Methodenartikel

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

DOI:

10.3791/62221

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26. Juli 2022

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1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-konformen Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit unter Verwendung eines 3D-Bioreaktors.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen, die von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) abgesondert werden, wurden als vielversprechende Kandidaten für Knorpelverletzungen und die Behandlung von Arthrose vorgeschlagen. Exosomen für die klinische Anwendung erfordern eine großtechnische Produktion. Zu diesem Zweck wurden humane Synovialflüssigkeits-MSCs (hSF-MSCs) auf Mikroträgerperlen gezüchtet und dann in einem dynamischen dreidimensionalen (3D) Kultursystem kultiviert. Durch die Verwendung einer dynamischen 3D-Kultur gelang es diesem Protokoll, großräumige Exosomen aus SF-MSC-Kulturüberständen zu erhalten. Exosomen wurden durch Ultrazentrifugation geerntet und durch ein Transmissionselektronenmikroskop, Nanopartikel-Transmissionsassay und Western Blotting verifiziert. Auch die mikrobiologische Sicherheit von Exosomen wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse des Exosomennachweises deuten darauf hin, dass dieser Ansatz eine große Anzahl von GMP-Exosomen (Good Manufacturing Practices) hervorbringen kann. Diese Exosomen könnten in der Exosomenbiologie und der klinischen Arthrosebehandlung verwendet werden.

Einleitung

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Osteoarthritis (OA), die aus Gelenkknorpel und darunterliegendem Knochenabbau resultiert, bleibt eine schwere Herausforderung, die zu Behinderungen führt 1,2. Ohne Blut- und Nervenversorgung ist die Selbstheilungsfähigkeit des Knorpels minimal, sobald er verletzt ist 3,4. In den letzten Jahrzehnten haben Therapien, die auf autologer Chondrozytenimplantation (ACI) basieren, einige Fortschritte in der OA-Behandlung gemacht5. Für die Isolierung und Expansion von Chondrozyten ist die Ernte kleiner Knorpel aus dem nicht belastenden Bereich des OA-Gelenks erforderlich, was zu Verletzungen des Knorpels führt. Außerdem erfordert das Verfahren eine zweite Operation, um die expandierten Chondrozyten zu implantieren6. Daher werden einstufige Therapien für die OA-Behandlung ohne Knorpelverletzungen intensiv erforscht.

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als vielversprechende Alternativen für die OA-Behandlung vorgeschlagen 7,8. MSCs stammen aus mehreren Geweben und können sich mit spezifischer Stimulation in Chondrozyten differenzieren. Wichtig ist, dass MSCs Immunantworten über entzündungshemmende Mittel modulieren können9. Daher haben MSCs signifikante Vorteile bei der OA-Behandlung, indem sie Knorpeldefekte reparieren und die Immunantwort modulieren, insbesondere im Entzündungsmilieu. Für die OA-Behandlung haben MSCs aus Synovialflüssigkeit (SF-MSCs) in letzter Zeit aufgrund ihrer stärkeren Chondrozytendifferenzierungsfähigkeit als andere MSC-Quellen viel Aufmerksamkeit erregt10,11. Insbesondere in der orthopädischen Klinik ist die Extraktion von entzündlicher SF aus der Gelenkhöhle eine Routinetherapie zur Linderung der Schmerzsymptome von OA-Patienten. Extrahierte entzündliche SF wird normalerweise als medizinischer Abfall entsorgt. Sowohl Patienten als auch Ärzte sind bereit, autologe MSCs, die aus der entzündlichen SF isoliert wurden, als OA-Behandlung mit sehr wenigen ethischen Konflikten in Betracht zu ziehen. Die SF-MSC-Therapie ist jedoch aufgrund von tumorigenen Risiken, Langzeitlagerung und entfernten Transportbarrieren beeinträchtigt.

Exosomen, die von vielen Zelltypen, einschließlich MSCs, sezerniert werden, tragen die meisten Bioinformationen der Elternzelle. Es wurde eingehend als zellfreie Therapieuntersucht 12,13. Laut den aktualisierten Ressourcen, die auf der Website der Regierung für klinische Studien (ClinicalTrials.gov) verfügbar sind, werden umfangreichere klinische Exosomenstudien in den Forschungsbereichen Krebs, Bluthochdruck und neurodegenerative Erkrankungen initiiert und durchgeführt. Die SF-MSC-Exosomenbehandlung könnte eine aufregende und herausfordernde Studie sein, um mit OA fertig zu werden. Good Manufacturing Practice (GMP)-Qualität und großflächige Exosomenproduktion sind für die klinische Translation unerlässlich. Die Exosomenisolierung in kleinem Maßstab wurde auf der Grundlage einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur durchgeführt. Großflächige Exosomenproduktionsstrategien müssen jedoch optimiert werden. In dieser Studie wurde eine groß angelegte Exosomenherstellungsmethode entwickelt, die auf einer massiven SF-MSC-Kultur unter xenofreien Bedingungen basiert. Nach Ultrazentrifugation aus Zellkulturüberständen wurden die Sicherheit und Funktion von Exosomen validiert.

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Protokoll

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Diese Studie wurde vom Human Ethics Committee des Shenzhen Second People's Hospital genehmigt. Ein schematisches Diagramm der aus hSF-MSCs isolierten Exosomen im vitro-Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Kultur und Identifikation menschlicher SF-MSCs

  1. Ernten Sie 20 ml SF mit einer Spritze und Nadel von klinischen OA-Patienten.
    1. Desinfizieren Sie das Kniegelenk des OA-Patienten. Punktion von der Quadrizeps femoris-Sehne außerhalb der Patella in die Gelenkhöhle mit einer 7 # Nadel.
    2. Extrahieren Sie 10 ml der Gelenkflüssigkeit. Die Einstichstelle mit dem Transfusionsstift abdecken und 5 min drücken.
  2. Der SF-Überstand ist nach der Zentrifugation bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C zu verwerfen.
  3. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 mL 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS), zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C und verwerfen Sie das PBS.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml humanem MSC-Kulturmedium bei einer Zelldichte von 5 x 104 Zellen/ml (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Suspension dann in einer 100-mm-Schale.
  5. Die Schale wird bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2 inkubiert.
  6. Nach 48 h die nicht adhärenten Zellen durch Mediumwechsel entfernen und mit 1x PBS waschen. Ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage für 2 Wochen.
  7. Sammeln Sie die Zellkulturüberstände.
  8. Identifizieren Sie SF-MSCs mittels Durchflusszytometrie.
    1. Aufschluss der dritten Generation (P3) von SF-MSCs, Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie das Zellpellet.
      HINWEIS: Eine Passage wird als Subkultur der Zellen zu einer anderen Kulturschale erkannt. Die aus SF isolierten und auf Schalen ausgesäten Primärzellen werden als Durchgang Null (P0) bezeichnet. Bei etwa 75% Zusammenfluss werden die Zellen verdaut und vom Geschirr getrennt, auf anderen Schalen ausgesät und als P1 gekennzeichnet.
    2. 400 μL Blockierpuffer (1% BSA in 1x PBS) in das Zellpellet (5 x 104) geben und 15 min bei Raumtemperatur (RT) stehen lassen.
    3. Bei 1.000 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet in 100 μL 1x PBS resuspendieren.
    4. 1 μL monoklonaler fluoreszierender Antikörper CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (Verdünnungsverhältnis 1:100) (siehe Materialtabelle) pro Röhrchen zugeben und bei RT für 30 min inkubieren.
    5. Zweimal mit 1x PBS waschen und den Überstand entsorgen. Sammeln Sie das Zellpellet und resuspendieren Sie es in 100 μL 1x PBS.
    6. Detektieren Sie auf einem Durchflusszytometer bis zu 10.000 Zellen mit Filtern von 525/50 und 585/40, um die Fluorophore zu erkennen.

2.3D Bioreaktor-Zellkultur

  1. Mikroträger-Vorbereitung
    1. Die trockenen 0,75 g Mikroträger quellen lassen (siehe Materialtabelle) und hydratisieren Sie 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 ml/g Mikroträger) für mindestens 3 h bei RT.
    2. Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie die Mikroträger für 5 min in frischem DPBS (50 ml/g Mikroträger). Entsorgen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch frisches 1x DPBS (50 ml/g Mikroträger).
    3. Sterilisieren Sie die Mikroträger durch Autoklavieren (121 °C, 15 min, 15 psi). Lassen Sie die sterilisierten Mikroträger absetzen, dekantieren Sie den Überstand.
    4. Spülen Sie die Mikroträger kurz im Kulturmedium (50 ml/g Mikroträger) bei RT. Lassen Sie die Mikroträger absetzen, verwerfen Sie den Überstand.
  2. Perfusionsbioreaktor
    1. Sterilisieren Sie den Bioreaktor durch Autoklavieren (121 °C, 15 min, 15 psi).
    2. Zählen Sie die Anzahl der SF-MSCs und weisen Sie dem Bioreaktor, der mit GMP-fähigem MSC-Kulturmedium (250 ml) perfundiert ist, 2,5 x 107 SF-MSCs und Mikroträger zu.
    3. Den Bioreaktor in einen Inkubator mit 5%CO2 bei 37 °C geben. Drehen Sie den Bioreaktor mit einer Drehzahl von 15 U/min. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 6 Tage.
    4. Sammeln Sie die Zellkulturüberstände und Mikroträger für die weitere Analyse nach der Kultur für 14 Tage.

3. Identifizierung von Exosomen und Sicherheitsnachweis

  1. Ultrazentrifugation
    1. Zentrifugieren Sie den Zellkulturüberstand bei 300 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand; Entsorgen Sie die Zelltrümmer.
    2. Zentrifugieren Sie die Überstände bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand; Verwerfen Sie die größeren Vesikel (apoptotische Körper und einige größere Mikrovesikel).
    3. Zentrifugieren Sie den Überstand erneut bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C, um größere Vesikel zu entfernen; Sammeln Sie die Pellets und resuspendieren Sie sie in 40 ml 1x PBS.
    4. Zentrifugieren Sie die resuspendierten Pellets bei 120.000 x g für 70 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets, die Exosomen enthalten, in 500 μL 1x PBS.
  2. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
    HINWEIS: Für jeden Durchlauf wurden 500 μL der Probe mit einer Durchflussrate von 30 μL/min in die Kammer injiziert. Führen Sie die Analyse bei 24,4 °C-24,5 °C durch.
    1. Die frisch isolierten Exosomenproben werden mit sterilem 1x PBS auf 1 ml mit 107-10 9 /ml Partikeln verdünnt und in das Nanopartikel-Tracking-Analysesystem injiziert (siehe Materialtabelle).
    2. Stellen Sie das Erfassungs- und Analysesystem manuell gemäß dem Protokoll des Herstellers ein. Visualisieren Sie die Partikel durch Laserlichtstreuung und erfassen Sie ihre Brownsche Bewegung auf digitalem Video.
    3. Analysieren Sie die aufgezeichneten Videobänder mit Software (siehe Materialtabelle), basierend auf der Verfolgung von mindestens 200 einzelnen Partikeln pro Lauf.
  3. Transmissionselektronenmikroskopie
    1. Fixieren Sie die Exosomen in 4% Paraformaldehyd (in kaltem 1x DPBS) für 5 min.
    2. Montieren Sie 5 μL der Exosomen auf Kupfergittern. In diesem Experiment beträgt die Konzentration der Exosomen 1 mg/ml, quantifiziert durch ein Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
    3. Die Exosomen in 3% Phosphowolframsäure für 10 min auf Eis einbetten. Entfernen Sie die überschüssige Säure und trocknen Sie die Proben bei RT.
    4. Stellen Sie die Exosomenproben mit einem TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV vor.
  4. Western Blotting
    1. 300 μL Lysepuffer (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) und Proteaseinhibitor-Cocktail (siehe Materialtabelle) zu den Exosomen hinzufügen.
    2. Mischen Sie die Exosomen im Lysepuffer, indem Sie auf und ab pipettieren und 20 min auf Eis stehen lassen.
    3. Die Mischung bei 9.391 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
    4. 100 μL 4x Proteinladepuffer zugeben und 10 min bei 100 °C erhitzen.
    5. Laden Sie 15 μL Proteine in einer Konzentration von 10 mg/ml und laufen durch Gelelektrophorese (120 V, 70 min) und Elektroblotting bei 100 V, 60 min bei 4 °C.
    6. Nachweis der nicht-exosomenspezifischen Marker (Calnexin) und exosomalen Biomarker (CD9, CD63 und CD81) durch fluoreszierendes Western Blotting (siehe Materialtabelle).
  5. Sicherheitsprüfung
    1. Für den Nachweis von Bakterien, Pilzen und Mycobacterium tuberculosis folgen Sie den Schritten 3.5.2-3.5.5.
    2. 100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) werden auf eine Blutagarkulturplatte gesät (siehe Materialtabelle) und die Kulturplatte bei 37 °C für 24 h inkubiert.
    3. 100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) auf eine Sabouraud-Agar-Mediumplatte (siehe Materialtabelle) ausgesät und bei 35 °C 48 h inkubiert.
    4. 100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) auf einer Lowenstein-Jensen-Kulturmediumplatte (siehe Materialtabelle) ausgesät und 3 Wochen bei 37 °C inkubiert.
    5. Erkennen Sie das Auftreten von Bakterien, Pilzen und Mycobacterium tuberculosis-Kolonien durch makroskopische Beobachtung.
      HINWEIS: Kriterien für die Bewertung der Sicherheit von Exosomen sind das Fehlen von Mikroorganismen auf der Kulturplatte.
    6. Führen Sie für den Mykoplasmennachweis die Schritte 3.5.7-3.5.9 aus.
    7. Resuspendieren Sie die Exosomen in 50 μL Pufferlösung, die im Kit enthalten ist, und erhitzen Sie sie bei 95 °C für 3 min.
    8. Amplifizieren Sie das Mykoplasma in Exosomenlösung mit einem PCR-Mykoplasmen-Detektionskit (siehe Materialtabelle).
    9. Nachweis der PCR-Produkte auf 1,5% Agarose-Gelelektrophorese (30 min, 120 V).

4. In-vitro-Nachweis der Exosomenfunktion

  1. Exosomen-Markierung
    1. 100 μL Exosomen (1 mg/ml) mit 1 mM Dil (1000x) markieren (siehe Materialtabelle) und bei RT für 30 min inkubieren.
    2. Die Exosomen werden durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g für 70 min zurückgewonnen. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL 1x PBS.
  2. Laden von Cy3-miR-140 imitiert Exosomen
    1. Mischen Sie 1 μg/μL exosomales Protein und 5 μmol/ml Cy3-miR-140 in einem Endvolumen von 400 μL Elektroporationspuffer (1,15 mM Kaliumphosphat (pH 7,2), 25 mM Kaliumchlorid und 21% (v/v) (siehe Materialtabelle).
    2. Die Mischung wird mit einem Gentransfektionssystem in kalte 0,4 cm Elektroporationsküvetten und Elektroporat mit einer Kapazität von 300 V/100 μF überführt (siehe Materialtabelle).
    3. Halten Sie die Mischung unmittelbar nach der Elektroporation 30 Minuten lang bei RT, um sicherzustellen, dass die Exosomenmembran vollständig wiederhergestellt ist.
    4. Behandeln Sie die Mischungen mit einer Einheit RNase A (siehe Materialtabelle) für 20 Minuten, um die miRNA-Nachahmungen außerhalb der Exosomen zu eliminieren.
    5. Ultrazentrifugieren Sie das Exosomengemisch bei 120.000 x g für 90 min, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Exosomen in 500 μL 1x PBS.
  3. Exosomen-Aufnahmetest
    1. Die Chondrozyten (1 x 107) werden in 35 mm konfokalen Schalen mit 1 ml DMEM/F12 mit 10% FBS ausgesät.
    2. Nach 24 h behandeln Sie die Chondrozyten 1 h lang mit DiI-markierten Exosomen (100 ng/ml) oder cy3-miR-140-beladenen Exosomen (100 ng/ml).
    3. Dreimal mit 1x PBS waschen und dann 10 min bei RT mit DAPI (10 ng/ml) etikettieren.
    4. Erfassen Sie das Fluoreszenzsignal in der konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) mit den entsprechenden Filtern (siehe Materialtabelle).

5. Statistische Auswertung

  1. Führen Sie statistische Analysen mit geeigneter statistischer Software durch.
    ANMERKUNG: Die repräsentativen Daten in jeder Abbildung wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Der Student's t-Test wurde für den Vergleich zweier Gruppen mittels Statistiksoftware verwendet. Eine Einweg-ANOVA gefolgt von Tukey's Multiple wurde bei Vergleichen zwischen mehreren Gruppen durchgeführt. P-Werte <0,05 (*), <0,01 (**) oder <0,001 (***).

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Ergebnisse

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Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Oberflächenmarker von SF-MSCs gemäß den von der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie14,15 empfohlenen Mindestkriterien zur Definition humaner MSCs zu identifizieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass SF-MSCs, die in dieser Studie kultiviert wurden, die Identifizierungskriterien von MSCs erfüllten. Sie waren negativ für CD34, CD45 und HLA-DR (unter 3%) und positiv für CD73, CD90 und CD105 (über 9...

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Diskussion

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Die mesenchymalen Stammzellen sind in der regenerativen Medizin aufgrund ihrer Selbsterneuerung, differenziert in Gewebezellen mit spezialisierten Funktionen und parakrinen Effekten weit verbreitet16,17. Insbesondere die parakrinen Wirkungen von Exosomen haben viel Aufmerksamkeit erregt18. Exosomen tragen die Bioinformationen von MSCs und erfüllen ihre biologische Funktion und überwinden MSC-Mängel wie lästige Lagerung und Transport. So wu...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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National Natural Science Foundation of China (Nr. 81972116, Nr. 81972085, Nr. 81772394); Schlüsselprogramm der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Guangdong (No.2018B0303110003); Guangdong International Cooperation Project (No.2021A0505030011); Shenzhen Science and Technology Projects (Nr. GJHZ20200731095606019, Nr. JCYJ20170817172023838, Nr. JCYJ20170306092215436, Nr. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2021A1515010985); Sanming Projekt der Medizin in Shenzhen (SZSM201612079); Sonderfonds für den Bau von Krankenhäusern auf hohem Niveau in der Provinz Guangdong.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BCA-Assay-KitThermoFisher23227Proteinkonzentrationsassay
Blut-Agar-PlatteNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0903Bakterienkultur
CD105 AntikörperElabscienceE-AB-F1243CDurchflusszytometrie
CD34 AntikörperElabscienceE-AB-F1143CDurchflusszytometrie
CD45 AntikörperBD Bioscience555483Durchflusszytometrie
CD63 AntikörperAbklonal  A5271Western Blot
CD73 AntikörperElabscienceE-AB-F1242CDurchflusszytometrie
CD81 AntikörperABklonal  A5270Western Blot
CD9 AntikörperAbklonal A1703Western Blot
CD90 AntikörperElabscienceE-AB-F1167CDurchflusszytometrie
ZentrifugeEppendorfZentrifuge 5810R
CO2 InkubatorThermoZellkultur
Konfokale Laser Scanning FluoreszenzmikroskopieZEISSLSM 800
CytodexGE HealthcareMicrocarrier
DilThermoFisherD1556EZ-PCR
Mykoplasmen-NachweiskitBI20-700-20Mykoplasmen-Nachweis
DurchflusszytometrieBeckmanMSC-Identifizierung
Gene Pulser II SystemBio-Rad Laboratories1652660Gentransfektion
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software, Inc.Version 8.0.2
HLA-DR AntikörperElabscienceE-AB-F1111CDurchflusszytometrie
Löwenstein-Jensen KulturmediumNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.T0573Mycobacterium tuberculosis-Kultur
MesenGroStemRDMGro-500 MSC-Kultur
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300Nanopartikel-Tracking-Analyse
NTA 2.3 SoftwareMalvernDatenanalyse
Odyssey FCGene Company LimitedFluoreszierendes Western Blotting
OptiPrep ElektroporationspufferSigmaD3911Gentransfektion
Proteaseinhibitoren CocktailSigmaP8340Proteinase-Inhibitor
RNase AQiagen158924Entfernung von RNA
SabouraudAgarplatte Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0919Pilzkultur
TEMJEM-1200EX
Das rotierende Zellkultursystem (RCCS)SyntheconRCCS-4HD3D-Kultur
UltrazentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosomenzentrifuge

Referenzen

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Synovialfl ssigkeits Exosomenmesenchymale Stammzellen3D BioreaktorkulturExosomenisolierungMikrotr ger BeadsUltrazentrifugationNanopartikel TrackingWestern BlottingDurchflusszytometrieExosomenmarker

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