Methodenartikel

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

DOI:

10.3791/62228

⸱

10. Februar 2021

 ,  , 
1Ocular Genomics Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Zusammenfassung

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Augenerkrankungen betreffen Millionen von Menschen weltweit, aber die begrenzte Verfügbarkeit von menschlichem Gewebe behindert ihre Studie. Mausmodelle sind mächtige Werkzeuge, um die Pathophysiologie von Augenkrankheiten aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit der menschlichen Anatomie und Physiologie zu verstehen. Veränderungen im retinalen Pigmentepithel (RPE), einschließlich Veränderungen in Morphologie und Funktion, sind häufige Merkmale, die von vielen Augenerkrankungen geteilt werden. Eine erfolgreiche Isolierung und Kultur der primären Maus-RPE-Zellen ist jedoch eine große Herausforderung. Dieses Papier ist eine aktualisierte audiovisuelle Version des Protokolls, das zuvor von Fernandez-Godino et al. im Jahr 2016 veröffentlicht wurde, um primäre Maus-RPE-Zellen effizient zu isolieren und zu kultivieren. Diese Methode ist sehr reproduzierbar und führt zu robusten Kulturen hochpolarisierter und pigmentierter RPE-Monolayer, die mehrere Wochen lang auf Transwells gepflegt werden können. Dieses Modell eröffnet neue Wege für die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die Augenkrankheiten zugrunde liegen. Darüber hinaus bietet es eine Plattform, um therapeutische Ansätze zu testen, die verwendet werden können, um wichtige Augenkrankheiten mit unerfüllten medizinischen Bedürfnissen zu behandeln, einschließlich vererbter Netzhauterkrankungen und Makuladegenerationen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) der Maus, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Die RPE ist eine Monoschicht im Auge zwischen der neuronalen Netzhaut und der Bruch-Membran. Diese einzelne Schicht besteht aus hochpolarisierten und pigmentierten Epithelzellen, die durch enge Kreuzungen verbunden sind und eine sechseckige Form aufweisen, die einer Wabe2ähnelt. Trotz dieser scheinbaren histologischen Einfachheit führt das RPE eine Vielzahl von Funktionen aus, die für die Netzhaut und den normalen visuellen Zyklus2,3,4entscheidend sind. Die Hauptfunktionen der RPE-Monoschicht sind Lichtabsorption, Ernährung und Erneuerung von Photorezeptoren, Entfernung von metabolischen Endprodukten, Kontrolle der Ionenhomöostase im subretinalen Raum und Aufrechterhaltung der Blut-Retina-Barriere2,3. Das RPE hat auch eine wichtige Rolle bei der lokalen Modulation des Immunsystems im Auge5,6,7,8,9,10,11. Degeneration und/oder Dysfunktion des RPE sind gemeinsame Merkmale von vielen Augenerkrankungen wie Retinitis pigmentosa, Leber angeborene Amaurose, Albinismus, diabetische Retinopathie, und Makuladegeneration12,13,14,15. Leider ist die Verfügbarkeit von menschlichem Gewebe begrenzt. Aufgrund ihrer hochkonservierten genetischen Homologie mit Menschen stellen Mausmodelle ein geeignetes und nützliches Werkzeug zum Studium von Augenerkrankungendar 16,17,18,19. Darüber hinaus bietet die Verwendung von kultivierten primären RPE-Zellen Vorteile wie genetische Manipulation und Arzneimitteltests, die die Entwicklung neuer Therapien für diese sehbedrohlichen Erkrankungen beschleunigen können9,11.

Vorhandene Methoden, die für die RPE-Isolation und -Kultur der Maus verfügbar sind, fehlen reproduzierbar und rekapitulieren die RPE-Funktionen in vivo nicht mit ausreichender Zuverlässigkeit. Zellen neigen dazu, Pigmentierung, sechseckige Form und transepitheliale elektrische Beständigkeit (TER) innerhalb weniger Tage in Kultur13,20zu verlieren. Da die Etablierung dieser primären RPE-Zellkulturen von Mäusen ein anspruchsvoller Prozess ist, wurde dieses optimierte Protokoll auf der Grundlage anderer Protokolle erstellt, um RPE-Zellen von Ratten- und menschlichen Augen zu isolieren21,22,23, um die Mausaugen zu sezieren, die RPE zu sammeln und die Maus-RPE-Zellen in vitro zu kultivieren.

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Protokoll

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Die Richtlinien der ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung wurden befolgt.

HINWEIS: Diese Methode hat sich bei Mäusen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund bewährt, einschließlich C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ und Albino-Mäuse in verschiedenen Altersgruppen. Verwenden Sie vorzugsweise 8 bis 12 Wochen alte Mäuse, um RPE-Zellen zu erhalten. RPE-Zellen von älteren Mäusen vermehren sich weniger in der Kultur und jüngere Mäuse haben weniger und kleinere Zellen, was erfordert, Dass Augen von verschiedenen Tieren zusammengepoolt werden, um lebensfähige Kulturen zu haben.

1. Herstellung von Reagenzien und Membraneinsätzen

  1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor.
    1. HBSS-H-H (HBSS ohne Kalzium, ohne Magnesiumpuffer + 10 mM HEPES) vorbereiten: 1 ml 1 M HEPES zu 99 ml HBSS- (ohne Ca/Mg) Puffer hinzufügen. Bei 4 °C bis 1 Monat lagern.
    2. HBSS-H+ (HBSS mit Kalzium, mit Magnesiumpuffer + 10 mM HEPES) vorbereiten: 1 ml 1 M HEPES zu 99 ml HBSS+ (mit Ca/Mg) Puffer hinzufügen. Bei 4 °C bis 1 Monat lagern.
    3. Hyaluronidase-Lösung (1 mg/ml) vorbereiten: 10 mg Hyaluronidase zu 10 ml HBSS-H- hinzufügen und mit einem 0,4 m-Sterilspritzenfilter mit einer 10 ml Spritze filtern. Vor Gebrauch frisch vorbereiten und bei Raumtemperatur (RT; 20-25 °C) lassen.
    4. FBS-Lösung vorbereiten: Mischen Sie 20% FBS mit HBSS-H+. Fügen Sie 2 ml FBS zu 8 ml HBSS-H+ hinzu. Vor Gebrauch frisch vorbereiten.
    5. RpE-Medium: N1 Medium Supplement 1/100 (v/v), Glutamin 1/100 (v/v), Penicillin-Streptomycin 1/100 (v/v) und nicht essentielle Aminosäurelösung 1/100 (v/100 (v/v), Hydrocortison (20 g/L), Taurin (250 mg/L) und Triiodo-Thyronin (0,013 g/l) in Alpha MEM + 5% FBS oder ohne FBS1,23,24. Auf Wunsch kann FBS wärmeinaktiviert werden; es wurden keine Unterschiede beobachtet. Bereiten Sie sich frisch auf die RPE-Isolierung vor. Für die Zellkulturpflege bei 4 °C bis 1 Monat lagern.
    6. Trypsin-EDTA vorbereiten: Vorbereiten kleiner Einweg-Aliquots (ca. 8 ml) frischer Trypsin-EDTA (0,25 %) und frieren Sie sie bei -20 oC ein. Tauen Sie sie bei RT vor jedem Gebrauch. Vermeiden Sie Gefrier-Tau-Zyklen.
  2. Bereiten Sie die Membraneinsätze (z. B. Transwell-Einsätze) vor.
    1. Equilibrate die 6,5-mm-Membraneinsätze mit RPE-Medium für mindestens 30 min bei37 °C, in einem 5% CO2-belüfteten Inkubator. Verwenden Sie einen Membraneinsatz, um RPE-Zellen von zwei Mausaugen auszusäen.
    2. Ersetzen Sie nach der Inkubation das Medium des unteren Fachs durch 700 l PBS.
    3. Entfernen Sie das Medium aus dem oberen Fach und beschichten Sie den Membraneinsatz mit 100 l von 10 g/ml Mauslaminin (in PBS) für mindestens 2 h bei RT (kürzere Inkubationen können zu einer schlechten Befestigung der Zellen an der Einlage führen).
    4. Mantel Sie einen zusätzlichen Membraneinsatz, um als Rohling für TER-Messungen zu verwenden.

2. Zerlegung und Enukleation der Mausaugen

  1. Euthanisieren Sie die Mäuse durchCO2-Erstickung, indem Sie sie in eineCO2-Kammer legen und CO2 langsam mit einer Füllrate von 30-70% des Kammervolumens pro Minute freisetzen.
  2. Legen Sie die abgewinkelten, gezackten Spitzen von Mikrozangen auf jeder Seite des Mausauges und drücken Sie vorsichtig, um den Augapfel zu proptosisieren (Enukleation).
  3. Schließen Sie die Zange um den Augapfel platziert. Ziehen Sie dann sanft, während Sie sich vorwärts und rückwärts bewegen, um das ganze Auge mit dem Sehnerv von den Augenmuskeln zu lösen, um sicherzustellen, dass kein Bindegewebe an der Sklera befestigt bleibt.
  4. Spülen Sie den enukleierten Augapfel in 70% Ethanol, bevor Sie ihn in einen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit 3 ml HBSS-H- auf Eis legen.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.4, um das zweite Mausauge zu entfernen. Fahren Sie innerhalb von 30 min mit den nächsten Schritten fort.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, nur zwei Augen gleichzeitig zu enuclieren/zu sezieren, bis etwas Erfahrung gesammelt wird.

3. Sammlung des RPE

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Durchflusshaube aus. Um ausgedehnte Inkubationen auf Eis zu vermeiden, die zum Tod von RPE-Zellen führen können, sammeln Sie nicht mehr als zwei Augen gleichzeitig.

  1. Verwenden Sie ein sezierendes Stereomikroskop, Dumont #5 Zangen und eine abgewinkelte Schere, um das gesamte Bindegewebe, das Blut und die Muskeln, die am Augapfel befestigt sind, sorgfältig zu reinigen, ohne dass die Sklera geschnitten wird. Ändern Sie den 3 ml HBSS-H-Puffer bei Bedarf regelmäßig, um das Auge frisch und sauber zu halten und die Kontamination der RPE-Kulturen zu vermeiden.
  2. Verwenden Sie den Sehnerv als Griff, um den Augapfel zu halten und ein Loch in der Mitte der Hornhaut mit einem scharfen Carbon-Stahl-#11 Klinge zu machen.
  3. Verwenden Sie Dumont #5 Schere, um drei Einschnitte in der Hornhaut durch das oben genannte Loch zu machen, um sicherzustellen, dass genügend Platz vorhanden ist, um die Linse zu entfernen.
  4. Halten Sie den Sehnerv und üben Sie leichten Druck auf die Ora serrata mit der Basis der abgewinkelten Schere, bis die Linse vollständig herauskommt. Lassen Sie das Irisepithel an Ort und Stelle, um die Ablösung der neuronalen Netzhaut und RPE während der Inkubation zu verhindern. Legen Sie das Auge in den HBSS-H-Puffer.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.4, um das zweite Auge zu sezieren.
  6. Inkubieren Sie die Augen ohne Linsen in Hyaluronidase-Lösung in einer 12-Well-Platte bei37 °C für 45 min in einem 5% CO2-belüfteten Inkubator (1,5 ml/well), um die neuronale Netzhaut vom RPE zu lösen.
  7. Legen Sie jedes Auge in einen neuen Brunnen und inkubieren Sie es auf Eis für 30 min mit 1,5 ml kalten HBSS-H+ Puffer pro Brunnen, um die Hyaluronidase Aktivität zu stoppen. Verlängern Sie die Inkubation nicht länger als 45 min.
  8. Waschen und jedes Auge in ein 35-mm-Kulturgericht mit frischem HBSS-H+ Puffer geben und die Hornhaut durch die ursprünglichen Schnitte schneiden, bis sie mit einer 8-cm-Vannas-Schere die Oraserrata erreichen. Dann unter die Ora serrata schneiden, um das Irisepithel und die Hornhaut zu entfernen.
  9. Halten Sie die Augenmuschelkante/Ora serrata mit einer gekrümmten Pinzette und ziehen Sie mit abgewinkelten Mikrozangen die neuronale Netzhaut weg, um sicherzustellen, dass die RPE-Schicht nicht geschnitten wird. Schneiden Sie dann die innere Befestigung am Sehnerv. Wenn einige RPE-Zellen an der neuronalen Netzhaut befestigt bleiben, verlängern Sie die Inkubationszeit, aber nicht mehr als 45 min insgesamt.
  10. Schneiden Sie den Sehnerv und übertragen Sie jede Augentasse auf eine andere 12-Well-Platte mit 1,5 ml frischem Trypsin-EDTA pro Brunnen. Stellen Sie sicher, dass die Augenmuscheln geöffnet bleiben und vollständig in das Trypsin eingetaucht sind. Inkubieren Sie die Augenmuscheln bei 37 °C für 45 min in einem 5% CO2-Inkubator.
  11. Sammeln Sie jede Augenmuschel zusammen mit allen RPE-Platten, die während der Trypsin-Inkubation abgenommen wurden, und übertragen Sie sie in eine 12-Well-Platte, die 1,5 ml FBS-Lösung pro Brunnen enthält. Wenn RPE-Platten in der Trypsin-Lösung verbleiben, verwenden Sie eine Mikropipette, um sie mit fbS-Lösung in den Brunnen zu übertragen.

4. Isolierung der primären Maus-RPE-Zellen

  1. Halten Sie jede Augenmuschel am Sehnerv fest und schütteln Sie sie mit dem Gesicht nach unten in die 12-Well-Platte mit 1,5 ml 20% FBS in HBSS-H+ bis die vollständige Ablösung der RPE-Platten erreicht ist.
  2. Sammeln Sie alle RPE-Platten und RPE-Cluster mit einer Mikropipette und legen Sie sie in ein 15-ml-Rohr. Vermeiden Sie weiße Stücke von Sklera oder Aderhaut, die die Kulturen kontaminieren könnten. Pool zwei Augen von der gleichen Maus in einem Rohr.
  3. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 340 x g für 2 min bei RT und entsorgen Sie den Überstand.
  4. Das RPE-Pellet vorsichtig in 1 ml Trypsin-EDTA (0,25%) und inkubieren Sie das Gemisch 1 min in einem Wasserbad bei 37 °C, um die RPE-Platten in einzelne Zellen zu zerlegen. Nach der Inkubation, sanft nach oben und unten 10x mit einer Mikropipette, Vermeidung von Blasenbildung beim Pipetieren.
  5. Fügen Sie 9 ml frisch zubereitetes RPE-Medium hinzu, um das Trypsin zu verdünnen und die Mischung bei 340 x g für 2 min bei RT zu zentrieren.
  6. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in 150 l RPE-Medium mit 5% FBS vorsichtig wieder aufsetzen, indem man eine Mikropipette verwendet, um sicherzustellen, dass die Zellen homogen resuspendiert werden und Blasenbildung während der Pipettierung vermieden wird.
  7. Nehmen Sie den lamininbeschichteten Membraneinsatz aus Schritt 1.2, entfernen Sie PBS aus der unteren Kammer und fügen Sie 700 L RPE-Medium hinzu.
  8. Entfernen Sie das Laminin aus der oberen Kammer des Membraneinsatzes und verteilen Sie die RPE-Zellsuspension tropfenweise und gleichmäßig auf die Mitte der Kammer, wodurch Blasenbildung beim Pipetieren vermieden wird.
  9. Den Membraneinsatz bei 37 °C in einen 5% CO2-Inkubator geben und mindestens 24 h ungestört lassen.
  10. Überprüfen Sie nach 24 h den Membraneinsatz unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die meisten RPE-Zellen am Einsatz befestigt sind und der Zusammenfluss mindestens 50 % beträgt (Abbildung 1A). Es ist wichtig, die Medien während der ersten 72 h nicht zu wechseln.

5. Kultur polarisierter RPE-Monolayer

  1. Bewahren Sie die isolierten RPE-Zellen in kultur für mindestens 72 h auf, bevor Sie das RPE-Medium aktualisieren, um eine Zellbindung zu ermöglichen. Ein Zellzusammenfluss von 50% oder mehr bei der Aussaat ist für die Bildung einer geeigneten polarisierten RPE-Monoschicht von grundlegender Bedeutung.
  2. Ändern Sie das Kulturmedium zweimal pro Woche mit frischem und vorgewärmten RPE-Medium (Schritt 1.1.5), nachdem die Zellen angeschlossen sind. Serum kann nach den ersten 72 h aus dem Kulturmedium entfernt werden.
    HINWEIS: Nach einer Woche in der Kultur sollten Zellen konfluent, sechseckig, binukleiert, pigmentiert und polarisiert sein(Abbildung 1B), wobei die erwarteten Zellzahlen etwa 50.000 Zellen pro 6,5 mm Transwell-Einsatz betragen. Nach zwei Wochen in der Kultur werden RPE-Monolayer beobachtet, die aus gesunden Zellen bestehen. RPE-Kulturen zeigen apikale Mikrovilli, Basalfalten und enge Knoten (Abbildung 1C).

6. TER-Messung

HINWEIS: Führen Sie TER-Messungen der RPE-Zellen nach mindestens 4 Tagen in kultur durch, um eine gute Integrität und Polarisation der RPE-Monoschicht zu gewährleisten.

  1. Reinigen Sie die Elektroden des Voltohmmeters mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie sorgfältig.
  2. Nehmen Sie die Transwells aus dem Inkubator und führen Sie TER-Messungen innerhalb von 3 min durch, um Änderungen aufgrund von Temperaturschwankungen zu vermeiden. Um TER zu messen, tauchen Sie die kurze Elektrode des Voltohmmeters in die obere Kammer und die lange Elektrode in die Unterkammer des Membraneinsatzes ein. Vermeiden Sie den Kontakt mit der RPE-Monoschicht, um eine Zellablösung zu verhindern.
  3. Um TER zu berechnen, ziehen Sie den Wert des Rohlings (Membraneinsatz mit Laminin ohne Zellen beschichtet) aus der Probe ab. Dann multiplizieren Sie den erhaltenen Wert (in Ohm) mit der Oberfläche des Membraneinsatzes (0,33 cm2 bei 6,5-mm-Membraneinsatz). Das Produkt sollte mindestens 200 Ω x cm2 nach 72 h in Kultur sein. DIE TER-Werte sollten nach zwei Wochen über 400 Ω x cm2 messen. VERwerfen Sie RPE-Kulturen mit niedrigen TER-Werten.

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll wurde verwendet, um RPE-Zellen von genetisch veränderten Mäusen zu isolieren und zu kultivieren1. Es wurden keine Unterschiede zwischen Mausstämmen oder Geschlecht beobachtet. Die Ergebnisse haben dazu beigetragen, einige wichtige Aspekte des Mechanismus zu verstehen, der Augenerkrankungen zugrunde liegt, wie z. B. die altersbedingte Makuladegeneration, die die häufigste Ursache für Sehverlust bei älteren Menschen ist9. RPE-Zellen, die nach diesem Protokoll...

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Diskussion

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Während mehrere Methoden für die Mürmaus-RPE-Zellisolierung und -kultur vor1,13,20,22,26,27entwickelt worden waren, verwendete Fernandez-Godinos Methode erstmals Membraneinsätze, die das effiziente Wachstum der RPE-Zellen in kultur für Wochen1 ,9ermöglichten. Eine wei...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Ocular Genomics Institute in Massachusetts Eye and Ear unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 ml BD Luer-Lok Spitzenspritze, EinwegBD Biosciences309604
15 ml ZentrifugenröhrchenVWR International21008-103
50 ml ZentrifugenröhrchenVWR International21008-951
Alpha Minimum Essential MediumSigma-AldrichM4526-500ML
Abgewinkelte MikrozangeWPI501727
Tischzentrifugebeliebig
CO2-InkubatorThermoHERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
PräpariermikroskopBeliebig
Dulbecco' s Phospat gepufferte Kochsalzlösung ohne Kalzium, ohne MagnesiumGibco14190144
Dumont #5 45° Pinzette für die medizinische Biologie, 0,05 x 0,01 mm Spitze, 11 cm LängeWPI14101
EthanolSigma-AldrichE7023-500ML
Falcon Easy-Grip Durchsichtige Polystyrol-Zellkulturschale, 35 mmBD Biosciences353001
Fötales Rinderserum-HyklonSH30071,03Hitze inaktiviert.
Hank' s ausgewogene Salzlösung plus Calcium und Magnesium, ohne Phenol RedLife Technologies14175095
Hank' s Balanced Salt Solution plus Calcium und Magnesium, kein Phenolrot B6Life Technologies14025092
HEPES 1MGibco15630106
HyaluronidaseSigma-AldrichH-3506 1G
HydrocortisonSigma-AldrichH-0396
Laminar Flow HoodThermoCLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ mlSigma-AldrichL2020-1 MGIn PBS bei 37C auf 1mg/ml verdünnen
McPherson-Vannas Mikroschere 8 cm langWPI503216
Nicht-essentielle Aminosäuren 100XGibco11140050
N1 Ergänzung 100XSigma-AldrichN6530-5ML
Penicillin-StreptomycinGibco15140-148
Sterile Bard-Parker Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl, Größe 11Fisher-Scientific08-914B
TaurinSigma-AldrichT-0625
Mit Gewebekulturen behandelte 12-Well-PlattenFisher-Scientific08-772-29
Mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-PlattenFisher-Scientific14-832-11
Transwell unterstützt 6,5 mmSigma-AldrichCLS3470-48EA
Trijod-ThyroninSigma-AldrichT-5516
Trypsin-EDTA (0,25%), phenolrotGibco25200056
Pinzette, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, gebogen, Edelstahl 0,02 x 0,06 mm Mod TipsWPI500232
Vannas Schere 8cm lang, EdelstahlWPI501790
Whatman Puradisc 25mm Spritzenvorsatzfilter 0,45 μm m PorengrößeFisher-Scientific6780-2504

Referenzen

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