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Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung großer Mengen lipidverkapselter Decafluorbutan-Mikrobläschen mittels Sondenspitzen-Beschallung und anschließender Kondensation zu phasenverschobenen Nanotröpfchen mittels Hochdruckextrusion und mechanischer Filtration.

Abstract

Es gibt viele Methoden, die zur Herstellung von verdampfbaren Phasenverschiebungströpfchen für die Bildgebung und Therapie verwendet werden können. Jede Methode verwendet unterschiedliche Techniken und variiert in Preis, Material und Zweck. Viele dieser Herstellungsmethoden führen zu polydispersen Populationen mit ungleichmäßigen Aktivierungsschwellen. Darüber hinaus erfordert die Kontrolle der Tröpfchengrößen typischerweise stabile Perfluorcarbonflüssigkeiten mit hohen Aktivierungsschwellen, die in vivo nicht praktikabel sind. Die Herstellung einheitlicher Tröpfchengrößen unter Verwendung von Gasen mit niedrigem Siedepunkt wäre für In-vivo-Bildgebungs- und Therapieexperimente von Vorteil. Dieser Artikel beschreibt eine einfache und wirtschaftliche Methode zur Bildung von größengefilterten lipidstabilisierten Phasenverschiebungs-Nanotröpfchen mit niedrig siedendem Decafluorbutan (DFB). Eine gängige Methode zur Erzeugung von Lipid-Mikrobläschen wird beschrieben, zusätzlich zu einer neuartigen Methode, sie mit Hochdruckextrusion in einem einzigen Schritt zu kondensieren. Diese Methode wurde entwickelt, um Zeit zu sparen, die Effizienz zu maximieren und größere Mengen an Mikroblasen- und Nanotröpfchenlösungen für eine Vielzahl von Anwendungen mit gängigen Laborgeräten zu erzeugen, die in vielen biologischen Labors zu finden sind.

Introduction

Ultraschall-Kontrastmittel (UCAs) werden für Bildgebungs- und Therapieanwendungen immer beliebter. Mikroblasen, die ursprünglichen UCAs, sind derzeit die Mainstream-Wirkstoffe, die in klinischen diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Mikrobläschen sind gasgefüllte Kugeln mit einem Durchmesser von typischerweise 1-10 μm, die von Lipid-, Protein- oder Polymerhüllen umgeben ^sind1. Ihre Größe und In-vivo-Stabilität können jedoch ihre Funktionalität in vielen Anwendungen einschränken. Phasenverschobene Nanotröpfchen, die einen überhitzten flüssigen Kern enthalten, können einige dieser Einschränkungen aufgrund ihrer geringeren Größe und verbesserten Kreislauflebensdauer ^überwinden2. Wenn er Hitze oder akustischer Energie ausgesetzt wird, verdampft der überhitzte flüssige Kern zu einer Gasmikrobläsche2,3,4,5. Da die Verdampfungsschwelle in direktem Zusammenhang mit der Tröpfchengröße5,6 steht, wäre die Formulierung von Tröpfchensuspensionen mit einheitlicher Größe sehr wünschenswert, um konsistente Aktivierungsschwellen zu erreichen. Formulierungsverfahren, die einheitliche Tröpfchengrößen erzeugen, sind oft komplex und kostspielig, während kostengünstigere Ansätze zu polydispersen Lösungen ^führen7. Eine weitere Einschränkung ist die Fähigkeit, stabile Phasenverschiebungströpfchen mit perfluorierten (PFC)-Gasen mit niedrigem Siedepunkt zu erzeugen, was für eine effiziente Aktivierung ^{in vivo8} entscheidend ist. In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur Erzeugung stabiler, gefilterter, verdampfbarer Phasenverschiebungströpfchen mit niedrigem Siedepunkt für In-vivo-Bildgebungs- und Therapieanwendungen beschrieben.

Es gibt viele Methoden zur Herstellung monodispersierter Submikron-Phasenverschiebungströpfchen7. Eine der robustesten Methoden zur Kontrolle der Größe ist die Verwendung von mikrofluidischen Geräten. Diese Geräte können teuer sein, eine langsame Tröpfchenproduktion aufweisen (~ 104-106 Tröpfchen / s) ⁷ und erfordern ein umfangreiches Training. Mikrofluidische Geräte benötigen im Allgemeinen auch Gase mit hohem Siedepunkt, um eine spontane Verdampfung und Verstopfung des Systems zu ^vermeiden7. Eine aktuelle Studie von de Gracia Lux et ^al.9 zeigt jedoch, wie die Kühlung eines Mikrofluididizers verwendet werden kann, um hohe Konzentrationen von Submikron-Phasenverschiebung (^1010-1012 / ml) unter Verwendung von Decafluorbutan (DFB) oder Octafluorpropan (OFP) mit niedrigem Siedepunkt zu erzeugen.

Im Allgemeinen sind Niedrigsiedepunktgase wie DFB oder OFP mit vorgeformten Gasblasen einfacher zu handhaben. Verdampfbare Tröpfchen können aus lipidstabilisierten Vorläuferblasen hergestellt werden, indem das Gas bei niedrigen Temperaturen und erhöhtem Druck kondensiert ^wird5,10. Die Konzentration der mit dieser Methode hergestellten Tröpfchen hängt von der Mikroblasenkonzentration der Vorstufe und der Effizienz der Umwandlung von Blasen in Tröpfchen ab. Konzentrierte Mikrobläschen wurden von der Spitzenbeschallung berichtet, die sich > ¹⁰¹⁰ MB / ^ml11 nähert, während eine separate Studie Tröpfchenkonzentrationen von ~ 1-3 x1011 Tröpfchen / ml aus kondensierten OFP- und DFP-Blasen12 gemeldet hat. Wenn monodispersierte Tröpfchen kein Problem darstellen, sind Kondensationsmethoden die einfachsten und kostengünstigsten Methoden zur Erzeugung von lipidstabilisierten Phasenverschiebungströpfchen unter Verwendung von PFCs mit niedrigem Siedepunkt. Methoden zur Erzeugung von Blasen gleichmäßiger Größe vor der Kondensation können dazu beitragen, mehr monodisperse Tröpfchenpopulationen zu erzeugen. Die Erzeugung monodisperser Vorläuferblasen ist jedoch ebenfalls schwierig, was kostspieligere Ansätze wie Mikrofluidik oder wiederholte differentielle Zentrifugationstechniken ^erfordert11. Ein alternativer Ansatz zur Herstellung von DFB- und OFB-Nanotröpfchen wurde kürzlich unter Verwendung der spontanen Keimbildung von Tröpfchen in Liposomen ^{veröffentlicht13}. Diese Methode, die einen “Ouzo” -Effekt verwendet, ist eine einfache Möglichkeit, PFC-Tröpfchen mit niedrigem Siedepunkt zu erzeugen, ohne Blasen kondensieren zu müssen. Die Größenverteilung der PFC-Tröpfchen kann durch delikate Titration und Mischen von PFC-, Lipid- und Ethanolkomponenten gesteuert werden, die zur Einleitung der Keimbildung der Tröpfchen verwendet werden. Es ist auch erwähnenswert, dass das Mischen von perfluorierten Kohlenwasserstoffen verwendet werden kann, um die Stabilität und die Aktivierungsschwellen von Nanotröpfchen zu ^{kontrollieren14,15}. Neuere Arbeiten von Shakya et al. zeigen, wie die Nanotröpfchenaktivierung durch Emulgieren von PFCs mit hohem Siedepunkt in einem Kohlenwasserstoff-Endoskelett abgestimmt werden kann, um die heterogene Keimbildung innerhalb des Tröpfchenkerns zu ^{erleichtern16}, was ein Ansatz ist, der zusammen mit anderen Formen der Tröpfchengrößenfiltration in Betracht gezogen werden kann.

Einmal gebildet, können Phasenverschiebungströpfchen nach der Bildung extrudiert werden, um mehr monodisperse Populationen zu erzeugen. Tatsächlich wurde ein ähnliches Protokoll wie die hier beschriebene Methode zuvor von Kopechek et ^al.17 unter Verwendung von Dodecofluorpentan (DDFP) mit hohem Siedepunkt als Tröpfchenkern veröffentlicht. Leser, die Phasenverschiebungströpfchen mit perfluorierten Kohlenwasserstoffen mit hohem Siedepunkt (stabil bei Raumtemperatur) verwenden möchten, sollten stattdessen auf den obigen Artikel verweisen. Das Erzeugen und Extrudieren von Tröpfchen mit Gasen mit niedrigem Siedepunkt wie DFB und OFP ist komplizierter und wird am besten durch Kondensieren von vorgeformten Gasblasen angegangen.

In diesem Protokoll wird eine gängige Methode zur Erzeugung von vorgeformten Lipid-Mikrobläschen mit einem DFB-Gaskern mittels Sondenspitzen-Beschallung beschrieben. Als nächstes wird ein kommerzieller Extruder verwendet, um vorgeformte Mikrobläschen zu Submikron-Phasenverschiebungs-Nanotröpfchen zu kondensieren (Abbildung 1). Die entstehenden Tröpfchen sind dann durch Hitze und Ultraschall aktierbar. Diese Methode kann größere Mengen an Nanotröpfchenlösung erzeugen als herkömmliche Kondensationsmethoden mit engeren Größenverteilungen, ohne dass teure mikrofluidische Geräte erforderlich sind. Die Herstellung von Nanotröpfchenlösungen mit engen Größenverteilungen kann wahrscheinlich gleichmäßigere Verdampfungsschwellen erzeugen. Dies wird ihr Potenzial für zahlreiche Anwendungen wie Bildgebung, Ablation, Arzneimittelabgabe und Embolisation maximieren1,3,4,6.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Hochdruck-Extrusionsaufbaus zur Kondensation von vorgeformten Mikrobläschen zu phasenverschobenen Nanotröpfchen. Mikrobläschenlösung wird in die Extruderkammer gegeben und in ihr enthalten, und 250 psi aus dem Stickstofftank werden durch das Kammereinlassventil aufgetragen. Das Stickstoffgas drückt die Mikrobläschenlösung durch den Filter an der Basis der Kammer und kondensiert die Probe zu Nanotröpfchen. Die Lösung wird schließlich durch das Probenauslassrohr aus dem Extruder geschoben und gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Lipidfilme herstellen

1. Bereiten Sie Lipidfilme für die Mikrobläschenerzeugung mit 90% DSPC und 10% DSPE-PEG2K vor, indem Sie die Lipide im richtigen Verhältnis unter Verwendung der folgenden Anweisungen mischen:
   1. Herstellung von Stammlipiden aus DSPC und DSPE-PEG2K in Chloroform. Wiegen Sie 50 mg jedes Lipidpulvers in separaten Fläschchen. Geben Sie 1 ml Chloroform in jede Durchstechflasche mit einer 1 ml Glasspritze.
   2. Geben Sie 287 μL DSPC-Material und 113 μL DSPE-PEG2K-Material (beide 50 mg/ml) mit einer Glasspritze in eine 20-ml-Szintillationsflasche.
   3. Trocknen Sie die gemischten Lipide, um Chloroform mit Stickstoff zu entfernen. Unter Verwendung einer geeigneten Schlauchlänge, die mit dem Stickstoff des Hauses verbunden ist, wird beim Mischen das Stickstoffgas leicht über den Kopfraum der Durchstechflasche geleitet. Fahren Sie fort, bis kein Chloroform mehr beobachtet wird und der verbleibende Lipidfilm weiß wird. Verwenden Sie Polypropylen-Schraubverschlüsse, bedecken Sie die Probe, während Sie Stickstoff in den Kopfraum einführen.
   4. Legen Sie die Fläschchen über Nacht mit einem Vakuum-Exsikkator unter Vakuum, um Restchloroform zu entfernen. Ein dünner durchscheinender Film bleibt erhalten, der den Boden der Durchstechflasche bedeckt.
   5. Lagern Sie die Durchstechflaschen bei -20 °C, bis sie benötigt werden.

2. Erzeugung von Mikrobläschen aus Lipidfilmen

1. Um die Mikrobläschen herzustellen, fügen Sie 10 ml 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) mit 20% v/v Propylenglykol und 20% v/v Glycerin (End-pH 7,2-7,4) zu einem trockenen Lipidfilm hinzu.
2. Kappen Sie die Probe erneut und erwärmen Sie die Probe für 30 min auf 65 °C in einem Heizblock (oder beheizten Wasserbad).
3. Während sich die Probe erwärmt, bereiten Sie den Badschallgerät vor, indem Sie die Badtemperatur auf 65 °C erhöhen.
   HINWEIS: Dieser Vorgang ist schneller, wenn das Wasser in einer Mikrowelle oder Kochplatte vorgewärmt wird, bevor es in den Badschallgerät gegeben wird.
4. Legen Sie die Szintillationsflasche mit der erwärmten Probe in den Badschallgerät, so dass nur der Teil der Durchstechflasche, der die Lipidlösung enthält, in das Wasserbad eingetaucht wird.
5. Die warme Lipidlösung wird mindestens 15 Minuten lang beschallt. Stellen Sie sicher, dass die Wassertemperatur bei 65 °C bleibt. In Abständen von 10-15 min weiter ultraschallisieren, bis die Lösung vollständig klar ist (Abbildung 2).
   HINWEIS: Wenn kein Badschallgerät verfügbar ist, kann die Lösung mit 10% Leistung beschallt werden, bis sie klar ist. Der Mikrotip verschleißt jedoch schneller und ist teurer zu ersetzen.

Abbildung 2: Beispiel für hydratisierte Lipidfilme. Beispiel für einen hydratisierten Lipidfilm (A) vor und (B) nach der Beschallung des Bades zur Bildung von einlamellaren Vesikeln. Nach der Badbeschallung sollte die Lipidlösung von einer undurchsichtigeren zu einer durchscheinenden Lösung wechseln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Entfernen Sie im warmen Zustand die Kappe und klemmen Sie die Durchstechflasche in das schalldichte Gehäuse des Schallakutors, sodass die Mikrospitzenbefestigung des Ultraschallgeräts direkt unter der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche eingetaucht ist (Abbildung 3).
7. Stellen Sie den Tank mit Decafluorbutan neben das schalldichte Gehäuse des Ultraschallgerätes.
8. Bereiten Sie ein Eisbad vor und stellen Sie es neben das schalldichte Gehäuse. Dies wird später in Schritt 2.14 verwendet.
9. Schalten Sie den Netzschalter für den Ultraschallgerät ein.
10. Stellen Sie nach dem Systemstart die Leistungsstufe auf 70 % ein. Überschreiten Sie nicht 70% Amplitude mit dem Microtip-Aufsatz. Starten Sie den Ultraschallgerät zu diesem Zeitpunkt nicht.
11. Befestigen Sie eine geeignete Schlauchlänge, um das Gas aus dem DFB-Tankauslass in die warme Lipidlösung im Gehäuse zu leiten. Das Röhrchen sollte direkt in den Hals der Durchstechflasche gelegt werden, damit während der Beschallung Gas in den Kopfraum fließen kann (Abbildung 3).
12. Öffnen Sie das Tankventil langsam, bis das Gas über die Lipidlösung fließt. Dies führt zu leichten Wellen auf der Oberfläche der Flüssigkeit. Wenn der Gasfluss zu hoch ist, läuft die Lösung während der Mikroblasenformulierung über.
13. Starten Sie den Ultraschallgerät und lassen Sie ihn 10 s kontinuierlich laufen, um Mikrobläschen zu erzeugen. Wenn die Blasenlösung während der Beschallung zu überlaufen beginnt, stoppen Sie sofort den Ultraschallgerät.
14. Schalten Sie den Ultraschallgerät aus und schließen Sie sofort das DFB-Tankventil.
15. Schließen Sie die Mikroblasenlösung schnell ab und tauchen Sie die Durchstechflasche in das Eisbad, um die Probe unter 55 °C zu kühlen (Glasübergangstemperatur von DSPC)
16. Lassen Sie die Mikrobläschenproben bis zum Bedarf im Eisbad.

Abbildung 3: Platzierung der Sondenspitze in Lipidlösung zur Optimierung der Mikroblasenbildung. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Sonde das Glas nicht berührt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Vorbereitung des Extruders für die Mikrobläschenkondensation

1. Montieren Sie den Hochdruckextruder wie in der Bedienungsanleitung beschrieben mit einem 200 nm Keramikfilter (vom Hersteller geliefert).
2. Stellen Sie den Extruder in die Mitte eines wasserdichten Behälters, damit das Probenauslassrohr nicht an die Seite gedrückt oder gekräuselt wird.
3. Koppeln Sie den Extruder mit dem vom Hersteller gelieferten Adapter an den Stickstoffgastank.
4. Machen Sie ein -2 °C gesalzenes Eisbad im wasserdichten Behälter um den Extruder mit 400 ml Wasser und 10 g Natriumchlorid.
5. Legen Sie das Ende des Auslassrohrs in eine Szintillationsflasche, um die extrudierte Probe zu sammeln.
   HINWEIS: Befestigen Sie das Röhrchen mit Klebeband am Behälter, wenn es nicht flach liegt oder in der Durchstechflasche bleibt.

4. Ansaugen des Extruders für Mikrobläschenkondensation

1. Öffnen und schließen Sie das Entriegelungsventil, um sicherzustellen, dass kein Druck im Extruder vorhanden ist.
2. Entfernen Sie den Kammerdeckel und geben Sie 5 ml 1x PBS in die Extruderkammer.
3. Setzen Sie den Deckel wieder ein und stellen Sie sicher, dass er wieder sicher einrastet.
4. Öffnen Sie den Stickstoffgastank, so dass das Manometer 250 psi anzeigt. Stellen Sie sicher, dass sich das Druckregelventil in der geschlossenen Position befindet.
5. Schließen Sie den Gastank und öffnen Sie das Einlassventil der Extruderkammer. Die PBS-Lösung wird durch das System und aus dem Probenauslassröhrchen in die Szintillationsfläschchen geschoben.
6. Wenn nur Gas aus dem Schlauch austritt, öffnen Sie das Entriegelungsventil und lassen Sie den Druck auf 0 psi fallen.
7. Entfernen Sie die Szintillationsfläschchen.

5. Vorkühlen von Mikrobläschen für die Extrusion

1. Öffnen und schließen Sie das Entriegelungsventil, um sicherzustellen, dass kein Druck im Extruder vorhanden ist. Legen Sie eine neue Szintillationsflasche an das Ende des Auslassrohrs.
2. Füllen Sie einen Stahlbehälter mit 2-Methylbutan und fügen Sie Trockeneis hinzu, um die Temperatur auf -18 ° C zu senken.
3. Geben Sie die Mikrobläschenlösung in das gekühlte 2-Methylbutan, so dass die Probe für 2 minuten eingetaucht wird. Bewegen Sie die Szintillationsflasche während der 2 Minuten, um die Blasen vorsichtig zu mischen. Fügen Sie nach Bedarf Trockeneis hinzu, um die Temperatur zwischen -15 und -18 °C zu halten. Achten Sie darauf, -20 °C nicht zu überschreiten, da sonst die Hilfsstofflösung gefriert und die Blasenprobe zerstört.
   HINWEIS: Die Schritte 5.2 und 5.3 können auch durch Abkühlen der Blasenprobe in einem Laborgefrierschrank über einen längeren Zeitraum erfolgen. Es ist jedoch Vorsicht geboten, die Temperatur des Gefrierschranks sorgfältig zu überwachen und das Einfrieren der Probe zu vermeiden.
4. Entfernen Sie nach 2 min die Mikrobläschen aus dem gekühlten 2-Methylbutan, schütteln Sie die Durchstechflasche vorsichtig, um die Mikrobläschen zu mischen, und verwenden Sie eine gekühlte 10-ml-Spritze, um die Lösung in den Extruder zu überführen.
5. Entfernen Sie den Deckel der Extruderkammer und geben Sie die Mikrobläschenlösung in die Kammer, indem Sie langsam den Kolben auf die Spritze drücken. Setzen Sie die Extruderkappe wieder ein, um sicherzustellen, dass sie wieder sicher einrastet.
6. Stellen Sie sicher, dass sich das Druckregelventil und das Ablassventil des Extruders in der geschlossenen Position befinden.
7. Öffnen Sie den Stickstoffgastank, bis das Manometer 250 psi anzeigt, schließen Sie den Gastank und drehen Sie das Druckregelventil in die geöffnete Position.
8. Wenn die Lösung die Szintillationsflasche am Ausgangsschlauch gefüllt hat und nur Gas aus dem Rohr austritt, öffnen Sie langsam das Druckentlastungsventil und lassen Sie den Druck auf 0 psi fallen.
9. Stellen Sie die Szintillationsflasche zur Aufbewahrung in ein Eisbad oder einen Kühlschrank.
10. Zur Langzeitlagerung und Minimierung der spontanen Verdampfung lagern Sie die Probe in einem Standardgefrierschrank. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur -20 °C oder höher ist, um ein Einfrieren der Probe zu vermeiden (die Hilfsstofflösung aus 20% PPG und 20% Glycerin verhindert, dass die Probe in den meisten Laborgefrierschränken gefriert).

6. Trennung von Tröpfchen von Liposomen durch Zentrifugation

1. 10 mL der extrudierten Tröpfchenlösung in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen.
2. Zentrifugieren Sie die extrudierte Probe bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C. Ein Pellet aus DFB-Nanotröpfchen wird am Boden des Röhrchens sichtbar sein (Abbildung 4). Spontan verdampfte Tröpfchen erscheinen an der Oberseite der Lösung und sollten verworfen werden.

Abbildung 4: Beispiel für phasenverschobene DFB-Tröpfchengranulation nach Zentrifugation. DFB-Nanotröpfchen sind dichter als Liposomen und sammeln sich am Boden des Zentrifugenröhrchens in einem Pellet (red box). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Pellet in 2 ml 1x PBS mit 20% Glycerin und 20% Propylenglykol.
4. Mischen Sie das Röhrchen vorsichtig, um eine homogene Lösung zu erhalten, und übertragen Sie die Tröpfchen auf ein kleineres 2-ml-Zentrifugenröhrchen.
5. Probe noch zweimal in 2 mL Zentrifugenröhrchen waschen.
6. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Pellet in 100 μL 1x PBS mit 20% Glycerin und 20% Propylenglykol und lagern Sie es auf Eis oder im Gefrierschrank, bis es benötigt wird.

7. Mikroskopische Überprüfung der Tröpfchenverdampfung

1. Stellen Sie eine verdünnte Tröpfchenlösung her, indem Sie 2,5 μl konzentrierte Tröpfchen zu 7,5 μl 1x PBS hinzufügen.
2. Bereiten Sie einen Objektträger mit 10 μl der verdünnten Probe vor. Beobachten Sie die Probe mit einem 40-fachen Objektiv und speichern Sie Bilder.
3. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Mikroskop und legen Sie ihn für 1 minute auf eine 65 °C warme Heizplatte, um Nanotröpfchen zu Mikrobläschen zu verdampfen.
4. Verwenden Sie das gleiche 40-fache Objektiv, um die Probe nach dem Erhitzen zu beobachten, um die Tröpfchenverdampfung zu überprüfen.

Representative Results

Discussion

Es steht eine umfassende Literatur zur Verfügung, die die Formulierung, Physik und mögliche Anwendungen von Mikrobläschen und Phasenverschiebungströpfchen für die In-vivo-Bildgebung und -Therapie diskutiert. Diese Diskussion bezieht sich explizit auf die Erzeugung von Lipid-Mikrobläschen und deren Umwandlung in Submikron-Phasenverschiebungströpfchen unter Verwendung eines DFB-Gases mit niedrigem Siedepunkt und einer Hochdruckextrusion. Die hier beschriebene Methode soll ein relativ einfaches Verfahren zur Herstellung großer Mengen an Lipidmikrobläschen und DFB-Phasenverschiebungströpfchen bieten, indem bisherige Mikroblasenkondensationsverfahren mit Tröpfchenextrusion in einem einzigen Schritt kombiniert werden. Diese Methode hat den Vorteil, dass hohe Konzentrationen von Blasen erzeugt werden, die zur Bildung von DFB-Tröpfchen mit engen Größenverteilungen basierend auf der Filterauswahl verwendet werden. Die enge Größenverteilung ist aufgrund der resultierenden konsistenten Probenverdampfungsschwellen signifikant. Diese Methode ist einfacher und kostengünstiger als andere gängige Methoden, die zum Generieren einer engen Größenverteilung verwendet werden. Darüber hinaus ist das potenzielle Lösungsvolumen größer als bei anderen vergleichbaren Methoden. Das Protokoll kann in drei Hauptkategorien unterteilt werden: (1) Erzeugung von Lipidmikrobläschen, (2) Kondensieren und Extrudieren von Mikrobläschen, (3) Trennen von Phasenverschiebungströpfchen von Liposomen durch Zentrifugation.

Die Erzeugung von Mikroblasen mit Hilfe der Sondenspitzen-Beschallung ist eine der gebräuchlichsten Methoden zur Herstellung von Lipid-Mikroblasen. Es gibt viele Publikationen, die dieses Vorgehen beschreiben. Dieses Protokoll wurde von Feshitan et ^al.11 adaptiert und optimiert, um 10 ml Mikrobläschenlösung herzustellen, was der maximalen Kapazität des Tischextruders entspricht. Diese Methode kann auch skaliert werden, um größere Mengen an Lipid-Mikrobläschenlösung zu erzeugen, indem der Mikrospitzenanhang entfernt und das Lipidlösungsvolumen auf 100 ml oder mehr erhöht wird, wie feshitan et ^al11 gezeigt. Ebenso können größere Extruder im kommerziellen Maßstab, die Volumina von 100 ml bis 800 ml aufnehmen, verwendet werden, um erhöhte Mikroblasenvolumina aufzunehmen und so die Tröpfchenproduktion zu maximieren. Die Ergebnisse der Methode sind nur durch die verwendete Ausrüstung begrenzt, die modifiziert werden kann, um das Volumen entsprechend zu erhöhen. Die größengefilterte Tröpfchenproduktion ist aufgrund gleichmäßigerer Verdampfungsschwellen für verschiedene Anwendungen von Vorteil. Zukünftige Änderungen am Protokoll könnten vorgenommen werden, um die Ergebnisse für spezifische Bedürfnisse zu individualisieren, wie z.B. die Funktionalisierung der Mikroblasen- und Tröpfchenschalen für die Antikörperbeladung und das molekulare Targeting.

Das hier verwendete Extrusionsverfahren wird üblicherweise für die monodispersierte Liposomenpräparation verwendet. Ein ähnliches Verfahren wurde in der Vergangenheit auch zur Erzeugung von Phasenverschiebungströpfchen unter Verwendung von DDFP-Tröpfchen mit höherem Siedepunkt ^verwendet17. Es gibt einige kritische Unterschiede in dieser beschriebenen Methodik, nämlich (1) die Erzeugung von vorgeformten Mikrobläschen mit Gasen mit niedrigem Siedepunkt (DFB), (2) die Kühlung der Blasenlösung und des Extrudersystems zur effizienten Bildung von Tröpfchen und (3) die schnelle Anwendung von Druck, um die Tröpfchenkondensationseffizienz zu maximieren und die Auflösung von Blasengas zu ^vermeiden10.

Die Kühlung der Mikrobläschenprobe für die Extrusion ist ein kritischer Schritt bei der Erzeugung hoher Konzentrationen stabiler DFB-Tröpfchen. Bei diesem Protokoll wird der gesamte Extruder in ein salzhaltiges Eisbad gegeben und bei -2 °C gehalten. Der Extruder verfügt über Ein- und Auslasskanäle für die zirkulierende Flüssigkeit, um eine effizientere und schnellere Kühlung zu ermöglichen, was eine Umwälzpumpe erfordert. Für die DFB-Tröpfchenproduktion können hohe Tröpfchenkonzentrationen (1011-1012 Tröpfchen/ml) ohne zirkulierendes Wassersystem erzeugt werden. Es wird jedoch erwartet, dass die Effizienz der Tröpfchenproduktion durch die Einbeziehung eines kalten Umlaufbades noch weiter verbessert werden könnte, wodurch die Wartezeit für die Kühlung verkürzt würde. Genau dieses Protokoll wurde auch für OFP-Mikroblasen verwendet. Interessanterweise schienen die OFP-Blasen zahlreicher und kleiner zu sein, wenn sie mit Mikroskopie beobachtet wurden (Abbildung 9), obwohl die Tröpfchenausbeute nach dem Waschen und Sammeln des Pellets merklich geringer ist. Eine weitere Kühlung des Extruders und eine Erhöhung des Drucks aus dem Stickstofftank würde wahrscheinlich die OFP-Tröpfchenproduktion verbessern. OFP-Tröpfchen sind auch notorisch instabil und erfordern eine schonende Handhabung und geeignete Lagerbedingungen, um die spontane Verdampfung zu minimieren.

Die schnelle Anwendung von Druck ist ein weiterer kritischer Schritt in diesem Verfahren. Die Verwendung der Extrusion in diesem Protokoll hängt von einem Druckaufbau und der sofortigen Anwendung dieses Drucks auf die Mikrobläschen in der Extruderkammer ab. Bei Standard-Lipidextrusionsprotokollen wird der Druck langsam erhöht, bis die Probe beginnt, den Membranfilter zu passieren. Experimentelle Beobachtungen zeigten, dass eine langsame Druckanlegenheit zu einer Gasauflösung aus dem Blasenkern führen kann, anstatt zu kondensieren von Blasen zu Tröpfchen. Daher wurde beschlossen, die Extrudereinlassrohre mit Stickstoffgas zu “grundieren”, indem das Gaseinlassventil geschlossen und der Tankdruck auf 250 psi eingestellt wurde. Der Tank muss dann abgeschaltet werden, bevor das Einlassventil zum Extruder geöffnet wird. Die Nichtbeachtung dieses Teils des Verfahrens führt zu einem schnellen Ausstoß und Verlust der Probe aus dem Auslass des Extruders. Drücke über 250 psi können aufgrund des schnellen Ausstoßes der Probe auch zu Probenverlusten führen, selbst wenn der Tank ordnungsgemäß geschlossen wurde. Bei der Vorbereitung, beim Ausführen von Schritten oder bei der Verwendung des Extruders in irgendeiner Weise sollte darauf geachtet werden, dass Manometer und Ventile überprüft werden. Wenn der Druck nicht auf Null fällt oder die Lösung den Extruder nicht wie erwartet verlässt, überprüfen Sie zunächst, ob sich alle Ventile in der richtigen Position befinden. Das Druckentlastungsventil kann immer geöffnet werden, um den Druck abzulassen, ohne den Kammerinhalt zu beeinträchtigen. Es ist auch wichtig, auf austretendes Gas zu achten und die Manometer zu beobachten, wenn der Druck auf den Extruder ausgeübt wird. Im Allgemeinen, wenn Druck ausgeübt wird, dann wird entweder die Lösung beginnen, aus dem Ausgangsschlauch zu kommen, oder es gibt ein Leck im System. Stellen Sie immer sicher, dass Sie das System vorbereiten, um sicherzustellen, dass der Extruder korrekt montiert ist, bevor Sie eine Mikroblasenlösung in die Kammer geben. Im Laufe der Zeit können die O-Ringe verschleißen und verhindern, dass das System korrekt abdichtet. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass alle Teile ordnungsgemäß funktionieren und eine dichte Abdichtung entsteht. In dem hier beschriebenen Protokoll wurde nur eine einzige Extrusion durchgeführt. Es ist möglich, die Größenverteilung weiter einzugrenzen, indem die Tröpfchenprobe wieder in den Extruder eingeführt und mehrere Extrusionsschritte (typischerweise zwischen 5 und 10) durchgeführt werden. Mehrfachextrusion wird wahrscheinlich die Gesamtausbeute an Tröpfchen reduzieren. Angesichts der Größenverteilungen von DLS und TRSP ist eine einzige Extrusion für die meisten Anwendungen wahrscheinlich ausreichend. Schließlich wurde dieses Protokoll für 200-nm-Filter optimiert. Die Drücke müssten wahrscheinlich für größere oder kleinere Filtergrößen optimiert werden.

Nachdem die Probe erfolgreich extrudiert wurde, sollte sie getestet werden, um zu überprüfen, ob die Blasen ordnungsgemäß zu Tröpfchen kondensiert wurden. Submikron-Tröpfchen sind mit Standard-Lichtbildgebungsverfahren nicht sichtbar, daher müssen sie zuerst verdampft werden, um sichtbarer zu ^werden6. Es ist immer noch wichtig, die Probe vor der Verdampfung abzubilden, um das Fehlen von Mikrobläschen zu überprüfen oder den Grad der spontanen Verdampfung vor dem Erhitzen der Tröpfchen zu bestimmen. Imaging-Software kann verwendet werden, um die Mikroblasen im Bild zu zählen und zu dimensionieren, um indirekt Daten über die Nanotröpfchen bereitzustellen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass sich die Blasen nach der Verdampfung während der Erwärmung schnell zusammensetzen. Daher spiegeln die Blasengröße und die Anzahl aus der Mikroskopieanalyse wahrscheinlich nicht die anfänglichen Tröpfchengrößen und -konzentrationen wider. Direkte Messungen der Tröpfchenverteilung und -konzentration werden am besten mit abstimmbarer resistiver Pulserfassung (TRPS) durchgeführt, sofern verfügbar. Repräsentative Droplet-Verteilungsdaten von TRSP wurden bereitgestellt (Abbildung 6).

Materials

15 mL Centrifuge Tubes	Falcon	352095	Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter	Whatman	110606	Extruder filters
2-methylbutane	Fisher Chemical	03551-4	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2	Fisher	02-217-002	Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn	Branson	101-063-198R	Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-4	Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice	–	–	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Component of lipid film
General Thermometer	–	–	Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes	Hamilton	81139	Used to mix lipids in chloroform
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block	VWR Scientific Products		Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder	Evonik		Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer	Fisher brand	14-955-151	Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank	–	–	Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific		Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk	Whatman	230600	Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps	Fisher Scientific	298417	Used for solution storage
Propylene Glycol	Fisher Chemical	P355-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer	–	–	Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container	Medegen	79310	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube	Fisher	02682004	Used for concentrating nanodroplets