Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern derselben Spezies zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Zusammenfassung

Hier beschreibt das Protokoll, wie man eine doppelte Markierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von primären Antikörpern durchführt, die in derselben Spezies aufgezogen wurden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Es kann auch den dritten Antikörper von einem anderen Wirt in diesem Protokoll enthalten. Dieser Ansatz kann in jedem Zelltyp und Pathogen durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Heutzutage ist es möglich, eine breite Palette von molekularen Werkzeugen zu finden, um Parasiten-Wirts-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Es bestehen jedoch einige Einschränkungen, um kommerzielle monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erhalten, die spezifische Zellstrukturen und Proteine in Parasiten erkennen. Außerdem gibt es nur wenige kommerzielle Antikörper zur Kennzeichnung von Trypanosomatiden. Normalerweise werden polyklonale Antikörper gegen Parasiten im eigenen Haus hergestellt und könnten in Kombination mit anderen Antikörpern, die in derselben Spezies produziert werden, schwieriger zu verwenden sein. Hier zeigt das Protokoll, wie polyklonale und monoklonale Antikörper, die in derselben Spezies gezüchtet wurden, verwendet werden, um eine Doppeltemarkierung der Immunfluoreszenz durchzuführen, um wirtszell- und pathogeninteraktionen zu untersuchen. Um die doppelmarkierende Immunfluoreszenz zu erreichen, ist es entscheidend, zuerst den polyklonalen Antikörper der Maus zu inkubieren und dann die Inkubation mit dem sekundären Maus-IgG-Antikörper zu verfolgen, der mit einem beliebigen Fluorochrom konjugiert ist. Danach ist ein zusätzlicher Blockierungsschritt notwendig, um zu verhindern, dass spuren des primären Antikörpers vom nächsten sekundären Antikörper erkannt werden. Dann werden ein monoklonaler Maus-Antikörper und sein spezifischer sekundärer IgG-Unterklasse-Antikörper, der an ein anderes Fluorochrom konjugiert ist, zu den geeigneten Zeitpunkten in die Probe gegeben. Darüber hinaus ist es möglich, eine dreifache Markierung der Immunfluoreszenz mit einem dritten Antikörper durchzuführen, der in einer anderen Spezies aufgezogen wurde. Auch Strukturen wie Kerne und Aktin können anschließend mit ihren spezifischen Verbindungen oder Markierungen gefärbt werden. Somit können diese hier vorgestellten Ansätze für jede Zelle angepasst werden, deren Primärantikörperquellen begrenzt sind.

Einleitung

Die Untersuchung der Interaktion des Erregers mit der Wirtszelle auf zellulärer Ebene liefert wesentliche Informationen über die zugrunde liegenden Ursachen der Krankheit, da verschiedene Gruppen wie Viren, Bakterien und Protozoen die meisten Wirtszelltypen infizieren können1,2,3,4. Es kann auch dazu beitragen, potenzielle therapeutische Ziele zu entwickeln und zu identifizieren, die das Wachstum des Erregers verlangsamen oder hemmen können. Unter Lebensbedingungen sind die produzierten Antikörper für die Erkennung von Selbstkomponenten, Ant....

Protokoll

1. Zell- und Parasitenkulturen

1. Züchten Sie LLC-MK2 -Zellen (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) aus der American Type Culture Collection (CCL-7) in einem 25 ^cm2 Zellkulturkolben, der in RPMI-Medium enthalten ist, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS (Fetal Bovine Serum) und Antibiotika (100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) bei 37 ° C in 5% _CO2 ¹⁷.
2. Infizieren Sie LLC-MK2-Zellen mit Trypanosoma cruzi (Y-Stamm) gemäß einem früheren Protokoll ¹⁸.
3. Sammeln Sie den Überstand der LLC-MK2-infizierten Zellen (5 ml) in einem konischen Zentrifugenröhrchen mit....

Ergebnisse

Hier zeigen wir, wie wir Wirt-Parasiten-Interaktionen durch Immunfluoreszenz untersuchen können, wenn die Quelle von Antikörpern aufgrund der Nichtverfügbarkeit kommerzieller Antikörper, die spezifische Strukturen und Proteine in Trypanosomatiden erkennen, begrenzt ist.

Unter den Trypanosomatiden hat T. cruzi einen der komplexesten Lebenszyklen mit verschiedenen Entwicklungsstadien zwischen Wirbeltieren und wirbellosen Wirten ¹⁹. Während des Lebenszyklus vo.......

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung einer doppelten Immunmarkierung in mit Trypanosoma cruzi infizierten Zellen mit zwei verschiedenen Antikörpern derselben Wirtsspezies vor. Um die Auswirkungen der Infektion genauer zu untersuchen, können Strukturen in der Wirtszelle wie der Zellkern oder zytosolische Organellen mit diesem Protokoll markiert werden. Es kann auch in der Post-Embedding-Dünnschnitt-Immunogold-Markierungsmethode verwendet werden. Dieser Ansatz hilft, das Hindernis zu überwinden, nur wen.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 488 - IgG2b Antikörper	Life technologies, USA	A21141	Ziege Anti-Maus
AffiniPure Rabbit Anti-Maus IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	Anti-Maus-Antikörper
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) Antikörper	Life technologies, USA	A11017	Ziege Anti-Maus
Alexa Fluor 594 IgG1 Antikörper	Life technologies, USA	A21125	Ziegen-Anti-Maus-Antikörper
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) Antikörper	Life technologies, USA	A21237
IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	Maus-Antikörper
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ-Protein) Antikörper	Unser Labor	Hauseigener	Maus-Antikörper
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	Albumin-Protein-Detergens
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	Nichtionisches Detergens
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	Serum
Penicillin Streptomycin	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	Antibiotikum
Phalloidin Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	Aktin-Marker
ProLong Gold Antifade mit DAPI	Life-Technologien, USA	P36935	Eindeckmedien-Reagenz
RPMI 1640 1X mit L-Glutamin	Corning, USA	10-040-CV	Zellkulturmedien
Trypsin-EDTA-Lösung	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	Bioreagenz