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Methodenartikel

3D-Druck von In-vitro-Hydrogel-Mikroträgern durch abwechselnd viskos-inertiales Kraft-Jetting

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DOI:

10.3791/62252

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21. April 2021

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1Biomanufacturing Center, Dept. of Mechanical Engineering, Tsinghua University, 2Biomanufacturing and Rapid Forming Technology Key Laboratory of Beijing, 3Department of Mechanical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird eine milde 3D-Drucktechnik vorgestellt, die durch abwechselnd viskos-inertiale Kräfte angetrieben wird, um den Bau von Hydrogel-Mikroträgern zu ermöglichen. Hausgemachte Düsen bieten Flexibilität und ermöglichen einen einfachen Austausch für verschiedene Materialien und Durchmesser. Zellbindende Mikroträger mit einem Durchmesser von 50-500 μm können erhalten und für die weitere Kultivierung gesammelt werden.

Zusammenfassung

Microcarrier sind Kügelchen mit einem Durchmesser von 60-250 μm und einer großen spezifischen Oberfläche, die üblicherweise als Träger für großflächige Zellkulturen verwendet werden. Die Mikrocarrierkulturtechnologie ist zu einer der Haupttechniken in der zytologischen Forschung geworden und wird häufig im Bereich der großflächigen Zellexpansion eingesetzt. Es hat sich auch gezeigt, dass Mikrocarrier eine immer wichtigere Rolle bei der In-vitro-Tissue-Engineering-Konstruktion und beim klinischen Arzneimittelscreening spielen. Aktuelle Methoden zur Herstellung von Mikrocarriern umfassen mikrofluidische Chips und Tintenstrahldruck, die oft auf einem komplexen Strömungskanaldesign, einer inkompatiblen Zweiphasenschnittstelle und einer festen Düsenform beruhen. Diese Methoden stehen vor den Herausforderungen komplexer Düsenverarbeitung, unbequemer Düsenwechsel und übermäßiger Extrusionskräfte, wenn sie auf mehrere Biotinten angewendet werden. In dieser Studie wurde eine 3D-Drucktechnik, die als alternierende viskos-inertiale Kraftstrahlung bezeichnet wird, angewendet, um den Bau von Hydrogel-Mikroträgern mit einem Durchmesser von 100-300 μm zu ermöglichen. Anschließend wurden Zellen auf Mikroträgern ausgesät, um Tissue-Engineering-Module zu bilden. Im Vergleich zu bestehenden Verfahren bietet diese Methode einen freien Düsenspitzendurchmesser, flexibles Düsenschalten, freie Kontrolle der Druckparameter und milde Druckbedingungen für eine Vielzahl von bioaktiven Materialien.

Einleitung

Mikroträger sind Kügelchen mit einem Durchmesser von 60-250 μm und einer großen spezifischen Oberfläche und werden üblicherweise für die großflächige Kultur von Zellen verwendet1,2. Ihre äußere Oberfläche bietet reichlich Wachstumsstellen für Zellen, und das Innere bietet eine Stützstruktur für die räumliche Proliferation. Die sphärische Struktur bietet auch Komfort bei der Überwachung und Kontrolle von Parametern, einschließlich pH-Wert, O2 und Konzentration von Nährstoffen und Metaboliten. In Kombination mit Rührkessel-Bioreaktoren können Mikrocarrier im Vergleich zu herkömmlichen Kulturen höhere Zelldichten in einem relativ kleinen Volumen erreichen und bieten damit eine kostengünstige Möglichkeit, Großkulturen zu erhalten3. Die Mikroträgerkulturtechnologie ist zu einer der wichtigsten Techniken in der zytologischen Forschung geworden, und auf dem Gebiet der großflächigen Expansion von Stammzellen, Hepatozyten, Chondrozyten, Fibroblasten und anderen Strukturen wurden große Fortschritte erzielt4. Sie haben sich auch als ideale Arzneimittelverabreichungsvehikel und Bottom-up-Einheiten erwiesen und übernehmen daher eine immer wichtigere Rolle beim klinischen Arzneimittelscreening und bei der Reparatur von In-vitro-Geweben5.

Um die Anforderungen an die mechanischen Eigenschaften in verschiedenen Szenarien zu erfüllen, wurden mehrere Arten von Hydrogelmaterialien für den Bau von Mikrocarriern entwickelt6,7,8,9,10,11. Alginat- und Hyaluronsäure (HA)-Hydrogele sind aufgrund ihrer guten Biokompatibilität und Vernetzungsfähigkeit zwei der am häufigsten verwendeten Mikrocarriermaterialien12,13. Alginat kann leicht durch Calciumchlorid vernetzt werden, und seine mechanischen Eigenschaften können durch Änderung der Vernetzungszeit moduliert werden. Tyramin-konjugiertes HA wird durch die oxidative Kopplung von Tyraminresten, die durch Wasserstoffperoxid und Meerrettichperoxidase katalysiert werden, vernetzt14. Kollagen wird aufgrund seiner einzigartigen Spiralstruktur und seines vernetzten Fasernetzwerks häufig als Adjuvans verwendet, um sich in die Mikroträger zu mischen, um die Zellbindung weiter zu fördern15,16.

Aktuelle Methoden zur Herstellung von Mikrocarriern umfassen mikrofluidische Chips, Tintenstrahldruck und Elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidische Chips haben sich bei der Herstellung von Mikrocarriern in einheitlicher Größe als schnell und effizient erwiesen24. Diese Technologie beruht jedoch auf einem komplexen Fließkanaldesign- und Fertigungsprozess25. Hohe Temperaturen oder übermäßige Extrusionskräfte beim Tintenstrahldruck sowie intensive elektrische Felder beim Elektrospray-Ansatz können die Eigenschaften des Materials, insbesondere seine biologische Aktivität, beeinträchtigen19. Wenn sie auf verschiedene Biomaterialien und Durchmesser angewendet werden, führen die in diesen Methoden verwendeten kundenspezifischen Düsen zu einer begrenzten Verarbeitungskomplexität, hohen Kosten und geringer Flexibilität.

Um eine bequeme Methode für die Mikrocarrier-Vorbereitung bereitzustellen, wurde eine 3D-Drucktechnik namens Alternating Viscous-Inertial Forces Jetting (AVIFJ) angewendet, um Hydrogel-Mikroträger zu konstruieren. Die Technik nutzt nach unten gerichtete Antriebskräfte und statischen Druck, die während vertikaler Vibrationen erzeugt werden, um die Oberflächenspannung der Düsenspitze zu überwinden und so Tröpfchen zu bilden. Anstelle von starken Kräften und thermischen Bedingungen wirken kleine schnelle Verschiebungen während des Druckens direkt auf die Düse, was einen geringen Einfluss auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Biotinte hat und eine große Anziehungskraft auf bioaktive Materialien ausübt. Mit der AVIFJ-Methode wurden mikrocarrier aus mehreren Biomaterialien mit Durchmessern von 100-300 μm erfolgreich gebildet. Außerdem wurde bewiesen, dass die Mikrocarrier Zellen gut binden und eine geeignete Wachstumsumgebung für adhärente Zellen bieten.

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Protokoll

1. Zellkultur

  1. Ergänzen Sie das modifizierte Minimum Essential Medium (H-DMEM) von Dulbecco mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% nicht essentieller Aminosäurelösung (NEAA), 1% Penicillin G und Streptomycin sowie 1% Glutaminpräparat als Kulturmedium für A549-Zellen.
  2. Kultur von A549-Zellen in einem CO2-Inkubator bei 37 °C und mit 5% CO2
  3. Dissoziieren Sie Zellen für die Subkultur mit Trypsin bei etwa 80% Konfluenz.
    1. Verwenden Sie 3 ml Trypsin, um die Zellen im T75-Kulturkolben bei 37 °C für 3 min zu behandeln, und fügen Sie dann 6 ml Kulturmedium hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen.
    2. Pipettieren Sie das Kulturmedium, um lose anhaftende Zellen zu ernten.
    3. Zentrifuge bei 72,5 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie mit 3 ml frischem Medium.
    4. 1 ml Zellsuspension in einen neuen T75-Kulturkolben mit 10 ml frischem Medium überführen. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 2 Tage.

2. Vorbereitung der Düsen

  1. Legen Sie Glasmikropipetten gemäß den Anweisungen des Herstellers auf den Abzieher. Der Außendurchmesser, der Innendurchmesser und die Länge des Mikrostrahlrohrs betragen 1,5 mm, 1,1 mm bzw. 100 mm.
  2. Stellen Sie die Zugparameter für den Abzieher ein. Insbesondere sind die Werte HEAT, PULL, VELOCITY, TIME und PRESSURE standardmäßig auf 560, 255, 255, 150 bzw. 500 festgelegt. Ziehen Sie die Düse unter diesen Parametern ab.
    VORSICHT: Die nach dem Abziehen erhaltene Düse ist sehr scharf und unvorsichtige Bedienung kann zu Verletzungen führen.
  3. Schneiden Sie die resultierende Düse (Schritt 2.2) mit dem angegebenen Durchmesser durch eine Mikroschmiedevorrichtung nach den Anweisungen des Herstellers ab, um einen bestimmten Spitzendurchmesser zu erhalten. Platzieren Sie insbesondere den angegebenen Durchmesser der Düse auf dem beheizten Platindraht. Den Draht für ca. 5 s auf 60 °C erhitzen und die Düse auseinander ziehen.
  4. Tauchen Sie den Druckkopf der Düse für 30 Minuten in ein hydrophobes Mittel, gefolgt von drei Zyklen des Spülens mit sterilisiertem Wasser.
  5. Vor dem Drucken sterilisieren Sie die Düse für 5 min in Alkohol und spülen Sie sie dreimal mit sterilisiertem Wasser ab, um den Restalkohol zu entfernen.

3. Herstellung von Hydrogel-Biotinte

  1. NaCl (0,45 g) in 50 ml sterilem Wasser auflösen, um eine 0,9% ige (w/v) NaCl-Lösung zu erhalten. Vibrieren Sie die Lösung, um die Auflösung zu fördern. Nach vollständiger Auflösung wird die Lösung durch eine 0,45 μm Polyethylenterephthalat-Filtermembran filtriert.
  2. Niedrigviskoses Natriumalginatpulver (1 g) wiegen und in 25 ml NaCl-Lösung (Schritt 3.1) bei einer hohen Temperatur von 60-80 °C über Nacht auflösen, um eine 4% ige (w/v) Natriumalginat-Stammlösung zu erhalten. Die Stammlösung kann bei 4 °C für 1 Monat gelagert werden.
  3. Die Natriumalginat-Stammlösung (Schritt 3.2) sterilisieren, indem Sie sie dreimal in einem Ofen (70 °C) für 30 min erhitzen.
  4. Verdünnen Sie das richtige Volumen der Natriumalginat-Stammlösung (Schritt 3.3) in 0,9% iger NaCl-Lösung (Schritt 3.1) in Konzentrationen von 2%, 1,5% und 0,5% (w/v).
    HINWEIS: Zusätzlich zum Erhitzen im Ofen sollten andere Zubereitungsprozesse der Natriumalginatlösung in der Haube durchgeführt werden.
  5. 1 g Gelatinepulver werden in 25 mL NaCl-Lösung (Schritt 3.1) bei einer hohen Temperatur von 60-80 °C über Nacht gelöst, um eine 4% ige (w/v) Gelatinestocklösung zu erhalten. Die Stammlösung kann bei 4 °C für 1 Monat gelagert werden.
  6. Die Gelatinestocklösung (Schritt 3.5) sterilisieren, indem Sie sie dreimal in einem Ofen (70 °C) für 30 min erhitzen.
  7. Verdünnen Sie das richtige Volumen der Gelatinestocklösung (Schritt 3.6) in 0,9% iger NaCl-Lösung (Schritt 3.1) in einer Konzentration von 1,5% (w/v).
    HINWEIS: Zusätzlich zum Erhitzen im Ofen sollten andere Zubereitungsprozesse der Gelatinelösung in der Haube durchgeführt werden.
  8. Um die Zellbindung an die Mikroträger zu fördern, bereiten Sie die Alginat-Kollagen-Lösung vor, indem Sie die 2%ige (w/v) Natriumalginatlösung und die Typ-I-Kollagenlösung aus rattenschwanz (4 mg/ml) im Verhältnis 3:1 mischen. Stellen Sie die Lösung auf pH 7,2 mit 0,1 M NaOH-Lösung ein und verwenden Sie sie sofort nach der Zubereitung.
  9. Lösen Sie den tyrosinmodifizierten HA-Flockungsmittel feststoff in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) bei 60-80 °C über Nacht auf, um eine 0,8%ige w/w Tyrosin-modifizierte Hyaluronsäure-PBS-Lösung zu erhalten. Die Stammlösung kann bei 4 °C für 1 Monat gelagert werden.
  10. Sterilisieren Sie die tyrosinmodifizierte HA PBS-Lösung, indem Sie sie dreimal in einem Ofen (70 °C) für 30 min erhitzen.
  11. Meerrettichperoxidasepulver (500 Enzymaktivitätseinheit/mg) in PBS-Lösung auflösen, um 8 Enzymaktivitätseinheiten/mg Meerrettichperoxidase-PBS-Lösung zu erhalten.
  12. Verdünnung der Wasserstoffperoxidlösung (30%, w/w) durch DI-Wasser auf 4 mM.
  13. Bereiten Sie die modifizierte HA-Meerrettichperoxidase-Lösung vor, indem Sie Tyrosin-modifizierte Hyaluronsäure-PBS-Lösung und Meerrettichperoxidase-PBS-Lösung im Verhältnis 1: 1 mischen.
    HINWEIS: Neben dem Erhitzen im Ofen sollten weitere Zubereitungsprozesse der HA-Meerrettichperoxidase-Lösung in der Haube durchgeführt werden.

4. Mikrotröpfchenbildung auf Basis von AVIFJ

  1. Verwenden Sie ein selbst eingerichtetes Zelldrucksystem, wie zuvor berichtet (Abbildung 1A)26. Die elektrische Signalausgabe des Wellenformgenerators wird zunächst verstärkt und treibt dann piezoelektrische Keramiken an, um eine steuerbare Verformung zu erzeugen. Die auf der piezoelektrischen Keramik befestigte Düse erzeugt so kontrollierbare Schwingungen.
  2. Sterilisieren Sie das Drucksystem, indem Sie über Nacht mit 75% (v/v) Alkohol und uvm (UV) abwischen.
  3. Laden Sie 5 ml Biotinte (Schritt 3.1) in eine sterile Einwegspritze. Installieren Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe.
  4. Verbinden Sie die Spritze (Schritt 4.3) und die Düse (Schritt 2.5) mit einem Silikonschlauch von 1 mm Innendurchmesser.
  5. Befestigen Sie die Düse (Schritt 4.4), die für den Druck verwendet werden soll, indem Sie die Dichtheit der Klemmschraube einstellen. Halten Sie die Spitze der Düse während der Installation vom Substrat fern, um Beschädigungen und Verunreinigungen zu vermeiden.
    ACHTUNG: Wenn die Düse während der Installation gebrochen ist, tragen Sie bitte dickere Handschuhe und reinigen Sie sorgfältig Glasfragmente und -rückstände.
  6. Drücken Sie schnell die Spritzenpumpe und laden Sie die Biotinte (Schritt 4.3) in die Düse (Schritt 4.5). Stellen Sie die Durchflussrate auf 30 μL/min ein. Wischen Sie das überschüssige Material an der Spitze ab.
  7. Stellen Sie die Parameter des Signalgenerators ein. Importieren Sie eine selbst entworfene Wellenform mit 500.000 Abtastpunkten. Stellen Sie die Abtastrate und die Spitzenspannung (Vpp) auf 5 Millionen Samples/s bzw. 10 V ein.
  8. Reinigen Sie Objektträger oder Petrischalen mit entionisiertem Wasser. Legen Sie sie als Drucksubstrat unter die Düse.
  9. Stellen Sie den Bewegungspfad und den Vibrationsmodus als Drop-on-Demand fest.
  10. Drucken Sie die Tröpfchen nach den vorgefertigten Mustern.

5. Mikrocarrierbildung auf Basis von AVIFJ

  1. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.4, außer die Biotinte in 2% (w/v) Alginatlösung (Schritt 3.4), Alginat-Kollagen-Lösung (Schritt 3.8) oder modifizierte HA-Meerrettichperoxidase-Lösung (Schritt 3.13) zu ändern.
  2. 3 g Calciumchlorid werden in 100 ml steriles Wasser gelöst, um 3% (w/v) Calciumchloridlösung zu erhalten. Nach vollständiger Auflösung wird die Lösung durch eine 0,45 μm Polyethylenterephthalat-Filtermembran filtriert.
  3. 5 ml Vernetzungslösung (Calciumchloridlösung oder Wasserstoffperoxidlösung) in eine Petrischale geben. Legen Sie die Petrischale unter die Düse, um als Substrat zu arbeiten.
  4. Nach dem Drucken vernetzen Sie die Mikrocarrier für 3 min.
  5. Mikrocarrier-Suspension in einem Zentrifugenröhrchen sammeln und Mikrocarrier durch Zentrifugation bei 29 x g für 3 min anreichern. Resuspendieren Sie die Mikroträger in Nährmedien bei etwa 600 Mikroträgern/ml.

6. Impfung von Zellen auf der Oberfläche von Mikroträgern

  1. Färben Sie A549-Zellen mit Cell Tracker Green CMFDA, um die Beobachtung von Zellen zu erleichtern. Entfernen Sie insbesondere Kulturmedien, fügen Sie 5 ml serumfreies Medium mit 10 μM Cell Tracker-Farbstoff hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 30 minuten in einem Inkubator. Ersetzen Sie dann die Farbstofflösung durch frisches Medium.
  2. Resuspendieren Sie die A549-Zellsuspension bei einer Dichte von 1,6 x 106 Zellen/ml.
  3. 1 ml Alginat-Kollagen-Mikrocarrier-Suspension (Schritt 5.3) und 1 ml A549-Zellsuspension (Schritt 6.1) in eine niedrig haftende 6-Well-Kulturplatte geben.
  4. Legen Sie die Platte auf einen Shaker mit 30 U /min in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
  5. Nehmen Sie den Teller vom Shaker und warten Sie 30 Minuten, bis sich die Mikrocarrier absetzen können. Halber Wechsel des Kulturmediums alle 2 Tage.

7. Analyse der Bildung von Mikrotröpfchen/Mikroträgern

  1. Beobachten und messen Sie die Düse (Schritt 2.2), die Petrischalen (Schritt 4.10 und Schritt 5.4) und Zellen mit Mikroträgern (Schritt 6.5) unter einem Hellfeldmikroskop oder konfokalen Mikroskop. Insbesondere ist die Objektivvergrößerung 4x, 10x oder 20x und die Okularvergrößerung ist 10x.
  2. Messen Sie den Durchmesser der Mikrocarrier mit der ImageJ-Software. Stellen Sie gemäß der Maßstabsleiste, die beim Fotografieren mit dem Mikroskop geliefert wird, die tatsächliche Größe der Skala in BildJ ein und zeichnen Sie 10 Linien des Radius oder der Haupthalbachse der Mikroträger. ImageJ kann die durchschnittliche Größe und Standardabweichung dieser Liniensegmente abrufen.

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Ergebnisse

Druckköpfe mit unterschiedlichen Konvergenzraten und Durchmessern wurden hergestellt, um den Druck mehrerer Arten von Materialien zu erreichen. Die mit zunehmender Zugfestigkeit erhaltenen Düsen sind in Abbildung 1B dargestellt. Die Düsen wurden in drei Bereiche unterteilt: Reservoir (III), Kontraktion (II) und Druckkopf (I). Das Reservoir war der unverarbeitete Teil der Düse, in dem die Flüssigkeit statischen Druck und Bioink-Input für den Druck lieferte. Der Kontraktionsbereich war der Hau...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll enthält Anweisungen für die Herstellung von Multitypen von Hydrogel-Mikroträgern und die anschließende Zellaussaat. Im Vergleich zu mikrofluidischen Chip- und Inkjet-Druckverfahren bietet der AVIFJ-Ansatz zum Bau von Mikrocarriern eine größere Flexibilität und Biokompatibilität. Eine unabhängige Düse ermöglicht den Einsatz einer breiten Palette von Leichtbaudüsen, einschließlich Glasmikropipetten, in diesen Drucksystemen. Die hochgradig kontrollierbare Verarbeitung ermöglicht es, Parameter...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Beijing Natural Science Foundation (3212007), dem Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), dem Spring Breeze Fund der Tsinghua University (20201080760), der National Natural Science Foundation of China (51805294), dem National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) und dem 111 Project (B17026) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A549 ZellenATCCCCL-185Humane nicht-kleinzellige Lungenkrebs-Zelllinie
HellfeldmikroskopOlympusDP70
Konfokales MikroskopNikonTI-FL
Fötales Rinderserum, FBSBI04-001-1ACS
GelatineSIGMAG1890
Glas-MikropipettenSutter Instrumentb150-110-10
GlutaMAXGIBCO35050-061
H-DMEMGIBCO11960-044Dulbecco's modifiziertes Adlermedium
Meerrettichperoxidase PulverSIGMAP6782
Hydrophobemittel3MPN7026Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers und verwenden Sie es nach der Verdünnung
MikroschmiedegerätnarishigeMF-900
Nicht-essentielle Aminosäuren, NEAAGIBCO11140-050nicht-essentielle Aminosäuren
Penicillin G und StreptomycinGIBCO15140-122
PetrischaleSIGMAP5731-500EA
AbzieherSutter InstrumentP-1000
NatriumalginatSIGMAA0682
TrypsinGIBCO25200-056
Typ I Kollagenlösung aus RattenschwanzSIGMAC3867

Referenzen

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