben zu mischen. Die Sprühdüse wird typischerweise in 1-1,5 cm Abstand vom Gitter positioniert (während der Probenanwendung).

Wir verwenden flüssiges Ethan als Kryogen in einem flüssigen Ethan/ Stickstoffbehälter, wie es für die Standard-Blotting-Methode verwendet wird. Die vertikale Positionierung des flüssigen Ethanbechers wird mit einer Laborhebebühne erreicht.

Steuerung der Sprüh- und Gitterumgebung
Der Kolben und die Sprühdüse sind in einer speziell angefertigten PMMA-Box (Acrylglas) mit einer Doppeltür enthalten (Abbildung 4A). Eine hohe relative Luftfeuchtigkeit im Inneren der Box wird durch ein Luftbefeuchtungssystem an der Rückseite des TED erreicht (Abbildung 4B). Die Luft wird von einer Pumpe zugeführt und in einen ersten 10-Zoll-Kanister (typischerweise für die Reinigung von Wasser unter der Spüle verwendet) eingespeist. Der Kanister ist mit einem niedrigen Wasserstand (~ 5-10 cm) gefüllt und beherbergt auch eine Luftbefeuchtereinheit. Die Stromversorgung des Luftbefeuchters wird über einen digitalen Feuchtigkeits-/Temperaturregler und einen Feuchtigkeits-/Temperatursensor im Inneren der Acrylglasbox gesteuert. Der Regler ist so eingestellt, dass die Pumpe ausgeschaltet wird, wenn die relative Luftfeuchtigkeit ≥ 90 % erreicht. Befeuchtete Luft aus dem ersten Kanister wird durch einen Diffusor gepumpt, in einem zweiten 10-Zoll-Kanister in Wasser getaucht und gelangt dann in den Acrylglaskasten.

ACHTUNG: Da die Probe in der Sprühdüse aerosolisiert wird, sind gefährliche biologische oder chemische Proben nicht als Proben geeignet.

Die Laufsequenz
Die Schaltfläche Skript ausführen in der Steuerungssoftware initiiert die Ausführungssequenz. Diese Befehlsfolge kann in einer Skriptdatei vordefiniert und durch die Software verändert werden. Die wichtigsten Variablen werden hier erklärt:

Sprühgeschwindigkeit: Die Sprühgeschwindigkeit bestimmt den Flüssigkeitsdurchfluss, der von der Spritzenpumpe verwendet wird. Der Durchfluss kann wie folgt berechnet werden: Die hier eingesetzten Spritzenpumpenmotoren haben eine feste Schrittgröße. Die gesamte Palette der Pumpe ist in 48.000 Schritte unterteilt. Der zweite wichtige Faktor ist das Spritzenvolumen. Wir verwenden typischerweise 250 μL Spritzen. Die Sprühgeschwindigkeit in der Steuerungssoftware wird als Anzahl der Schritte/Sekunde eingestellt. Eine Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/Sekunde entspricht:

Sprühvolumen: Das Sprühvolumen bestimmt das zu sprühene Gesamtvolumen. Somit bestimmt es auch die Dauer des Sprays. Die Sprühmenge in der Steuerungssoftware wird in mehreren Schritten eingestellt. Ein Sprühvolumen von 2000 Schritten, bei einer Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/Sekunde, führt zu einer Sprühdauer von 2 s und einem Gesamtvolumen von 10,4 μL.

Vorsprühzeit: Diese Variable definiert die Zeit zwischen dem Beginn des Sprays und dem Eintauchen. Es ist wichtig, die Verzögerungszeit so zu wählen, dass das Spray genügend Zeit hat, sich zu stabilisieren, bevor es das Gitter eintaucht. Normalerweise wird dem Spray 1,5 - 4 s gegeben, um sich zu stabilisieren, bevor das Gitter eingetaucht wird. Das Spray wird so lange aufrechterhalten, bis sich das Gitter durchbewegt hat. Normalerweise wird der Flüssigkeitsfluss (und damit das Spray) 0,5 bis 1 s gestoppt, nachdem das Gitter eingetaucht wurde. Bei einer Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/s und einem Sprühvolumen von 2000 Schritten beträgt eine typische Vorsprühzeit beispielsweise 1,5 s.

Eine beispielhafte Abfolge von Befehlen ist in Abbildung 5Adargestellt, die Rasterposition über die Zeit ist in Abbildung 5Bdargestellt.

Protokoll

1. Vorbereitung des Systems

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt, wie Raster einer einzelnen Probe vorbereitet werden. Normalerweise werden mindestens 2 Replikatgitter für jede Probe oder Bedingung vorbereitet. Für schnellere Tauchgeschwindigkeiten (weniger als ~ 20 ms Zeitverzögerung) sind 3 oder 4 Replikatgitter in der Regel so vorbereitet, dass sie eine reduzierte Anzahl dünner Eisflächen berücksichtigen.

1. Verdünnen Sie die Proteinprobe auf die Zielkonzentration im gewünschten Puffer. Typischerweise funktionieren Endkonzentrationen ≥ 2 mg / ml gut für die Gittervorbereitung mit dem TED. Beachten Sie, dass die Probe bis Schritt 10 auf Eis gehalten werden kann, ab Schritt 10 verbringt die Probe viel Zeit bei Raumtemperatur, da es ungefähr 20 Minuten dauert, um 3-4 Gitter vorzubereiten.
2. Schalten Sie den TED ein. Schalten Sie dann den Steuerungs-PC ein und starten Sie die Steuerungssoftware.
3. Initialisieren Sie alle Spritzenpumpen, indem Sie die Initialize-Taste (untere schwarze Taste) an jeder Spritzenpumpe drücken.
4. Schalten Sie das Potentiometer-Netzteil ein, stellen Sie es auf 9 V und starten Sie die Oszilloskop-Steuerungssoftware.
5. Stellen Sie sicher, dassdas Reglerventil des N2-Zylinders geschlossen ist. Öffnen Sie das Zylinderventil. Öffnen Sie dann langsam das Reglerventil, um den Ausgangsdruck auf den gewünschten Wert für den Sprühgasdruck (typischerweise 1-2 bar) einzustellen. Verwenden Sie für die hier verwendeten PDMS-Düsen keine Drücke höher als ~ 2,5 bar, um Schäden an der Düse zu vermeiden. Das kontinuierlich strömende Gas verhindert, dass Flüssigkeit an der Düsenspitze tropft und sich ansammelt, was zu einem irreproduziblen Sprühen führen kann.
6. Stellen Sie sicher, dass sich alle Spritzenpumpenventile in der "Last"-Position befinden. Dies kann durch Umschalten aller Ventile in die Position "Dispense" in der Steuerungssoftware und dann wieder auf "Load" erfolgen. Lassen Sie alle Ventile auf "Last" geschaltet. Stellen Sie alle Spritzen auf Null.
7. Entfernen Sie alle Luftblasen, die in diesem Stadium im System vorhanden sind. Dazu müssen die Spritzen möglicherweise abschrauben, Blasen manuell entfernt und die Spritzen wieder montiert werden, wenn sie keine Blasen mehr enthalten.
8. Die Liquid-Handling-Komponenten werden in der Regel in H2 O_gelagert. Bevor Sie die Probenlösung laden, gleichen Sie das Flüssigkeitssystem mit Puffer aus, indem Sie den Schlauch mit einem Überschuss an Puffer waschen. Verwenden Sie einen geeigneten maximalen Flüssigkeitsdurchfluss, um einen Überdruck auf die Sprühdüse zu vermeiden. Flüssigkeitsdurchflüsse > 10 μL/s können die hier beschriebenen PDMS-Düsen beschädigen.
9. Legen Sie ein 1,5-ml-Röhrchen mit ≥ 200 μL-Puffer auf die Spritze 1 (die Oberseite muss durchbohrt werden, um sie am Schlauch zu befestigen).
   1. Stellen Sie sicher, dass sich Ventil 1 in der Lastposition befindet. Schalten Sie bei Bedarf in der Steuerungssoftware ein.
   2. Saugen Sie die gewünschte Menge (typischerweise 50-100 μL) Puffer mit spritze 1 über die Steuerungssoftware ab.
   3. Schalten Sie das Ventil 1 über die Steuerungssoftware in die Position "Dispense".
   4. Dosieren Sie die gesamte Flüssigkeit in Spritze 1 über die Steuerungssoftware.
   5. Setzen Sie das Ventil auf "Load" zurück, setzen Sie die Spritzenposition im Programm auf "0" zurück und drücken Sie initialize auf Spritze 1, um das System für den nächsten Zyklus vorzubereiten.
      HINWEIS: Die Schritte 1.9.1 - 1.9.5 werden normalerweise dreimal wiederholt, um eine gründliche Wäsche des Schlauches zu gewährleisten.
10. Laden Sie die Pinzette mit einem EM-Gitter (keine Anforderung für einen bestimmten Typ), indem Sie die Armklemme lösen, die Pinzette in die Klemme legen und die Klemme festziehen.
11. Bewegen Sie den Eintaucharm manuell so, dass sich Gitter und Düse auf der gleichen Höhe befinden (die Position der "Probenanwendung"). Wenn Düse und Gitter ausgerichtet sind, sammelt sich nach längerem Sprühen Flüssigkeit auf dem Gitter an. Passen Sie ggf. die Düsenposition an.
12. Stellen Sie die Position des flüssigen Ethanbechers ein, indem Sie den Eintaucharm mit montierter Pinzette manuell in seine Endposition bewegen (bis in den Ethanbecher reichen). Bei richtiger Einrichtung erreicht ein gitter, das von der Pinzette gehalten wird, ungefähr die Mitte des flüssigen Ethanbechers.
13. Überprüfen Sie, ob das "Run-Skript" die gewünschten Flussraten, Volumes und Timings verwendet. Siehe Abschnitt 'Die Ausführungssequenz' oben für Details.
14. Stellen Sie sicher, dass nichts den Weg des Kolbens behindert. Saugen Sie das Puffervolumen an, das für einen einzelnen Lauf in die Spritze 1 erforderlich ist. Dies geschieht in der Steuerungssoftware, siehe Abschnitt 'Die Ausführungsreihenfolge' für typische Einstellungen und Lautstärken. Stellen Sie dann sicher, dass Ventil 1 in die Position "Dispense" geschaltet ist. Führen Sie einen Testlauf durch, indem Sie in der Steuerungssoftware auf Skript ausführen drücken.
    ACHTUNG: Halten Sie sich vom TED fern, bis die Ausführungssequenz abgeschlossen ist. Bewegliche Teile können Verletzungen verursachen!
15. Wenn die "Laufsequenz" beendet ist, stellen Sie den Druck auf den Eintaucharm auf den gewünschten Wert ein (typischerweise 1-2 bar). Erst dann drücken Sie OK in der Steuerungssoftware, um den Druck vom Eintaucharm abzulassen. Wenn die "Laufsequenz" oder der Druck auf den Eintaucharm angepasst werden müssen, können diese Einstellungen in diesem Stadium geändert und die Schritte 1.13 - 1.15 wiederholt werden.

2. Schnelle Netzvorbereitung

1. Füllen Sie den behälter für flüssiges Ethan/Stickstoff zuerst mit flüssigem Stickstoff. Wenn ausreichend kalt und frei von flüssigem Stickstoff, füllen Sie den Becher mit flüssigem Ethan. Vermeiden Sie die Erstarrung des flüssigen Ethans. Dieser Schritt ist derselbe wie bei der herkömmlichen Netzvorbereitung.
   HINWEIS: Um die Ethankontamination zu minimieren, stellen Sie sicher, dass die Schritte 2.2 - 2.13 so schnell wie möglich durchgeführt werden.
   ACHTUNG: Flüssiges Ethan ist ein Kryogen und brennbar. Bei der Handhabung ist Vorsicht geboten.
2. Bereiten Sie Kryo-EM-Gitter für die Glühentladung vor. Wir verwenden typischerweise löchrige Kohlenstoffgitter und Glühentladung für 90 s, bei 0,1 mbar Luftdruck und 10 mA. Normalerweise werden nicht mehr als 4 Gitter gleichzeitig entladen. Die Gitter werden innerhalb von 30 Minuten nach dem Glühen verwendet.
3. Gleichgewichten des Schlauchs mit der Probe (gemäß den Schritten 1.9.1 - 1.9.5, wobei Probe anstelle von Puffer verwendet wird). Wenn das verfügbare Probenvolumen gering ist, kann der Schlauch mit nur 1 Totvolumen ausgeglichen werden.
4. Saugen Sie die Probenmenge, die für einen einzelnen Durchlauf in spritze 1 benötigt wird, in der Steuerungssoftware ab (siehe Abschnitt "Die Ausführungssequenz" für Details). Schalten Sie dann Ventil 1 in die Position "Dispense".
5. Überprüfen Sie, ob die relative Luftfeuchtigkeit den gewünschten Wert erreicht hat (wir bereiten normalerweise Gitter bei 60 % relativer Luftfeuchtigkeit oder höher vor). Sobald ≥ 60 % Luftfeuchtigkeit erreicht ist, öffnen Sie die Feuchtigkeitskammer nur für eine minimale Zeit, um eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
6. Legen Sie die Pinzette mit einem glühend entladenen Gitter in den pneumatischen Kolben und befestigen Sie sie. Bewegen Sie den Kolben in seine Startposition (oben).
7. Stellen Sie sicher, dass sich der Schieber des Potentiometers in der Startposition befindet, bereit für die Messung, indem Sie ihn manuell bewegen, um den Kolben zu kontaktieren. Stellen Sie den Auslöser am Oszilloskop in der Oszilloskop-Software ein.
8. Stellen Sie den Behälter für flüssiges Ethan/Stickstoff auf.
9. Drücken Sie in der Steuerungssoftware auf Skript ausführen. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie in der Steuerungssoftware auf OK, um die Ausführung zu starten.
   ACHTUNG: Halten Sie sich vom TED fern, bis die Ausführungssequenz abgeschlossen ist. Bewegliche Teile können Verletzungen verursachen!
10. Sobald die "Laufsequenz" abgeschlossen ist, lassen Sie den Druck auf den pneumatischen Kolben los, indem Sie in der Steuerungssoftware auf OK klicken.
11. Öffnen Sie die Feuchtigkeitskammer, lösen Sie die Verbindung zwischen Eintaucharm und Pinzette mit einer Hand, während Sie die Pinzette mit der anderen sichern. Wenn die Pinzette frei ist, bewegen Sie den Eintauchenarm nach oben, während Sie das Gitter im flüssigen Ethan halten. Anschließend wird das Gitter auf seinen Speicherplatz in der umgebenden Flüssigkeit_{N2 übertragen.} Nach dem Einfrieren muss das Gitter jederzeit auf der Temperatur der Flüssigkeit_{N 2} gehalten werden.
12. Speichern Sie die Oszilloskopmessung. Setzen Sie anschließend die Position des Potentiometer-Schiebers und des Kolbens manuell zurück.
13. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.12, um Replikatraster vorzubereiten
14. Übertragen Sie die Raster in den Langzeitspeicher bis zum Grid-Clipping und der Datenerfassung.
15. Waschen Sie das System mit Puffer gemäß den Schritten 1.9.1 - 1.9.5. Waschen Sie dann das System mit H₂O gemäß den Schritten 1.9.1 - 1.9.5.
16. Schalten Sie den Hauptstickstoffgasregler aus und schalten Sie die Stromversorgung aus.
17. Stellen Sie den Ethan/Stickstoffbehälter in einen Abzug, um ihn aufwärmen zu lassen und das flüssige Ethan und_N2 verdampfen zu lassen.

3. Zeitaufgelöste Kryo-EM

HINWEIS: Wenn zeitaufgelöste Experimente mit dem TED durchgeführt werden, sind zusätzliche Aspekte zu berücksichtigen, obwohl der grundlegende Aufbau und die Variablen gleich bleiben. Es wird hier angenommen, dass zwei Lösungen in einem Verhältnis von 1:1 (v/v) gemischt werden, um das endgültige Gemisch zu erzeugen, das sich auf dem Gitter ablagert. Befolgen Sie das unter '1. Schnelle Netzvorbereitung mit dem TED', mit folgenden Änderungen:

1. Verwenden Sie für Mischversuche höhere Stammkonzentrationen als für einfache Sprühexperimente. Das Mischen in einem Verhältnis von 1:1 (v/v) führt zu einer 2-fachen Verdünnung jeder Komponente.
2. Verwenden Sie für ein schnelles Mischexperiment alle drei Spritzen und nicht nur eine einzige.
   1. Schläuche an Spritzenpumpen 2-3 befestigen.
   2. Befestigen Sie Schläuche aus Spritzenpumpen 2-3 an der Sprühdüse.
   3. Gleichicht alle drei Spritzen im Puffer aus und probe separat. Typischerweise wird die Spritze 1 mit Probe A und die Spritzen 2-3 mit Probe B gefüllt (Abbildung 3).
3. Ändern Sie die Ausführungsreihenfolge. Ein Beispiel für eine Laufsequenz mit allen 3 Spritzen für ein Schnellmischexperiment ist in Abbildung 6 dargestellt. Siehe auch Abschnitt 'Die Ausführungssequenz' für Details.
4. Unterschiedliche Zeitverzögerungen können auf zwei Arten erreicht werden:
   1. Ändern Sie die Kolbengeschwindigkeit. Durch die Einstellung der Kolbendrehzahl kann die Zeitverzögerung in einem relativ engen Bereich verändert werden. Bei einem Sprüh-/Ethanabstand von 2 cm kann der Kolben beispielsweise mit 1 m/s bzw. 2 m/s bewegt werden, um eine Zeitverzögerung von 20 ms bzw. 10 ms zu erhalten. Dies geschieht wie in Schritt 1.15 beschrieben.
   2. Ändern Sie die Sprüh-/Ethanposition, indem Sie die (vertikale) Position der Sprühdüse anpassen. Wird die Düse beispielsweise in einem Abstand von 5 cm von der Ethanoberfläche positioniert, ergibt eine Tauchgeschwindigkeit von 1 m/s eine Zeitverzögerung von 50 ms. Um deutlich längere Zeitverzögerungen zu erreichen, sind weitere Modifikationen am Setup erforderlich.
      HINWEIS: Aufgrund der laminaren Strömung im Strömungsfokussierungsbereich der Düse erwarten wir keine signifikante Durchmischung in diesem Teil der Düse. Stattdessen erwarten wir, dass die Vermischung während der Sprüherzeugung, in Tröpfchen auf dem Weg zum Gitter und während der Tröpfchenausbreitung auf dem Gitter auftritt. Die Flugzeit für Sprühtröpfchen, die das Gitter erreichen, wird ≤ 1 ms geschätzt (bei einer Tröpfchengeschwindigkeit von ≥ 10 m/s und einem Düsengitterabstand von 1 cm). Somit gilt nur die Zeit zwischen Tröpfchenlandung und Vitrifikation als "Zeitverzögerung".

Ergebnisse

Schnelle Netzvorbereitung mit dem TED
Als Prüfling für die schnelle Gittervorbereitung haben wir Apoferritin aus Pferdespelz bei 20 μM in 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5 verwendet. Eine Rekonstruktion bei einer Auflösung von 3,5 Å wurde aus 690 Mikroaufnahmen wie in Referenz¹⁵ beschrieben (Abbildung 7A) erhalten. Der Defokussbereich wurde so gewählt, dass Partikel in den Rohbildern leicht identifiziert werden können (Abbildung...

Diskussion

Die Protokolle in dieser Arbeit können für eine schnelle Gittervorbereitung durch direktes Sprühen und TrEM-Experimente verwendet werden. Die schnelle Gittervorbereitung kann verwendet werden, um Partikelwechselwirkungen mit der Luftwasserschnittstelle zu reduzieren⁵. Die Haupteinschränkungen sind die verfügbare Probenkonzentration und die Eisdicke auf dem Gitter. Innerhalb dieser Grenzen und unter der Voraussetzung, dass die Probenqualität gut ist, erzeugt das Protokoll Gitter, die für hochauflös...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
zeitaufgelöstes Gerät
	Upchurch Scientific 1/16" Außendurchmesser, 0,01'' I.D. FEP-Schläuche
flanschlose Verschraubungen	Upchurch Scientific ETFE/ETFE flanschlose Verschraubungen
	12 mm Außendurchmesser flexible verstärkte PVC-Schläuche
Glasspritzen	Kloehn 250 µ L
	Interpret Aqua Air AP3
Flüssigethanbehälter	von Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV
mehrstufiger Regler	GASARC Klasse 3 mehrstufiger Regler
Unterdruckpinzette	Dumont N5 Inox B Unterdruckpinzette
Oszilloskop	Hantek 6022BE Oszilloskop
PE-Schläuche	Scientific Commodities Inc. 0.043" Außendurchmesser, 0,015" I.D. PE-Schläuche
Netzteil	Mean Well GSM160A24-R7B
Netzteil	Wanptek KPS305D Netzteil
PU-Schlauch	SMC TU0425 4 mm Außendurchmesser, 2,5 mm Innendurchmesser PU-Schlauchregler
	Norgren R72G-2GK-RMN
Schiebepotentiometer	PS100 Schiebepotentiometer
Magnetventil	SMC NVJ314M Magnetventil
Spritzenantrieb Pumpen	Kloehn V6 48K Modell
Reagenzien & Reagenzien Materialien
Apoferritin aus Pferdemilz	Sigma-Aldrich, A3660
ATP	Sigma-Aldrich, A2383
Kryo-EM-Gitter	Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3
EGTA	Sigma Aldrich E3889
F-Aktin	Zur Verfügung gestellt von H.D. White (zum Präparationsverfahren siehe Ref. < sup>1)
Glühentlader	Cressington 208 Carbon Coater mit Glimmentladungseinheit
HEPES	Sigma-Aldrich, H7006
KAc	Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2	Sigma-Aldrich, M8266
MOPS	Sigma-Aldrich, M1254
NaCl	Sigma-Aldrich, S9888
Skelettmuskelmyosin S1	Bereitgestellt von H.D. White (für das Präparationsverfahren siehe Ref. 2)
Ref 1	Spudich, J. A. & Watt, S. Die Regulation der Kontraktion der Skelettmuskulatur von Kaninchen I. Biochemische Untersuchungen der Wechselwirkung des Tropomyosin-Troponin-Komplexes mit Aktin und den proteolytischen Fragmenten von Myosin. Zeitschrift für biologische Chemie 246, 4866-4871 (1971).
Ref 2	Weiß, H. & Taylor, E. Energetik und Mechanismus der Aktomyosin-Adenosintriphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).