Methodenartikel

Formulierung und Charakterisierung von Lipid-Nanopartikeln für die Genabgabe mit einer mikrofluidischen Mischplattform

DOI:

10.3791/62226

⸱

25. Februar 2021

 ,  ,  ,  , 
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Lipid-Nanopartikel werden mit einem mikrofluidischen Mischplattformansatz für die mRNA- und DNA-Verkapselung entwickelt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidbasierte Arzneimittelträger wurden aufgrund ihrer geringen Größe, Biokompatibilität und hohen Verkapselungseffizienz für klinisch und kommerziell verfügbare Verabreichungssysteme verwendet. Die Verwendung von Lipidnanopartikeln (LNPs) zur Verkapselung von Nukleinsäuren ist vorteilhaft, um die RNA oder DNA vor dem Abbau zu schützen und gleichzeitig die zelluläre Aufnahme zu fördern. LNPs enthalten oft mehrere Lipidkomponenten, darunter ein iionierbares Lipid, ein Helferlipid, Cholesterin und ein konjugiertes Lipid aus Polyethylenglykol (PEG). LNPs können Nukleinsäuren aufgrund der iionisierbaren Lipidpräsenz, die bei niedrigem pH-Wert kationisch ist und eine Komplexierung mit negativ geladener RNA oder DNA ermöglicht, leicht verkapseln. Hier werden LNPs durch Verkapselung von Boten-RNA (mRNA) oder Plasmid-DNA (pDNA) durch schnelles Mischen der Lipidkomponenten in einer organischen Phase und der Nukleinsäurekomponente in einer wässrigen Phase gebildet. Diese Mischung wird mit einer präzisen mikrofluidischen Mischplattform durchgeführt, die eine Selbstorganisation von Nanopartikeln bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des laminaren Flusses ermöglicht. Die hydrodynamische Größe und Polydispersität werden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) gemessen. Die effektive Oberflächenladung am LNP wird durch Messung des Zetapotentials bestimmt. Die Verkapselungseffizienz wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff charakterisiert, um die eingefangene Nukleinsäure zu quantifizieren. Repräsentative Ergebnisse belegen die Reproduzierbarkeit dieser Methode und den Einfluss, den unterschiedliche Formulierungs- und Prozessparameter auf die entwickelten LNPs haben.

Einleitung

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Arzneimittelträger werden verwendet, um ein Therapeutikum mit typischen günstigen Eigenschaften zu schützen und zu liefern, einschließlich niedriger Zytotoxizität, erhöhter Bioverfügbarkeit und verbesserter Stabilität1,2,3. Polymere Nanopartikel, Mizellen und lipidbasierte Partikel wurden zuvor für die Verkapselung und Abgabe von Nukleinsäuren untersucht4,5,6,7. Lipide wurden in verschiedenen Arten von Nanocarrier-Systemen verwendet, einschließlich Liposomen und Lipid-Nanopartikeln, da sie biokompatibel mit hoher Stabilität sind8. LNPs können Leicht nukleinsäuren für die Genabgabe verkapseln9,10. Sie schützen die Nukleinsäure vor dem Abbau durch Serumproteasen während der systemischenZirkulation 11 und können die Abgabe an bestimmte Stellen verbessern, da die Oberflächentopographie und die physikalischen Eigenschaften von LNPs ihre Bioverteilung beeinflussen12. LNPs verbessern auch die Gewebepenetration und die Zellaufnahme9. Frühere Studien haben den Erfolg der siRNA-Verkapselung innerhalb eines LNP13gezeigt, einschließlich des ersten kommerziell erhältlichen LNP-haltigen siRNA-Therapeutikums zur Behandlung der Polyneuropathie der hereditären Transthyretin-vermittelten Amyloidose14-Behandlung, die 2018 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel-Agentur zugelassen wurde. In jüngerer Zeit werden LNPs für die Abgabe größerer Nukleinsäureseilen untersucht, nämlich mRNA und DNA9. Ab 2018 gab es ~ 22 lipidbasierte Nukleinsäure-Verabreichungssysteme, die sich klinischen Studien unterzogen14. Darüber hinaus sind mRNA-haltige LNPs derzeit führende Kandidaten und wurden für einen COVID-19-Impfstoffeingesetzt 15,16. Der potenzielle Erfolg dieser nicht-viralen Gentherapien erfordert die Bildung kleiner (~ 100 nm), stabiler und gleichmäßiger Partikel mit hoher Verkapselung der Nukleinsäure.

Die Verwendung eines iionisierbaren Lipids als Hauptkomponente in der LNP-Formulierung hat Vorteile für die Komplexierung, Verkapselung und Abgabeeffizienz gezeigt14. Ianisierbare Lipide haben typischerweise eine Säuredissoziationskonstante (pKa) < 7; Beispielsweise hat Dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrat (D-Lin-MC3-DMA), das iionisierbare Lipid, das in der fda zugelassenen LNP-Formulierung verwendet wird, einen pKa von 6,4417. Bei niedrigem pH-Wert werden die Amingruppen auf dem iionierbaren Lipid protoniert und positiv geladen, was die Montage mit negativ geladenen Phosphatgruppen auf mRNA und DNA ermöglicht. Das Verhältnis von Amin, "N", Gruppen zu Phosphat, "P", Gruppen wird verwendet, um die Montage zu optimieren. Das N/P-Verhältnis ist abhängig von den verwendeten Lipiden und Nukleinsäuren, was je nach Formulierungvariiert 18. Nach der Bildung kann der pH-Wert auf einen neutralen oder physiologischen pH-Wert eingestellt werden, um eine therapeutische Verabreichung zu ermöglichen. Bei diesen pH-Werten wird auch das iionierbare Lipid deprotoniert, was dem LNP eine neutrale Oberflächenladung verleiht.

Das iionierbare Lipid hilft auch bei der endosomalen Flucht19,20. LNPs durchlaufen während der zellulären Aufnahme eine Endozytose und müssen aus dem Endosom freigesetzt werden, um die mRNA-Ladung in das Zellzytoplasma oder die DNA-Ladung in den Zellkern21zu liefern. Im Inneren des Endosoms befindet sich typischerweise eine saurere Umgebung als das extrazelluläre Medium, wodurch das iionisierbare Lipid positiv geladen wird22,23. Das positiv geladene inisierbare Lipid kann mit negativen Ladungen auf der endoosomalen Lipidmembran interagieren, was zu einer Destabilisierung des Endosoms führen kann, was die Freisetzung von LNP und Nukleinsäure ermöglicht. Verschiedene inizierbare Lipide werden derzeit untersucht, um die Wirksamkeit sowohl der LNP-Verteilung als auch der endosomalen Flucht zu verbessern14.

Andere typische Bestandteile eines LNP sind Helferlipide, wie ein Phosphatidylcholin (PC) oder Phosphoethanolamin (PE) Lipid. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) sind häufig verwendeteHilfslipide 24,25. Es wurde gezeigt, dass DOPE eine invertierte hexagonale II (HII) -Phase bildet und die Transfektion durchMembranfusion 26verbessert, während DSPC mit seiner zylindrischen Geometrie27als stabilisierend angesehen wurde. Cholesterin wird auch in die Formulierung aufgenommen, um die Membransteifigkeit zu erhöhen und anschließend die Stabilität des LNP zu unterstützen. Schließlich ist lipidkonjugiertes Polyethylenglykol (PEG) in der Formulierung enthalten, um die notwendige sterische Barriere zur Unterstützung der Partikelselbstorganisation bereitzustellen27. PEG verbessert auch die Speicherstabilität von LNPs, indem es die Aggregation verhindert. Darüber hinaus wird PEG häufig als Stealth-Komponente verwendet und kann die Umlaufzeit für die LNPs erhöhen. Dieses Attribut kann jedoch auch Herausforderungen für die Rekrutierung von LNPs für Hepatozyten durch einen endogenen Targeting-Mechanismus darstellen, der von Apolipoprotein E (ApoE)28angetrieben wird. So haben Studien die Acylkettenlänge für die Diffusion von PEG aus dem LNP untersucht und festgestellt, dass kurze Längen (C8-14) vom LNP dissoziieren und für die ApoE-Rekrutierung im Vergleich zu längeren Acyllängen besser geeignet sind28. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Sättigungsgrad des Lipidschwanzes, mit dem PEG konjugiert ist, die Gewebeverteilung von LNPs29beeinflusst. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Tween 20, ein häufig verwendetes Tensid in biologischen Arzneimittelformulierungen und einen langen ungesättigten Lipidschwanz aufwies, im Vergleich zu PEG-DSPE, das den Muskel an der Injektionsstelle weitgehend transfizierthat 29, eine hohe Transfektion in entwässernden Lymphknoten aufwies. Dieser Parameter kann optimiert werden, um die gewünschte LNP-Bioverteilung zu erreichen.

Konventionelle Methoden zur Bildung von LNPs umfassen die Dünnschichthydratationsmethode und die Ethanol-Injektionsmethode27. Während dies leicht verfügbare Techniken sind, sind sie auch arbeitsintensiv, können zu einer niedrigen Verkapselungseffizienz führen und sind schwierig zu skalieren27. Fortschritte in den Mischtechniken haben dazu geführt, dass Methoden leichter skaliert werden können, während gleichmäßigere Partikel entwickelt werden27. Diese Methoden umfassen T-Junction-Mixing, versetztes Fischgräten-Mischen und mikrofluidische hydrodynamische Fokussierung27. Jede Methode hat eine einzigartige Struktur, aber alle ermöglichen eine schnelle Vermischung einer wässrigen Phase, die die Nukleinsäure enthält, mit einer organischen Phase, die die Lipidkomponenten enthält, was zu einer hohen Verkapselung der Nukleinsäure27führt. In diesem Protokoll wird das schnelle und kontrollierte Mischen durch eine mikrofluidische Kartusche verwendet, die das gestaffelte Fischgräten-Mischdesign verwendet. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung, Montage und Charakterisierung von Nukleinsäure, die LNPs enthält.

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Protokoll

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Ein Schema des Gesamtprozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung von Puffern

HINWEIS: Eine sterile Filterung der Puffer wird hier dringend empfohlen, um Partikel zu entfernen, die die Nukleinsäure- und LNP-Qualität beeinträchtigen können.

  1. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
    1. Bereiten Sie 1x PBS mit 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl in nukleasefreiem Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
    2. Sterilisieren Sie durch Vakuumfiltration mit einem 0,22 μm Porenfilter.
  2. Citrat-Puffer
    1. Citratpuffer mit 5 mM Natriumcitrat, 5 mM Zitronensäure und 150 mM Natriumchlorid in nukleasefreiem Wasser vorbereiten und auf pH 4,5 einstellen.
    2. Sterilisieren Sie durch Vakuumfiltration mit einem 0,22 μm Porenfilter.
      HINWEIS: Citratpuffer muss nur hergestellt werden, wenn mRNA die Nukleinsäure ist, die im LNP eingekapselt wird. Wenn DNA eingekapselt wird, überspringen Sie 1.2 und fahren Sie mit 1.3 fort.
  3. Apfelsäurepuffer
    1. Bereiten Sie Apfelsäurepuffer mit 20 mM Apfelsäure und 30 mM Natriumchlorid in nukleasefreiem Wasser vor und stellen Sie ihn auf pH 3,0 ein.
    2. Sterilisieren Sie durch Vakuumfiltration mit einem 0,22 μm Porenfilter.
      HINWEIS: Apfelsäurepuffer muss nur hergestellt werden, wenn DNA die Nukleinsäure ist, die im LNP eingekapselt wird. Überspringen Sie 1.3, wenn mRNA verkapselt werden soll. Citratpuffer wird für die mRNA-Verkapselung verwendet, da der niedrigere pH-Wert von 3,0 mit Apfelsäurepuffer zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit eines mRNA-Abbaus führen kann. Das Protokoll kann hier pausiert werden.

2. Herstellung der Lipidmischung

  1. Wenn Stammlipide in Pulverform vorliegen, solubilisieren Sie in reinem 200-Proof-Ethanol.
  2. Berechnen Sie die erforderliche Mischung von Lipidkomponenten basierend auf dem gewünschten Molarenverhältnis. Ein Molverhältnis von 50:10:39:1 (iionierbares Lipid:Helferlipid:Cholesterin:PEG) wird hier als Beispiel für eine Gesamtlipidkonzentration von 10 mM verwendet. Tabelle 1 zeigt die Konzentrationen und Volumina, die für jede dieser Komponenten erforderlich sind.
    HINWEIS: Bei der Berechnung des Volumens, das benötigt wird, um die Lipidmischungskonzentration in Ethanol (EtOH) für den mikrofluidischen Mischer zu erreichen, wird das Gesamtvolumen berücksichtigt, um sicherzustellen, dass die Zugabe von EtOH die Lipidkonzentrationen nicht beeinflusst. Beispielsweise wird ein iionierbares Lipidvolumen von 68,5 μL berechnet, indem die 5 mM-Konzentration in Ethanol mit einem Gesamtlipidmischungsvolumen von 533 μL multipliziert und dann durch die Stammlipidkonzentration von 38,9 mM dividiert wird.
  3. Fügen Sie die entsprechende Menge jeder Lipidstocklösung zu einer Glasfläschchen hinzu, damit sich die Komponenten mit intermittierendem Wirbeln vermischen können. Fügen Sie 200 Proof Ethanol für eine Gesamtmischung von 533 μL hinzu. Für das Beispiel in Tabelle 1sind dies 254 μL Ethanol.
    HINWEIS: Für einen einzigen Durchlauf zur Herstellung von 1 ml LNPs sind 342,5 μL Lipidlösung erforderlich. Dies ist auf eine 3: 1-Mischung von wässriger Nukleinsäure zu organischer Lipidlösung zurückzuführen, wobei etwas Volumen vor und nach der Probenentnahme verworfen wurde. Eine Mischung aus 533 μL wird hergestellt, um die Überschreitung auszugleichen.

3. Herstellung von Nukleinsäurelösung

HINWEIS: Die Herstellung und Handhabung von Nukleinsäurelösungen ist nach Möglichkeit in einer sterilen und RNase-freien Umgebung durchzuführen. Arbeiten Sie nach Möglichkeit in einer Biosicherheitswerkbank mit der Nukleinsäure.

  1. Berechnen Sie das N/P-Verhältnis. Das N/P-Verhältnis ist die Gesamtzahl der iionierbaren Lipidamingruppen (N) zur Gesamtzahl der negativ geladenen Nukleinsäurephosphatgruppen (P). Das N/P-Verhältnis ist oft ein Parameter, der während der LNP-Bildung optimiert werden kann. Führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Berechnen Sie die Anzahl der N-Einheiten mit der folgenden Formel:
      figure-protocol-1
      HINWEIS: Die iionisierbare Lipidkonzentration (Tabelle 1) beträgt 5 mM, was 5 x 10-6 mol/ml entspricht. Das erforderliche Lipidinjektionsvolumen beträgt 0,3425 ml. Wenn beispielsweise die Anzahl der N-Einheiten pro Molekül 1 ist, gibt es unter Verwendung der obigen Gleichung 1,03 x 1018 N-Einheiten im Lipidmix.
    2. Berechnen Sie die P-Einheiten für das gewünschte N/P-Verhältnis. Hier wird z.B. ein N/P = 36 verwendet.
      figure-protocol-2
  2. Berechnen Sie die erforderliche Nukleinsäurekonzentration, um 2,86 x 1016 P-Einheiten mit der folgenden Gleichung zu erhalten.
    figure-protocol-3
    Dabei ist die Anzahl der P-Einheiten pro Basenpaar für mRNA 1 und DNA 2. Für eine mRNA mit 1.200 Basen beträgt die Menge an mRNA, die für eine N/P = 36 benötigt wird, 3,96 x 10-11 Mol.
  3. Berechnen Sie die Massenkonzentration der mRNA, die für N/P = 36 erforderlich ist, mit der folgenden Gleichung.
    figure-protocol-4
    Das durchschnittliche Molekulargewicht einer Ribonukleotidmonophosphateinheit beträgt 322 g/mol30. Bei 1.200-Basen-mRNA beträgt das Molekulargewicht der mRNA 386.400 g/mol. Das erforderliche Injektionsvolumen der Nukleinsäurelösung beträgt 1,028 ml. Somit beträgt die benötigte mRNA-Konzentration 1,488x10-5 g/ml, was 14,88 μg/ml entsprliegt.
  4. Machen Sie 1,5 ml 14,88 μg/ ml mRNA im Citratpuffer aus.
    HINWEIS: Wenn DNA die Nukleinsäure verkapselt wird, verwenden Sie Apfelsäurepuffer, um die Nukleinsäurelösung zu bilden.

4. Ansaugen der mikrofluidischen Kanäle

HINWEIS: Dieses Protokoll wird an die Richtlinien des Geräteherstellers angepasst.

  1. Geben Sie die Priming-Parameter in die Gerätesoftware ein, indem Sie auf die entsprechenden Felder klicken (Tabelle 2).
    HINWEIS: Ein Durchflussverhältnis von 3:1 und eine Durchflussrate von 4-12 ml/min wird empfohlen27,31 . Dies hat sich in den hier vorgestellten Studien sowie vom Hersteller als optimal erwiesen. Dies kann variiert werden, wenn es für die Anwendung von Interesse ist.
  2. Öffnen Sie den Instrumentendeckel und legen Sie eine mikrofluidische Kartusche in den rotierenden Block.
  3. Ziehen Sie mindestens 0,5 ml Ethanol in eine 1-ml-Spritze, um sicherzustellen, dass sich an der Spritzenspitze keine Blasen oder Luftspalte befinden. Legen Sie diese Spritze in den rechten Einlass der Patrone.
  4. Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit 1,5 ml wässrigem Puffer (Citrat für RNA und Apfelsäure für DNA), um sicherzustellen, dass keine Luftblasen oder Lücken vorhanden sind. Legen Sie diese Spritze in den linken Einlass der Patrone.
  5. Legen Sie zwei 15 mL konische Rohre in die Cliphalter ein, um als Abfallbehälter zu dienen.
  6. Klicken Sie in der Gerätesoftware auf Ausführen, um das Mischen zu starten und sicherzustellen, dass die Parameter korrekt eingegeben werden.
  7. Wenn das Instrument aufhört zu grundieren, was durch das abschaltende blaue Licht unten angezeigt wird, öffnen Sie den Deckel und entsorgen Sie die konischen Rohre und Spritzen ordnungsgemäß.

5. LNP-Bildung

HINWEIS: Dieses Protokoll wird an die Richtlinien des Geräteherstellers angepasst.

  1. Aktualisieren Sie die Software mit den Formulierungsparametern, indem Sie auf die entsprechenden Felder klicken (Tabelle 2).
  2. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit der Lipidmischung (vorbereitet in Schritt 2). Entfernen Sie alle Luftspalte oder Blasen an der Spritzenspitze und setzen Sie die Spritze in die rechte Seite der Patrone ein.
  3. Ziehen Sie die Nukleinsäurelösung (in Schritt 3 hergestellt) in eine 3-ml-Spritze und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen oder Luftspalte in der Spritzenspitze befinden. Setzen Sie die Spritze in den linken Einlass der Patrone ein.
    HINWEIS: Volumes werden bereitgestellt, um eine 1-ml-Lösung von LNPs herzustellen. Dieses Gerät kann Spritzengrößen bis zu 10 ml enthalten, und die Volumina können entsprechend skaliert werden, ohne Einfluss auf das Ergebnis. Das maximale Volumen an LNPs, das in einem Präparat hergestellt werden kann, beträgt 12 ml.
  4. Beschriften Sie ein 15 mL RNase-freies konisches Rnase-Röhrchen mit dem Probennamen und führen Sie es in den linken Röhrchenclip ein. Legen Sie einen 15 ml Abfallkonisch in den rechten Rohrclip.
  5. Schließen Sie den Gerätedeckel und klicken Sie auf Ausführen, nachdem Sie die korrekte Eingabe der Parameter bestätigt haben.
  6. Nachdem das Instrument fertig läuft, entsorgen Sie den Abfallbehälter und die Kartusche ordnungsgemäß. Bewahren Sie das konische Röhrchen mit der LNP-Probe auf.
  7. Verdünnen Sie das LNP 5x mit PBS, um das Ethanol auf <5% (v/ v) zu minimieren.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die LNPs in PBS so schnell wie möglich nach mikrofluidischer Vermischung zu verdünnen, um einen Abbau zu verhindern. Führen Sie die Verdünnung immer in einer Biosicherheitswerkbank durch und arbeiten Sie während des gesamten Pufferaustauschs in der Biosicherheitswerkbank weiter.

6. Pufferaustausch

HINWEIS: Protokoll für die Verwendung von Ultrazentrifugenfiltern ist vorhanden. Während diese Methode zu einem zeiteffizienteren Pufferaustausch führt, kann hier die Dialyse ersetzt werden.

  1. Vorwaschen eines Ultrazentrifugenfilters (100 kDa Porengröße) mit 2 mL PBS durch Zentrifugieren bei 1000 x g für 5 min. Entleeren Sie das PBS aus dem unteren Fach.
    HINWEIS: PBS wird gewählt, um den pH-Wert auf 7,4 ± 0,2 zu erhöhen, was physiologisch relevant ist und dazu führt, dass das iionisierbare Lipid eine neutrale Ladung aufwies.
  2. Verdünnte LNPs in das obere Fach des vorgewaschenen Ultrazentrifugenfilters geben und bei 1000 x g zentrifugieren für 12 min.
  3. Entsorgen Sie den Durchfluss aus dem unteren Fach. Führen Sie zwei weitere Wäschen durch, indem Sie jedes Mal 5 ml PBS in den Ultrazentrifugenfilter geben. Zentrifuge bei gleichen Parametern. Es gibt kein maximales Volumen, das beibehalten werden muss.
    HINWEIS: Wenn ein vergrößertes Volumen an LNPs vorbereitet wurde, erhöhen Sie das PBS-Volumen für jede Wäsche entsprechend. Wenn beispielsweise 2 ml LNPs in einem einzigen Durchlauf zubereitet wurden, werden 10 ml PBS pro Waschgang empfohlen.
  4. Pipetetten Sie die LNP-Lösung einige Male gegen die Wände des Ultrazentrifugenfilters, um den LNP-Verlust zu minimieren. Entfernen Sie die LNP-Lösung aus dem Ultrazentrifugenfilter und lagern Sie sie in einer nukleasefreien Durchstechflasche. Fügen Sie bei Bedarf PBS hinzu, um ein endgültiges Volumen der LNP-Lösung von 1 ml zu erreichen.
  5. Filtern Sie bei Bedarf durch einen vornassen 0,2 μm Spritzenfilter.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

7. Messung der Verkapselungseffizienz

  1. Bereiten Sie eine Standardkurve vor, indem Sie 2-fache serielle Verdünnungen von arbeitender Nukleinsäurelösung in PBS herstellen, beginnend mit einer höchsten Konzentration von 500 ng / ml, und mindestens fünf Verdünnungen. Verwenden Sie PBS als Leerzeichen.
  2. Bereiten Sie die LNP-Probenverdünnungen vor. Verdünnen Sie LNP-Proben mit PBS, um eine ungefähre theoretische Konzentration zu erreichen, die um den Mittelpunkt der Standardkurve liegt (z. B. ~ 250 ng / ml Nukleinsäure, geschätzt von der Anfangskonzentration).
  3. Bereiten Sie eine Lösung des RNA-Quantifizierungsreagenz (für mRNA-Messungen) mit TritonX-100 vor, um die LNPs zu stören und die Gesamtmenge an Nukleinsäure innerhalb und außerhalb des LNP zu messen. Diese Lösung enthält 0,5% (v/v) RNA-Reagenz, 0,4% (v/v) TritonX-100 und 99,1% (v/v) PBS.
  4. Bereiten Sie eine Lösung des Reagenzes ohne TritonX-100 vor, um die Menge an Nukleinsäure zu messen, die nicht in den LNPs verkapselt ist. Diese Lösung enthält 0,5% (v/v) RNA-Reagenz und 99,5% (v/v) PBS.
    HINWEIS: Wenn LNPs doppelsträngige DNA (dsDNA) wie Plasmid-DNA verkapseln, verwenden Sie stattdessen das dsDNA-Reagenz in 7.3 und 7.4 nach dem gleichen Verfahren.
  5. Laden Sie in eine 96-Well-Schwarzfluoreszenzplatte mindestens vier Replikate jeder der in 7.1 und 7.2 hergestellten LNP- und Nukleinsäure-Standardlösungen.
  6. Zur Hälfte der Replikate von Standards und Proben wird ein gleiches Volumen des Reagenzes hinzugefügt, das TritonX-100 enthält. Dadurch wird die Gesamtmenge an Nukleinsäure quantifiziert.
  7. Zu den verbleibenden Vertiefungen von Standards und Proben wird ein gleiches Volumen des Reagenzes ohne TritonX-100 hinzugefügt. Dadurch wird die Menge an Nukleinsäure quantifiziert, die nicht im LNP verkapselt ist.
  8. Schütteln Sie die Platte für 5 minuten bei Raumtemperatur, um eine gründliche Mischung von Standards und Proben mit dem hinzugefügten Reagenz zu gewährleisten, wobei Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
  9. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Mikroplattenleser mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm.
  10. Berechnen Sie die Konzentration von Nukleinsäure außerhalb des LNP unter Verwendung der Standardkurve, die mit der Zugabe des Reagenzes ohne TritonX-100 erstellt wurde. Multipliziert mit dem in 7.2 verwendeten Verdünnungsfaktor.
  11. Berechnen Sie die Konzentration von Nukleinsäure sowohl innerhalb als auch außerhalb des LNP unter Verwendung der Standardkurve, die mit der Zugabe des TritonX-100-haltigen Reagenzes erstellt wurde. Multipliziert mit dem in 7.2 verwendeten Verdünnungsfaktor.
  12. Berechnen Sie die Konzentration von Nukleinsäure im Inneren, indem Sie die Konzentration der Nukleinsäure außen (berechnet aus Schritt 7.10) von der Gesamtkonzentration von Nukleinsäure sowohl innen als auch außen (berechnet aus Schritt 7.11) subtrahieren.
  13. Quantifizieren Sie die Verkapselungseffizienz aus dem Verhältnis der Konzentration von Nukleinsäure im LNP (berechnet aus Schritt 7.12) und der Gesamtkonzentration von Nukleinsäure (berechnet aus Schritt 7.11).
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

8. Konzentrationsanpassungen

  1. Passen Sie bei Bedarf die Nukleinsäurekonzentration innerhalb der LNP-Lösung unter Verwendung der Ergebnisse der Verkapselungseffizienz an.
  2. Wenn eine weniger konzentrierte Lösung gewünscht wird, verdünnen Sie die Lösung mit PBS, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.
  3. Wenn eine konzentriertere Lösung gewünscht wird, führen Sie zusätzliche Zentrifugationsläufe mit einem Ultrazentrifugenfilter durch.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

9. Messung der hydrodynamischen LNP-Größe und Polydispersität

  1. Verdünnen Sie ein Aliquot der LNP-Lösung 40x mit PBS, um ein Endvolumen von 1 ml zu erhalten.
    HINWEIS: Diese Verdünnung kann bei Bedarf geändert werden. Dieser Verdünnungswert wird empfohlen, da er ein kleines Volumen der LNP-Stammlösung verwendet und gleichzeitig qualitativ hochwertige Ergebnisse liefert.
  2. Messen Sie mit einer Semi-Mikroküvette den hydrodynamischen Durchmesser und den Polydispersitätsindex. Die LNP-Lösung in die Küvette geben und in das Instrument einführen. Richten Sie in der Gerätesoftware ein Betriebsverfahren ein, das den Messtyp, Probendetails (Material, Dispergiermittel, Temperatur und Zelltyp) und Messanweisungen (Anzahl der Durchläufe) enthält. Klicken Sie auf Start, wenn Sie bereit sind, mit der Messerfassung zu beginnen.

10. LNP-Zetapotential messen

  1. Verdünnen Sie ein Aliquot der LNP-Lösung 40x mit nukleasefreiem Wasser, um ein Endvolumen von 1 ml zu erhalten.
    HINWEIS: Nukleasefreies Wasser wird als Lösungsmittel für Zetapotentialmessungen verwendet, um den Einfluss hoher Salzpuffer auf die Leitfähigkeit zu minimieren.
  2. Messen Sie mit einer gefalteten kapillaren Zetazelle das Zetapotential.
    1. Die LNP-Lösung in die Küvette bis zur Fülllinie geben. Setzen Sie das Gerät in das Gerät ein, um sicherzustellen, dass die Elektroden mit dem Gerät in Kontakt kommen.
    2. Richten Sie in der Gerätesoftware ein Betriebsverfahren ein, das den Messtyp, Probendetails (Material, Dispergiermittel, Temperatur und Zelltyp) und Messanweisungen (Anzahl der Durchläufe) enthält. Klicken Sie auf Start, wenn Sie bereit sind, mit der Messerfassung zu beginnen.

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Ergebnisse

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Mehrere Chargen von LNPs mit der gleichen Lipidformulierung und dem gleichen N/P-Verhältnis von 6 wurden an verschiedenen Tagen entwickelt, um die Reproduzierbarkeit der Technik zu demonstrieren. Charge 1 und 2 führten zu überlappenden Größenverteilungen mit ähnlicher Polydispersität (Abbildung 2A) Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Größe oder Verkapselungseffizienz zwischen den beiden verschiedenen Chargen beobachtet (Abbildu...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reproduzierbarkeit, Geschwindigkeit und Screening mit geringem Volumen sind wesentliche Vorteile der Verwendung von mikrofluidischer Mischung zur Bildung von LNPs im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden (z. B. Lipidfilmhydratation und Ethanolinjektion). Wir haben die Reproduzierbarkeit dieser Methode ohne Einfluss auf die Verkapselungseffizienz oder Partikelgröße demonstriert, die bei verschiedenen LNP-Chargen beobachtet wurde. Dies ist ein wesentliches Kriterium für jedes Therapeutikum, einschließlich LNPs, um klin...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren sind Mitarbeiter von Sanofi. Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt oder konkurrierende finanzielle Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vielen Dank an Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger und Philip Zakas für ihre Anleitung und Beiträge zur LNP-Entwicklung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,2-Dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylenglykol-2000 (C-14 PEG)Avanti Polare Lipide880151P
10 & micro; l Tipps für Verlaufsfilter  (RNase-,DNase-, DNA-frei)USA Scientific1121-3810
1000 & Mikro; l Verlaufsfilterspitzen (RNase-, DNase-, DNA-frei)USA Scientific1111-2831
20 µ l Abgeschrägte Filterspitzen (RNase-, DNase-, DNA-frei)USA Scientific1120-1810
200 µ l Graudatierte Filterspitzen (RNase-, DNase-, DNA-frei)USA Scientific1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholesten, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterin)Sigma-AldrichC8667
BD Sterile Slip-Tip-Spritzen (1 ml Spritze)Thermo Fisher Scientific14-823-434
BD Sterile Slip-Tip-Spritzen (3 ml Spritze)Thermo Fisher Scientific14-823-436
BD Vacutainer Spritzennadeln für den allgemeinen Gebrauch (BD Blunt Fill Needle 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
TischzentrifugeBeckman-Schar
Schwarz 96-Well-PlattenThermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-freie Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)Thermo Fisher Scientific14-380-813
ZitronensäureFisher Scientific02-002-611
Corning 500 ml Vakuumfilter-/Vorratsflaschensystem, 0,22 μmPoren Corning430769
Einweg-gefaltete KapillarzellenMalvernDTS1070
Ethylalkohol, reiner 200 ProofSigma-Aldrich459844
Fisher Brand Semi-Mikro-KüvetteThermo Fisher Scientific14955127
Konische Invitrogen-Röhrchen (15 mL) (DNase-RNase-frei)Thermo Fisher ScientificAM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra ZentrifugalfiltereinheitenThermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblr BenchtopPrecision Nanyosystems
Nukleasefreies WasserThermo Fisher ScientificAM9930
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA-Assay-KitThermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay KitThermo Fisher ScientificR11490
NatriumchloridFisher Scientific02-004-036
Natriumcitrat, Dihydrat, granuliertFisher Scientific02-004-056
SpectraMax i3xMolecular Devices
Zetasizer NanoMalvern

Referenzen

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