Summary
在这里，我们提出了一个新的协议，研究和绘制药物携带者的目标沉积到内皮细胞在捏造的，真实大小的，三维的人类动脉模型下的生理流动。所呈现的方法可以作为一个新的平台，瞄准血管系统内的药物携带者。
Abstract
使用三维（3D）人体动脉模型，设计具有正确的尺寸和解剖学，能够正确建模心血管系统中的各种重要过程。最近，虽然已经使用这种人类动脉的3D模型进行了一些生物学研究，但这些研究并没有用于研究血管靶向。本文提出了一种利用3D打印技术构建真实尺寸重建的人类动脉模型的新方法，将它们与人体内皮细胞（ECs）对联，并研究生理流动下的粒子靶向。这些模型具有利用低成本成分复制人体血管的生理大小和条件的优势。该技术可以作为研究和理解心血管系统药物靶向的新平台，并可能改进新型注射纳米药物的设计。此外，提出的方法可能为研究在患者特定的流动和生理条件下有针对性地提供心血管疾病的不同药物提供重要工具。
Introduction
最近，利用人类动脉1、2、3、4、5的3D模型应用了几种方法。这些模型在体外复制人体不同动脉的生理解剖学和环境。然而，它们主要用于细胞生物学研究。目前关于血管瞄准内皮粒子的研究包括硅计算模拟6、7、8、体外微流体模型9、10、11和体内动物模型12。尽管他们提供了见解，但这些实验模型未能准确模拟发生在人类动脉中的瞄准过程，其中血流和血液动力学构成主导因素。例如，对胡萝卜动脉分叉中动脉粥样硬化区域的粒子靶向研究，以其复杂的再循环流模式和壁切应力梯度而闻名，可能会影响粒子在到达内皮13、14、15、16之前所走的旅程。因此，这些研究必须在复制生理环境（即大小、尺寸、解剖学和流剖面）的条件下进行。
最近，这个研究小组制作了3D重建的人类动脉模型，以研究粒子对血管17的沉积和定位。这些模型基于人类血管的几何3D复制品，然后用随后排列其内壁的人类EC进行培养。此外，当受制于产生生理流动的灌注系统时，模型会准确地复制生理状况。灌注系统设计用于在闭路和开路配置中使用渗透泵以恒定的流速给液体灌注（图1）。该系统可用作闭路，用于绘制粒子沉积图，并瞄准胡萝卜素模型内的种子细胞。此外，它可用作开放电路，在实验结束时冲洗出非粘附粒子，并清洁和维护系统。本文介绍了制造人体胡萝卜分叉的3D模型、灌注系统设计以及模型内目标颗粒沉积图的方案。
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Protocol
注：此协议描述了胡萝卜动脉的 3D 模型的制造，并且可以通过简单地修改几何参数来生成任何其他感兴趣的动脉。
1. 设计和制造人类胡萝卜动脉模型的3D分叉
- 从患者或以前研究的几何形状中选择图像，并创建需要打印的模具的计算机辅助设计模型。
注：胡萝卜动脉分叉有一个入口和两个插座。在框架和动脉模具之间设计一个 3D 模具框架和临时打印支架非常重要（图 2A-C）。 - 使用 3D 打印机打印几何形状。切割临时打印支架，并使用砂纸擦亮和平滑模具，尤其是在切割支架的区域。用异丙醇冲洗砂模，去除塑料灰尘，并允许在化学罩中完全干燥2-3小时。
注：这里，印刷模具由透明树脂v4制成（图2D，E）。 - 要轻松溶解塑料，请在化学罩内用透明漆喷洒模具，并允许空气干燥 1 小时。重复此 3 倍。
注：这里使用了 2X超盖透明喷雾 剂，但任何其他种类应该适合，只要它不是木漆。确认没有暴露的塑料，因为塑料可能会与硅胶发生反应，并阻止其正确凝固。喷涂表面的质量将决定最终硅胶模型的表面质量。 - 切割透明矩形滑梯/与模具框架尺寸相同的光滑塑料条，然后用漆将其粘附在框架的四面和框架的一侧，使其密封在底部，并在顶部打开。使用化学罩内的油漆刷涂抹漆，使滑梯完全干燥至少 24 小时（图 2F）。
- 要制备硅橡胶混合物，在塑料板中加入液体硅胶及其固化剂（质量比1：10），并彻底搅拌以确保完全混合。对于胡萝卜素模型，添加54克硅胶和6克固化剂。
- 在 4 °C 下冷却混合物 15 分钟，然后在真空干燥器中除气，直到消除所有气泡。将模具放在干燥器中（打开侧朝上），将硅胶混合物慢慢倒入模具中，然后再次去除气泡，直到混合物变清。
- 让模具在室温下与硅胶一起过夜（如果可能，将其留在干燥器中，不吸尘）。如果混合物尚未完全干燥，则在 60 °C 下再孵育几个小时。
- 一旦混合物完全干燥，取出透明滑梯，将模型浸入绝对丙酮中，在化学罩中浸入 48 h，直到塑料完全溶解。用木棍取出任何塑料剩菜。要蒸发被困在模型中的丙酮，在细胞播种前在 60 °C 下孵育至少 4 天。
2. 细胞培养和模型播种
- 为胡萝卜素模型准备三个连接器：一个用于入口，两个用于插座（参见 材料表）。在生物罩中通过紫外线照射对模型和连接器进行 20 分钟的消毒。
- 在 37 °C 或 4 °C 过夜时，用 4 mL 100 μg/mL 纤维素（在 1 倍磷酸盐缓冲盐水中）涂抹 2 小时。 使用 5 或 10 mL 塑料注射器通过入口将纤维素溶液注入模型。通过出口取出纤维素，然后用EC介质清洗模型。
- 悬浮 2.5 ×10 6 细胞/mL 人体脐静脉内皮细胞 （HUVECs，通道< 6），并使用 5 或 10 mL 塑料注射器（图 3A）将模型填充 4 mL 的细胞悬浮。将模型放在孵化器内的旋转器上（37 °C），速度为 1 rpm，转速为 48 小时，以确保均匀播种。确保模型与旋转器连接良好（图 3B）。在生物罩内 24 小时后更换介质，然后返回孵化器内的旋转器，再更换 24 小时。
注：24小时后，细胞被播种，可以使用显微镜成像。 - 从旋转器中取出模型，使用 10 mL 塑料注射器用 1x PBS 清洗。要修复细胞，用 4 mL 的 4% 半甲醛 （PFA） 孵育到模型中 15 分钟，然后用 PBS 冲洗 3 倍。加入 4 mL 的 PBS，并存储在 4 °C，直到实验 （图 3C）.使用标准染色协议（例如， 用 4+、6-二苯丙醇 （DAPI）、 图 3D涂抹模型内的细胞。
3. 灌注系统的设计
- 灌注系统有两个入口和两个出口管。将两个入口合并成一个 4 mm ID 管，再合并成两个 6 mm ID 管，连接到渗透泵。将从渗透泵中取出的两个 6 mm ID 管合并成一个 4 mm 管，并将其连接到振荡阻尼器，以消除泵的任何振荡。使用 250 mL 窄嘴瓶，带有三孔盖作为阻尼器。
- 将一个孔与泵的入口连接，用用于紧急情况下压力排泄的软木塞关闭第二个孔，并将第三个孔（即出口）扩展到瓶子的底部。
- 使用出口管将阻尼器连接到培养型胡萝卜素模型的入口。将模型的两个插座合并到一个管子中，这将是系统的插座（所有管子都是 4 mm ID）。
- 将出口管拆分成两个插座管（一个用于闭路，另一个用于开放电路中的废物容器）。在每个管子上安装一个塑料夹子。
注：打开/关闭夹子的组合将决定系统是处于闭路还是开放式电路配置中。如图 1所示，如果夹子a和d是关闭的，而b和c是开放的，系统是一个闭路：反之，系统将打开电路配置。 - 准备三个容器：一个可以容纳300mL液体（闭路），另外两个每个1升：一个用于清洗，另一个用于废物（用于开放电路）。
4. 闭路配置：灌注实验和成像
- 在闭路容器中加入 300 mL 的 PBS，这足以填充整个系统，包括油管和型号。将一个进水管和一个插座管（打开夹子 b 和 c）放在容器内。
- 将 1 L 洗涤容器装满蒸馏水（用于在实验结束时清洗），并让其他 1 L 废容器空出。将其他入口和出口管（关闭夹子 a 和 d）分别放在洗涤容器和废品容器中。
- 将固定细胞培养的胡萝卜素模型从 4 °C 存储中取出，并清空 PBS。连接胡萝卜素的入口和插座，如步骤 3.3-3.4 中所述。不要让模型长时间干燥。连接模型后，激活泵以灌注液体。
- 将胡萝卜素模型置于显微镜下。在入口前和胡萝卜素模型出口后打开油管。将永久泵设置为 10 rpm，然后打开。每 4-5 分钟以 5 rpm 的增量增加速度。确保没有泄漏。
- 在 100 rpm 下，这等于人类胡萝卜动脉生理波形的最大流量（+400 mL/min），在闭路容器中的 300 mL PBS 中加入荧光碳化聚苯乙烯 （PS） 颗粒（2 μm，浓度为 1.6 μg/mL）。每 10s 对感兴趣的区域进行 1.5 小时的映像（根据需要仍为单个图像或视频）。
5. 开路配置：洗涤步骤
- 打开 1 L 容器（夹子 a 和 d）中洗涤和废管的夹子，并立即关闭 300 mL 容器（夹子 b 和 c）中入口和出口管的夹子，将系统从封闭电路配置更改为打开电路配置。
- 让大部分水在 100 转速时从洗涤容器流到废品容器。在完全转移之前，按停在渗透泵上，并在进入口前和胡萝卜素模型出口后关闭管夹。
- 使用适当的滤镜，捕获感兴趣的区域模型的图像，以显示粒子沉积和粘附到细胞。断开胡萝卜素模型。小心和缓慢地添加 4 mL 的 PBS 与 10 mL 注射器通过模型的入口。
- 连接"虚拟模型"（这也是硅橡胶3D胡萝卜素模型只用于洗涤，没有培养细胞），而不是胡萝卜素模型，并冲洗系统。再加1升水，再清洗系统，直到所有的水从洗涤容器转移到废物中。关闭永久泵。
6. 数据采集和分析
- 使用自定义的软件代码（参见 材料表），使用实验期间拍摄的图像获取感兴趣的区域粒子沉积的数字电影。
- 为了绘制模型沿线粒子沉积的映射，磁贴多个图像以覆盖所检查的兴趣区域（图4A，B）。
注：可以编写一个定制的软件代码来量化感兴趣的站点（样本文件已作为 补充信息提供）17的粘附粒子数量。
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Representative Results
本文提出了一个新的协议，以绘制真实尺寸的3D人类动脉模型内粒子沉积图，这可能为药物输送研究提供一个新的平台。采用3D打印技术，制作了人类胡萝卜分叉动脉模型（图2）。模型由硅橡胶制成，并配以人体ECs（图3）。重要的是，此协议使生理条件得以复制，特别是在流体动力学方面。灌注系统设计用于将颗粒以胡萝卜素的生理波形特征的大小在恒定流量下注入胡萝卜分叉。 图1 展示了灌注系统，该系统由渗透泵、振荡阻尼器、培养分叉模型、管子和液体容器组成。
为了绘制灌注颗粒的沉积和粘附图，动脉模型在实验结束时和洗涤后（第 5.3 步）的立体显微镜下进行成像。图像是使用 2 倍目标拍摄的，并拼平在一起，形成模型的整体图像。然后，使用自定义的软件代码计算粘附粒子的数量。为了检查分叉时再循环模式的形成，将 10 μm 荧光玻璃珠注入模型。 图4A 显示了再循环，这表明模型内的条件模拟了生理条件。
为了绘制模型内粒子的沉积图，注入了 2 μm 荧光碳化 PS 颗粒，并对其附着在 EC 上的粘附性进行了成像（图 4B，C）。这些粒子在模型多粘附的不同区域以不同的方式粘附，在壁切应力高的再循环区域中观察到。这些结果之前已经讨论过，表明粒子的粘附是模型的几何形状、粒子表面特征和剪切应力17的函数。这些沉积图相对简单，可以快速获得，用于在患者特定模型的生理条件下筛查药物携带者的亲和力和靶向。
图1：灌注系统。 灌注系统设计用于在恒定流下灌注液体。它由 （1） 渗透泵、（2） 振荡阻尼器、（3） 培养的 3D 动脉模型和三个玻璃容器组成：两个容量为 1 L（4 和 6），第三个可以容纳 300 mL 流体 （5）。系统可以按两种配置运行：（i） 打开电路，其中夹子 a+d 是打开的，b+c 是封闭的，或者 （ii） 闭路，其中夹子 a+d 是封闭的，b+c 是打开的。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：设计了3D胡萝卜动脉分叉模型的制造过程。（A-C ）人体胡萝卜分叉、动脉周围的模具框架和临时打印支架的设计。（D， E）几何形状使用 3D 打印机打印。（F） 临时印刷支架被切割，模型被打磨并喷洒漆。然后，透明矩形幻灯片从四面粘在框架上。胶水干燥时，硅胶橡胶被铸造。缩写：3D = 三维。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：胡萝卜动脉3D模型内的EC种子。（A）硅橡胶制成的人类胡萝卜分叉的真尺寸3D模型。该模型用人类ECc培养，并充满细胞介质。（B） 培养模型被放置在37°C的旋转器上，为48小时（C）在光明场的3D模型内培养的ECs图像，（D）与DAPI的核染色蓝色图像。秤杆 = 10μm。缩写：ECs = 内皮细胞;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多;3D = 三维。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：通过模型以400 mL/min的恒定流量灌注10μm荧光玻璃颗粒后产生的流线和再循环（破折号矩形）的条纹线图像。（A）细流线图像的粘附。（B） 3D 培养模型内 2μm 荧光碳化 PS 颗粒（红色）的沉积图。比例条 = 2 mm.（C）粒子（红色）以 10 倍的放大倍数粘附到模型内培养的 IC（蓝色-DAPI）。秤杆 = 10μm。缩写：PS = 聚苯乙烯;3D = 三维;ECs = 内皮细胞;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多勒。请单击此处查看此图的较大版本。
补充信息：请点击这里下载此文件。
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Discussion
目前研究粒子血管靶向的方法在复制人体存在的生理条件方面不足。这里介绍了一个协议，以建立人类动脉的3D重建模型，研究粒子瞄准在生理流下应用的生理流下动脉的EC应用使用定制的灌注系统。在选择 3D 打印材料时，最好使用透明塑料以避免颜料转移到硅胶模型，硅胶模型应尽可能透明。此外，重要的是要选择一种材料，不溶解在丙酮，而是变得柔软和脆，然后可以很容易地从模型中删除。
呈现的3D模型由硅橡胶制成，硅胶是一种透明硅胶，与固化剂混合。重要的是要确保混合物始终在室温或低于室温下，否则硅胶和固化剂之间的交叉链接将开始之前，脱气和铸造到模具。虽然聚二甲基硅氧烷也可用于制造此类型号（与其交联器的 1：10 比例），但硅橡胶更耐用。将模型浸入丙酮溶解塑料后，在 60 °C 下孵育至少 4 天，以确保任何丙酮残留物完全蒸发至关重要。如果任何丙酮仍然被困在模型中，细胞将不能正常生长。在 24 小时后改变介质和在 48 小时后固定细胞是使用 10 mL 注射器手动注入液体的两个步骤。因此，重要的是慢慢灌注，否则细胞可能会被冲走。
灌注系统有两个入口和两个出口管。每个管子都有一个塑料管夹，用于流量控制。大多数管子系统由 4 mm 内二分线 （ID） 管组成，但泵中夹紧的管子（6 mm ID 管）除外。泵中夹紧的管子的 ID 将确定系统中可以实现的最大流量。这种灌注系统还可以通过将阻尼器的出口与振荡器总成连接起来，将预期 波形的振荡部分叠加在振荡泵产生的恒定流速率上，从而产生脉冲波形。此配置可在振荡流下或在振荡器关闭时在恒定流量条件下运行。
本文根据3D人肌动脉分叉实验定制了灌注系统。因此，如果使用其他动脉模型或其他管子，流体量和流速可能需要调整。在这种情况下，系统和流量必须校准，同时确保没有单元格脱离模型墙。逐渐提高渗透泵的流速，保证细胞不会随流而冲走，这一点非常重要。此外，确保整个系统（包括管子、模型以及容器）充满液体（例如，在这种情况下，它装满了总体积为 300 mL 的液体）至关重要。此外，每次实验前后，系统应使用蒸馏水在开放电路配置中清洗。
血液也可以灌注到模型使用灌注系统17。在这种情况下，必须格外小心，以防止任何泄漏，特别是如果使用人体血液。此外，洗涤步骤至关重要，因为漂白剂必须在实验结束时灌注，以确保完全洗掉血液。漂白剂后，应按协议中提及的水进行香水。需要注意的是，在本文中使用了碳化PS颗粒，这些颗粒的组成均匀，分布范围狭窄。此外，这些粒子主要通过静电相互作用粘附在细胞上。但是，可以使用其他药物纳米载体，并且应使用配体标记粒子（ 例如，抗细胞间粘附分子 1 和抗血小板内皮细胞粘附分子 1）来检查特定靶向，这将增加粒子积累到感兴趣的地点的 ECs。
此外，在此协议中，EC 在将模型连接到灌注系统和注入颗粒之前进行了修复。粒子与固定细胞的粘附是结合过程中的第一阶段，因此，需要进行活细胞实验，在粘附过程的后期，粒子的内化可能发生。此协议可用于制造 3D 动脉模型，用于在生理条件下研究药物携带者。概述的方法可能有助于研究在患者特定条件下输送药物。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了以色列科学基金会（ISF赠款#902/18）的支持。玛丽亚·库里奖学金得到了阿丽亚娜·德·罗斯柴尔德男爵夫人妇女博士计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| Acetone, absolute (AR grade) | |||
| Connectors | Nordson Medical | FTLL013-1 | Female Luer |
| FTLL230-1 | Female Luer | ||
| FTLL360-1 | Female Luer | ||
| LP4-1 | Male Luer Integral Lock | ||
| Damper | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle |
| Damper Cover | Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene Filling/Venting Closures |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | The crosslinker |
| Endothelial Cell Media | ScienCell | 1001 | |
| Fibrontectin | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| Isopropyl alcohol, AR grade 99.5% | Remove plastic dust from the sanded model | ||
| Lacquer | Rust-Oleum | 2X-Ultra cover Gloss Clear | |
| Matlab | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Microscope | Nikon | SMZ25 | |
| Microscope Camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | 530U IP31 | With 2 pumpheads: 313D |
| Plastic tube clamp | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs | |
| Polystyrene Particles | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | Diameter = 2 µm |
| Printer resin | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Rotator | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systèmes | https://www.solidworks.com/ | |
| Tubing | Watson Marlow | 933.0064.016 | Tubing for the pump: 6.4 mm ID |
| All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID | |||
References
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