Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung großer Mengen lipidverkapselter Decafluorbutan-Mikrobläschen mittels Sondenspitzen-Beschallung und anschließender Kondensation zu phasenverschobenen Nanotröpfchen mittels Hochdruckextrusion und mechanischer Filtration.
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Methodenartikel
Herstellung von membrangefilterten Phase-Shift-Decafluorbutan-Nanotröpfchen aus vorgeformten Mikrobläschen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es gibt viele Methoden, die zur Herstellung von verdampfbaren Phasenverschiebungströpfchen für die Bildgebung und Therapie verwendet werden können. Jede Methode verwendet unterschiedliche Techniken und variiert in Preis, Material und Zweck. Viele dieser Herstellungsmethoden führen zu polydispersen Populationen mit ungleichmäßigen Aktivierungsschwellen. Darüber hinaus erfordert die Kontrolle der Tröpfchengrößen typischerweise stabile Perfluorcarbonflüssigkeiten mit hohen Aktivierungsschwellen, die in vivo nicht praktikabel sind. Die Herstellung einheitlicher Tröpfchengrößen unter Verwendung von Gasen mit niedrigem Siedepunkt wäre für In-vivo-Bildgebungs- und Therapieexperimente von Vorteil. Dieser Artikel beschreibt eine einfache und wirtschaftliche Methode zur Bildung von größengefilterten lipidstabilisierten Phasenverschiebungs-Nanotröpfchen mit niedrig siedendem Decafluorbutan (DFB). Eine gängige Methode zur Erzeugung von Lipid-Mikrobläschen wird beschrieben, zusätzlich zu einer neuartigen Methode, sie mit Hochdruckextrusion in einem einzigen Schritt zu kondensieren. Diese Methode wurde entwickelt, um Zeit zu sparen, die Effizienz zu maximieren und größere Mengen an Mikroblasen- und Nanotröpfchenlösungen für eine Vielzahl von Anwendungen mit gängigen Laborgeräten zu erzeugen, die in vielen biologischen Labors zu finden sind.
Einleitung
Ultraschall-Kontrastmittel (UCAs) werden für Bildgebungs- und Therapieanwendungen immer beliebter. Mikroblasen, die ursprünglichen UCAs, sind derzeit die Mainstream-Wirkstoffe, die in klinischen diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Mikrobläschen sind gasgefüllte Kugeln mit einem Durchmesser von typischerweise 1-10 μm, die von Lipid-, Protein- oder Polymerhüllen umgeben sind1. Ihre Größe und In-vivo-Stabilität können jedoch ihre Funktionalität in vielen Anwendungen einschränken. Phasenverschobene Nanotröpfchen, die einen überhitzten flüssigen Kern enthalten, können einige dieser Einschränkungen aufgrund ihrer geringeren Größe und verbess....
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Protokoll
1. Lipidfilme herstellen
- Bereiten Sie Lipidfilme für die Mikrobläschenerzeugung mit 90% DSPC und 10% DSPE-PEG2K vor, indem Sie die Lipide im richtigen Verhältnis unter Verwendung der folgenden Anweisungen mischen:
- Herstellung von Stammlipiden aus DSPC und DSPE-PEG2K in Chloroform. Wiegen Sie 50 mg jedes Lipidpulvers in separaten Fläschchen. Geben Sie 1 ml Chloroform in jede Durchstechflasche mit einer 1 ml Glasspritze.
- Geben Sie 287 μL DSPC-Material und 113 μL DSPE-PEG2K-Material (beide 50 mg/ml) mit einer Glasspritze in eine 20-ml-Szintillationsflasche.
- Trocknen Sie die gemischten Lipide, um Chloroform mit Stickstoff zu entfern....
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Ergebnisse
Repräsentative Ergebnisse der Größenverteilung sind unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung (DLS) und der abstimmbaren resistiven Pulserfassung (TRSP) enthalten. Abbildung 5 zeigt die Größenverteilung von kondensierten Blasenlösungen mit und ohne Extrusion. Ohne Extrusion endet das Protokoll bei Schritt 5.3. Die gekühlten Blasen werden kondensiert, indem die Probe kalt auf Atmosphärendruck entlüftet wird. Die kondensierte einzige Probe hat eine viel breitere Verteilung in der Nähe von.......
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Diskussion
Es steht eine umfassende Literatur zur Verfügung, die die Formulierung, Physik und mögliche Anwendungen von Mikrobläschen und Phasenverschiebungströpfchen für die In-vivo-Bildgebung und -Therapie diskutiert. Diese Diskussion bezieht sich explizit auf die Erzeugung von Lipid-Mikrobläschen und deren Umwandlung in Submikron-Phasenverschiebungströpfchen unter Verwendung eines DFB-Gases mit niedrigem Siedepunkt und einer Hochdruckextrusion. Die hier beschriebene Methode soll ein relativ einfaches Verfahren zur Herstellung gro.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken Dominique James im Labor von Dr. Ken Hoyt für die TRSP-Analyse von verdampfbaren Phasenverschiebungs-Nanotröpfchen
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 15-ml-Zentrifugenröhrchen | Falcon | 352095 | Sammeln und Zentrifugieren von Tröpfchen |
| 200-nm-Polycarbonatfilter | Whatman | 110606 | Extruderfilter |
| 2-Methylbutan | Fisher Chemical | 03551-4 | Schnelles Vorkühlen der Mikroblasenlösung vor der Extrusion |
| 3-Zinken-Klemmen X2 | Fisher | 02-217-002 | Halten von Szintilationsfläschchen an Ort und Stelle für die Sondenspitzenbeschallung |
| 400W Analoger Sondenspitzen-Ultraschallator mit Horn | Branson | 101-063-198R | Wird verwendet, um Lipid-Mikrobläschen aus Lipidlösung zu erzeugen |
| Bad-Ultraschallgerät Fisher | Scientific | 15337402 | Wird verwendet, um Liposomen in unilamellare Vesikel aufzuspalten |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Wird verwendet, um Lipidfilme für die Mikroblasenvorbereitung |
| herzustellenDecafluorbutan (Perfluorbutan) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | Erzeugung von Mikrobläschen durch Sondenspitzenbeschallung |
| Trockeneis | - | Schnelle Vorkühlung der Mikroblasenlösung vor der Extrusion | |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Bestandteil des Lipidfilms |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Bestandteil des Lipidfilms |
| Allgemeines Thermometer | - | Zur Messung der Temperatur im Eisbad und der Temperatur von 2-Methylbutan (muss Temperaturen von -20 °C aufnehmen) | |
| Glasspritzen | Hamilton | 81139 | Zum Mischen von Lipiden in Chloroform |
| Glycerin | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduziert die Gefriertemperatur der PBS-Lösung |
| Heizblock | VWR Scientific Produkte | Erhitzen von Lipidfilmen und Verdampfen von Tröpfchen | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Kommerzielles Hochdruck-Extrusionssystem | |
| Mini Vortex Mixer | Marke Fisher Marke | 14-955-151 | Wird verwendet, um überschüssiges Chloroform von Lipidfilmen zu entfernen |
| Stickstofftank | - | Wird zum Betrieb des Extruders | |
| Phosphatpuffer Kochsalzlösung | Fisher Scientific | Hydrate Lipidfilme und Waschtröpfchen | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Bietet Unterstützung für Polycarbonatfilter |
| Polypropylen-Kappen | Fisher Scientific | 298417 | Wird zur Lösungslagerung verwendet |
| Propylenglykol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduziert die Gefriertemperatur von PBS-Lösung |
| Szintiliationsfläschchen | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Wird für Lipidfilme und Mikroblasenbildung |
| verwendet Klein Hammer | - | Wird verwendet, um Trockeneis zum Kühlen von Methylbutan aufzubrechen | |
| Ultraschallgerät Mikrospitzenaufsatz | Branson | 101148070 | Wird verwendet, um Mikroblasen aus Lipidlösung zu erzeugen |
| Stahlbehälter | Medegen | 79310 | Schnelle Vorkühlung der Mikroblasenlösung vor der Extrusion (jeder Behälter, der für -20 ° C ausgelegt ist, funktioniert) |
| Vakuum-Exsikkator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Entfernt überschüssiges Chloroform von Lipidfilmen |
| 2 ml Zentrifugenröhrchen | Fisher | 02682004 | Wird zur Konzentration von Nanotröpfchen verwendet |
Referenzen
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
