Hier wird ein Protokoll zur metabolischen Markierung von Hefe mit 14C-Essigsäure vorgestellt, das mit dünnschichtiger Chromatographie zur Abtrennung neutraler Lipide gekoppelt ist.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neutrale Lipide (NLs) sind eine Klasse von hydrophoben, ladungslosen Biomolekülen, die eine Schlüsselrolle bei der Energie- und Lipidhomöostase spielen. NLs werden de novo aus Acetyl-CoA synthetisiert und kommen in Eukaryoten vor allem in Form von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) vor. Die Enzyme, die für die Synthese von NLs verantwortlich sind, sind von Saccharomyces cerevisiae (Hefe) für den Menschen hoch konserviert, was Hefe zu einem nützlichen Modellorganismus macht, um die Funktion und Regulation von NL-Stoffwechselenzymen zu analysieren. Während viel darüber bekannt ist, wie Acetyl-CoA in eine Vielzahl von NL-Spezies umgewandelt wird, werden Mechanismen zur Regulierung von NL-Stoffwechselenzymen und wie Fehlregulation zu zellulären Pathologien beitragen kann, immer noch entdeckt. Zahlreiche Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von NL-Arten wurden in jahrzehntelanger Forschung entwickelt und eingesetzt; Ein quantitatives und einfaches Protokoll für die umfassende Charakterisierung der wichtigsten NL-Arten wurde jedoch nicht diskutiert. Hier wird eine einfache und anpassungsfähige Methode zur Quantifizierung der De-novo-Synthese wichtiger NL-Arten in Hefe vorgestellt. Wir wenden 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierungen in Verbindung mit Dünnschichtchromatographie an, um eine Vielzahl physiologisch wichtiger NLs zu trennen und zu quantifizieren. Darüber hinaus kann diese Methode leicht angewendet werden, um in vivo Reaktionsraten von NL-Enzymen oder den Abbau von NL-Spezies im Laufe der Zeit zu untersuchen.
Einleitung
Acetyl-CoA ist der grundlegende Baustein verschiedener Biomoleküle, einschließlich neutraler Lipide (NLs), die als vielseitige biomolekulare Währung für den Aufbau von Membranen, die Erzeugung von ATP und die Regulierung der Zellsignalisierung dienen1,2. Die Verfügbarkeit von NLs, die in einen dieser jeweiligen Pfade geschoben werden können, wird teilweise durch ihre Speicherung reguliert. Lipidtröpfchen (LDs), zytoplasmatische Organellen, die aus hydrophoben Kernen von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) bestehen, sind die Hauptspeicherkompartimente der meisten zellulären NLs. Als solche sequestrieren ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Wachstum und Markierung von Hefezellen mit 14C-Essigsäure
- Impfen Sie eine Hefekultur, indem Sie eine Kolonie von einem Teller pflücken und in 20 ml synthetisches komplettes (SC) Medium mit 2% Dextrose dosieren (siehe Ergänzungsdatei für die Rezeptur von SC-Medien). Bei 30 °C über Nacht mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
HINWEIS: Wachstumszustand, Probenvolumen und Behandlung unterscheiden sich je nach den lipiden von Interesse. Vor der Durchführung vollständiger Experimente sollten optimale Wachstumsbedingungen und Kulturvolumina empirisch bestimmt werden. Dieses Protokoll diskutiert die Radiomarkierung von Hefekulturen....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass die Markierung, Detektion und Quantifizierung von NL-Spezies durch 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung erreicht werden kann. Wichtige NL-Spezies können in einem Lösungsmittelsystem von 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexan:Petrolether:Diethylether:Essigsäure(Abbildung 1A,B)getrennt werden. Die Phosphorbildgebung ermöglicht die Visualisierung von markierten freien Fettsäuren (FFA), Triacylglycerin (TG), Diacylglycerin (DG), Chole.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Hier wird ein vielseitiges Radiolabeling-Protokoll zur quantitativen Überwachung der Synthese von NL-Arten in Hefe vorgestellt. Dieses Protokoll ist sehr modular aufgebaut, so dass das Verfahren innerhalb von 3-6 Tagen abgeschlossen werden kann. Darüber hinaus gibt es eine Fülle von Literatur über die Verwendung von TLC zur Trennung von Lipidspezies und Metaboliten, die es dem Benutzer ermöglichen sollte, mehrere Lipidspezies von Interesse mit einem einfachen Wechsel der TLC-Lösungsmittelsysteme nachzuweisen
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen an der Erstellung dieses Manuskripts gibt.
Danksagungen
Die Autoren danken den Mitgliedern des Henne-Labors für die Hilfe und konzeptionelle Beratung bei der Fertigstellung dieser Studie. W.M.H. wird durch Mittel der Welch Foundation (I-1873), des NIH NIGMS (GM119768), des Ara Paresghian Medical Research Fund und des UT Southwestern Endowed Scholars Program unterstützt. S.R wurde durch einen T32-Programmzuschuss (5T32GM008297) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| [1-C14] Essigsäure-Natriumsalz-spezifische Aktivität: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 Dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolutes Ethanol | Sigma | 459836 | |
| Säuregewaschene Glasperlen 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Braune Glühbirnen für Pastuer-Pipetten | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammoniumsulfat >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 Szintillationszähler | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC-Qualität) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterin >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-Linoleat >98% | Sigma | C0289 | |
| Konzentrierte Schwefelsäure | Sigma | 339741 | |
| Corning konische Röhrchen 50 ml, Polypropylen mit Zentristarkappe | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, wasserfrei | Sigma | D9434 | |
| Diethylether wasserfrei | Sigma | 296082 | |
| Trockenschrank | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume Szintillationsflüssigkeit | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R Zentrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Speicher Phosphorsieb | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 Imager | |||
| Eisessig, ACS-Qualität | Sigma | 695092 | |
| Glas 6mL Szintillationsfläschchen | Sigma | M1901 | |
| Deckel für Zentrifugenröhrchen | aus Glas Fisher | 14-595-36A | |
| Zentrifugenröhrchen | aus Glas Fisher | 14-595-35A | |
| Pasteur-Glaspipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexan, wasserfrei | Sigma | 296090 | |
| L-Adenin >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanin >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginin >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagin >98 | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartat >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cystein >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutaminsäure Mononatriumsalz-Monohydrat >98 | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamin >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycin >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidin >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucin >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucin >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysin >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionin, HPLC-Qualität | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanin, Reagenzqualität | Sigma | P2126 | |
| L-Prolin >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serin >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronin, Reagenzqualität | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosin >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valin >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS-Qualität | Fisher | A412 | |
| Ölsäure >99 | Sigma | O1008 | |
| p-Anisaldehyd | Sigma | A88107 | |
| Petrolether, ACS-Klasse | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholin, Dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipetten | Eppendorf | 2231000713 | |
| Kaliumchlorid, ACS | Grade Sigma | P3911 | |
| Natriumhydroxid Pellets, zertifiziert ACS | Fisher S318-100 | ||
| Squalen >98% | Sigma | S3626 | |
| Bernsteinsäure kristallin/zertifiziert | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC Sättigungspad | Sigma | Z265225 | |
| TLC Kieselgel 60G Glaskanalplatte | Fisher | NC9825743 | Keine fluoreszierenden Indikatoren |
| Transparente Kunststofffolie | Apollo | 829903 | |
| Tricin | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex-Mischer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman Belichtungskassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Hefe Stickstoffbase ohne Ammoniumsulfat und Aminosäuren | Sigma | Y1251 |
Referenzen
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
