3D-Druck von In-vitro-Hydrogel-Mikroträgern durch abwechselnd viskos-inertiales Kraft-Jetting

Wir bieten ein mildes biogedrucktes Verfahren zur Herstellung von Mikrocarriern mit einer guten Kontrollierbarkeit und Biokompatibilität. Nach der Verkapselung durch Zellen können die Träger auch in der In-vitro-Zellexpansion und der funktionellen Mikrogewebekonstruktion eingesetzt werden. Während des Druckprozesses wirken eine begrenzte Verschiebung anstelle von starken Kräften unter ähnlichen Bedingungen auf die Düse und erhalten die ursprünglichen physikalischen/chemischen Eigenschaften der Biotinte in größtmöglichem Umfang.

Neben herkömmlichen Mikrocarriern können Einheiten mit innerer Zellverteilung oder Tritosin-verkapselten Kapselstrukturen konstruiert und auf den Aufbau verschiedener Gewebestrukturen angewendet werden. Für die Düsenvorbereitung laden Sie nach Herstellerangaben Glasmikropipetten auf den Abzieher und stellen die Zugparameter für den Abzieher ein. Verwenden Sie eine Mikroschmiede, um die Düse mit dem angegebenen Durchmesser abzuschneiden, um den spezifischen Spitzendurchmesser für das Experiment zu erhalten, und sterilisieren Sie die Düse fünf Minuten lang in Alkohol.

Dann spülen Sie die Düse dreimal mit sterilem Wasser ab, um Restalkohol zu entfernen. Um die Hydrogel-Biotinte herzustellen, verdünnen Sie die sterilisierte 4% ige Natriumalginat-Stammlösung in 0,9% Natriumchlorid bei Konzentrationen von 0,5, 1, 1,5 und 2% Gewicht. Für die Bildung von Mikrotröpfchen laden Sie fünf Milliliter Biotinte in eine sterile Einwegspritze und installieren Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe.

Verbinden Sie die Spritze und die Druckdüse mit einem Schlauch mit einem Millimeter Innendurchmesser. Ziehen Sie die Klemmschraube fest, um die Düse zu befestigen, und drücken Sie schnell die Spritzenpumpe, um die Biotinte in die Düse zu laden. Stellen Sie die Parameter des Signalgenerators ein und stellen Sie den Bewegungspfad und den Triggermodus der Vibration so ein, dass sie bei Bedarf abfällt.

Drucken Sie dann die Tröpfchen nach den vorgefertigten Mustern. Für die Bildung von Mikroträgern fügen Sie einer Petrischale fünf Milliliter Vernetzungslösung hinzu und legen Sie die Schale als Substrat unter die Druckdüse. Nach dem Drucken die Mikrocarrier drei Minuten lang vernetzen, bevor die Mikrocarrier-Suspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt wird.

Anschließend werden die Mikroträger durch Zentrifugation angereichert und in einem geeigneten Kulturmedium bei etwa 600 Mikroträgern pro Milliliter resuspendiert. Ersetzen Sie vor ihrer Impfung den Überstand einer A549-Zellkultur durch fünf Milliliter serumfreies Medium, ergänzt mit 10-mikromolarem Zelltracker grünem CMFDA-Farbstoff für eine 30-minütige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation die Farbstofflösung durch frisches Medium und resuspenieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 1,6 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter Medium.

Fügen Sie einen Milliliter Mikroträgersuspension zu den Zellen und einen Milliliter A549-Zellen zu jeder Vertiefung einer niedrig haftenden Sechs-Well-Kulturplatte hinzu. Legen Sie die Platte mit 30 Umdrehungen pro Minute auf einen Shaker im Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Platte aus dem Shaker und lassen Sie die Mikroträger sich 30 Minuten lang absetzen, bevor Sie die Druckdüse, die Petrischalen und die mikrocarrier-impften Zellen durch Hellfeld- und konfokale Fluoreszenzmikroskopie beobachten und messen.

Mit einer 30-Mikrometer-Spitzendüse können mehrere Arten von Bio-Tinte, einschließlich PBS, 1,5% Alginat und 1,5% Gelatine, stabil auf Petrischalen gedruckt werden. Mit zunehmender Viskosität der Tinten wird der Druckprozess immer schwieriger und es werden größere Antriebskräfte benötigt, um größere Tröpfchen zu erhalten. Die Druckparameter können so eingestellt werden, dass die Tröpfchen in bestimmten 2D-Anordnungen gedruckt werden, wie in diesem Druckexperiment beobachtet.

Der Durchmesser der Düsenspitze hat einen direkten Einfluss auf die Größe des Mikroträgers, der gedruckt werden kann. Wie in diesen Hellfeld- und konfokalen Bildern beobachtet, haften A549-Zellen nach zwei Tagen Kultur an den Alginat-Kollagen-Mikroträgern. Nach sechs Tagen bedecken die A549-Zellen die Mikroträgeroberflächen fast vollständig.

Nach diesem Verfahren haben wir die Mikrocarrieroberfläche mit Chitosan beschichtet und Gluconat verwendet, um das Alginatgel aufzulösen, um eine zystische Struktur zu bilden, die angewendet werden kann, um Hohlstrukturen wie Alveolen zu konstruieren. Der Druckprozess zur Herstellung von Mikrocarriern ist recht schonend, daher kann dieses Verfahren häufig zum Drucken zellhaltiger Mikroträger eingesetzt werden.