Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 2016¹berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Zusammenfassung

Augenerkrankungen betreffen Millionen von Menschen weltweit, aber die begrenzte Verfügbarkeit von menschlichem Gewebe behindert ihre Studie. Mausmodelle sind mächtige Werkzeuge, um die Pathophysiologie von Augenkrankheiten aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit der menschlichen Anatomie und Physiologie zu verstehen. Veränderungen im retinalen Pigmentepithel (RPE), einschließlich Veränderungen in Morphologie und Funktion, sind häufige Merkmale, die von vielen Augenerkrankungen geteilt werden. Eine erfolgreiche Isolierung und Kultur der primären Maus-RPE-Zellen ist jedoch eine große Herausforderung. Dieses Papier ist eine aktualisierte audiovisuelle Version des Protokolls, das zuvor von Fernandez-Godino et al. im Jahr 2016 veröffentlicht wurde, um primäre Maus-RPE-Zellen effizient zu isolieren und zu kultivieren. Diese Methode ist sehr reproduzierbar und führt zu robusten Kulturen hochpolarisierter und pigmentierter RPE-Monolayer, die mehrere Wochen lang auf Transwells gepflegt werden können. Dieses Modell eröffnet neue Wege für die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die Augenkrankheiten zugrunde liegen. Darüber hinaus bietet es eine Plattform, um therapeutische Ansätze zu testen, die verwendet werden können, um wichtige Augenkrankheiten mit unerfüllten medizinischen Bedürfnissen zu behandeln, einschließlich vererbter Netzhauterkrankungen und Makuladegenerationen.

Einleitung

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 2016¹berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) der Maus, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Die RPE ist eine Monoschicht im Auge zwischen der neuronalen Netzhaut und der Bruch-Membran. Diese einzelne Schicht besteht aus hochpolarisierten und pigmentierten Epithelzellen, die durch enge Kreuzungen verbunden sind und eine sechseckige Form aufweisen, die einer Wabe²ähnelt. Trotz dieser scheinbaren histologis....

Protokoll

Die Richtlinien der ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung wurden befolgt.

HINWEIS: Diese Methode hat sich bei Mäusen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund bewährt, einschließlich C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ und Albino-Mäuse in verschiedenen Altersgruppen. Verwenden Sie vorzugsweise 8 bis 12 Wochen alte Mäuse, um RPE-Zellen zu erhalten. RPE-Zellen von älteren Mäusen vermehren sich weniger in der Kultur und jüngere Mäuse haben weniger und kleinere Zellen, was erfordert, Dass Augen von verschiedenen Tieren zusammengepoolt werden, um lebensfähige Kulturen zu h....

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde verwendet, um RPE-Zellen von genetisch veränderten Mäusen zu isolieren und zu kultivieren¹. Es wurden keine Unterschiede zwischen Mausstämmen oder Geschlecht beobachtet. Die Ergebnisse haben dazu beigetragen, einige wichtige Aspekte des Mechanismus zu verstehen, der Augenerkrankungen zugrunde liegt, wie z. B. die altersbedingte Makuladegeneration, die die häufigste Ursache für Sehverlust bei älteren Menschen ist⁹. RPE-Zellen, die nach diesem Protokoll.......

Diskussion

Während mehrere Methoden für die Mürmaus-RPE-Zellisolierung und -kultur vor^1,13,^20,22,26,27entwickelt worden waren, verwendete Fernandez-Godinos Methode erstmals Membraneinsätze, die das effiziente Wachstum der RPE-Zellen in kultur für Wochen^{1 ,9}ermöglichten. Eine wei.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 ml BD Luer-Lok Spitzenspritze, Einweg	BD Biosciences	309604
15 ml Zentrifugenröhrchen	VWR International	21008-103
50 ml Zentrifugenröhrchen	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Abgewinkelte Mikrozange	WPI	501727
Tischzentrifuge	beliebig
CO2-Inkubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Präpariermikroskop	Beliebig
Dulbecco' s Phospat gepufferte Kochsalzlösung ohne Kalzium, ohne Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Pinzette für die medizinische Biologie, 0,05 x 0,01 mm Spitze, 11 cm Länge	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Durchsichtige Polystyrol-Zellkulturschale, 35 mm	BD Biosciences	353001
Fötales Rinderserum-Hyklon		SH30071,03	Hitze inaktiviert.
Hank' s ausgewogene Salzlösung plus Calcium und Magnesium, ohne Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank' s Balanced Salt Solution plus Calcium und Magnesium, kein Phenolrot B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar Flow Hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	In PBS bei 37C auf 1mg/ml verdünnen
McPherson-Vannas Mikroschere 8 cm lang	WPI	503216
Nicht-essentielle Aminosäuren 100X	Gibco	11140050
N1 Ergänzung 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl, Größe 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurin	Sigma-Aldrich	T-0625
Mit Gewebekulturen behandelte 12-Well-Platten	Fisher-Scientific	08-772-29
Mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platten	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell unterstützt 6,5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Trijod-Thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0,25%), phenolrot	Gibco	25200056
Pinzette, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, gebogen, Edelstahl 0,02 x 0,06 mm Mod Tips	WPI	500232
Vannas Schere 8cm lang, Edelstahl	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Spritzenvorsatzfilter 0,45 μm m Porengröße	Fisher-Scientific	6780-2504