Summary
Bu protokol, bakteriyel selüloz (BC) küreleri oluşturmak için kolay ve ucuz bir yöntem sunar. Bu biyomalzeme, biyoşarç, polimer küreler ve maden atıkları da dahil olmak üzere katı malzemeler için bir kapsülleme aracı olarak işlev görür.
Abstract
Bakteriyel selüloz (BC) küreleri, M.Ö.'nün yeni bir materyal olarak popülerleşmesinden bu yana giderek daha fazla araştırılmaktadır. Bu protokol BC küre üretimi için uygun fiyatlı ve basit bir yöntem sunar. Bu kürelerin üretilmesinin yanı sıra katı parçacıklar için bir kapsülleme yöntemi de tanımlanmıştır. BC küreleri üretmek için su, siyah çay, şeker, sirke ve bakteri kültürü şaşkın bir şişede birleştirilir ve içeriği tedirgin edilir. BC küre oluşumu için uygun kültür koşulları belirlendikten sonra, katı parçacıkları kapsülleme yetenekleri biyoşarç, polimer boncuklar ve maden atıkları kullanılarak test edildi. Küreler ImageJ yazılımı ve termal gravimetrik analiz (TGA) kullanılarak karakterize edildi. Sonuçlar, 7,5 mm çapında kürelerin 7 günde yapılabileceğini göstermektedir. Çeşitli parçacıklar eklemek BC kapsüllerinin ortalama boyut aralığını artırır. Küreler kuru kütlelerinin % 10-20'sini kaplar. Bu yöntem, kolayca elde edilebilen malzemelerle mümkün olan düşük maliyetli küre üretimini ve kapsüllemlerini gösterir. BC küreleri gelecekte kirletici kaldırma yardımı, kontrollü salınımlı gübre kaplaması veya toprak değişikliği olarak kullanılabilir.
Introduction
Bakteriyel selüloz (BC), mekanik mukavemeti, yüksek saflığı ve kristalitesi, su tutma yetenekleri ve karmaşık lif yapısı 1 , 2 ,3,4nedeniyle potansiyel endüstri kullanımı ile dikkat çekti. Bu özellikler BC'yi biyomedikal, gıda işleme ve çevresel iyileştirme kullanımları da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için elverişli bir biyomalzeme haline getirir1. Bir BC filminin oluşumu, fermente bir çay içeceği olan kombucha5için kullanılanlar gibi tek organizma kültürleri veya karışık kültürlerle yapılabilir. Kombucha demleme, yaygın olarak SCOBY olarak bilinen "Simbiyotik Bakteri ve Maya Kültürü"ne dayanır. Organizmaların bu simbiyotik kültürünü kullanarak, BC küreleri oluşturmak için benzer bir teknik kullanılır. Bu biyomalzeme, çevresel kirleticilerin izole edilmesine ve daha verimli mahsul üretimi elde etmek için biyoşarş gibi tarımsal değişikliklerin demirlemesine yardımcı olmak için kullanılabilir.
Önceki literatür, M.Ö.'nün tedirgin koşullarda üretilen özelliklerinin sabit bir kültürde üretilen BC ile karşılaştırıldığında nasıl olduğunu tartışmıştır. Sabit bir kültür, sıvı hava arayüzünde oluşan bir filmle sonuçlanırken, sarsılmış bir kültür, sıvı6içinde asılı olan çeşitli BC parçacıkları, iplikçikler ve kürelerle sonuçlanır. Birçok çalışma, BC'nin ticari üretiminin dinamik koşullarda daha uygulanabilir olduğu iddiasına atıfta bulundu6,7, bu makalenin yöntemini uygulamak için rasyonel sağlar. Ayrıca, BC kürelerinin yapısı ve özellikleri hakkında çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Toyosaki ve ark.6, tedirgin BC üretimlerinde şaşkın ve pürüzsüz duvarlı Erlenmeyer şişelerini karşılaştırdı. Hu ve Catchmark4 tarafından yapılan bir çalışmada, mevcut BC küre üretim süreci için kılavuz olarak kullanılan BC küreleri için koşullar belirlendi ve sonuçları küre boyutunun 60 saat sonra artmaya devam etmediğini gösteriyor. Mohammad ve ark.1 tarafından BC üretiminin gözden geçirilmesi, BC kültürünün sarsılmasının, başarılı BC büyümesi için gerekli olan oksijen tedarikini ve dağıtımını bile sağladığını göstermektedir. Holland ve ark.8, X-ışını kırınımı ve Fourier transform kızılötesi spektroskopi kullanarak M.Ö.'nün kristalitesini ve kimyasal yapısını incelemiştir. BC kapsüllerinin benzer özellikler sergileyeceği ve gelecekteki araştırmaların yapısal özellikleri araştıracağı varsayılmaktadır. Çalışmalar ayrıca gelişmiş biyokompozitler üretmek için BC kullanmanın yararlı etkilerini de araştırmıştır. Epoksi-reçineyi baz olarak kullanan araştırmacılar, BC'nin eklenmesinin yorulma ömrü, kırılma tokluğu ve çekme ve bükülme mukavemeti9,10gibi malzeme özelliklerini geliştirdiğini göstermiştir. Geçmiş ve mevcut araştırmalarda gösterildiği gibi, birçoğu BC kullanımını ticarileştirmekle ilgilenmektedir.
Birçok araştırmacı kontrollü salınım sistemlerinde bakteriyel selülozu araştırdı ve burada açıklanan yöntem kontrollü salınım sistemleri olarak kullanılabilecek kapsüller üretiyor. Bu araştırmanın çoğu biyomedikal alanda kontrollü salınıma ve kontrollü salınımlı gübre (CRF) yönetiminde bazı keşiflere odaklanmıştır. BC'nin kontrollü amoksisilin salınımının başarısına dayanarak11, lidokrin12ve ibuprofen13, BC, peletlenmiş gübre gibi diğer maddelerle benzer teslimat özellikleri gösterebilir. Shaviv ve Mikkelsen14 tarafından CRF'lere genel bir bakış, CRF'lerin daha verimli olduğunu, işgücünden tasarruf ettiğini ve genellikle geleneksel gübre uygulamasına göre daha az çevresel bozulmaya neden olduğunu kabul eder. Bakteriyel selüloz CRF'ler için uygun bir kapsülleme malzemesi olarak çalışabilir. Gübreler BC membranlarından süzebilir veya BC biyobozunur15,16olarak deşarj olabilir. BC'nin yüksek su şişme kapasitesi de yararlı bir toprak değişikliği olarak işlev görebilebilir17,18,19 çünkü hem gübre besin maddeleri hem de nem BC kürelerinin uygulanması yoluyla toprağa salınabilir. Bu özelliklerle, BC küre kapsülleme tarafından oluşturulan bir CRF, üretim ve bertaraf aşamalarında olumsuz etkileri olabilecek diğer gübre kaplama malzemelerine göre avantajlı olabilir. BC'nin gübre kaplamasına uyarlanmış olarak uyarlanmış haline getirildirilebilir ve CRF teknolojileri daha da geliştirilebilir. Gübre salınım oranını düşürerek, mahsuller gübreyi almak ve su kütlelerine fazla akıntıyı önlemek için yeterli zamana sahip olacak ve böylece ötrofikasyonu veoksijen olmayan bölgeleri azaltacaktır. Benzer yavaş salınımlı gübreler, polimer kaplamalar kullanılarak hazırlanmış ve pilotlanmıştır20.
Önceki araştırmalarda belirtilen protokollerin aksine, bu yüksek selüloz verimi yerine tek tip, uyumlu küre üretimine odaklanmaktadır. Ayrıca, bc kapsülleme diğer katı madde selüloz filmler ile çalışılmıştır, ancak küreler21. Bakteriyel selüloz küreleri üzerindeki araştırma genişletilerek, BC'nin çevreye duyarlı özellikleri nedeniyle faydalı olan M.Ö.'nün ticari olarak üretilmesi için daha fazla adım atılabilir. BC küre imalatının bu yöntemi ucuz, hazır mutfak malzemelerini kullanır. İlk montajdan sonra, BC küreleri 2 gün içinde parazit olmadan oluşmaya başlar. Bu strateji ile BC küreleri üretmek çok az alan gerektirir ve yenilebilir bir yan ürüne sahiptir, fermente çay 'kombucha'. Diğer çalışmalarda bahsedilen kapsülleme teknikleri arasında faz inversiyon tekniği22 , 23,matris oluşumu24,sprey kurutma25ve sentez sırasında doğrudan kapsülleme ile oluşturulan kaplamalar26bulunur. Bu yazıda özetlenen doğrudan kapsülleme yöntemi, hazır malzemeler kullanan kolay ve ucuz bir süreç isteyenler için yararlıdır.
Bu araştırma ile BC küre üretimi ve kapsülleme için başarılı bir protokol oluşturulmuştur. BC küreleri, biyoşark, mayın atıkları ve polistiren mikrobeadların katı parçacıklarını kendi bükme yapıları içinde kapsülleyebilir. Henüz endüstride yaygın olarak kullanılmasa da, BC gelecekteki uygulamalar için kullanılabilecek pratik, sürdürülebilir ve doğal olarak meydana gelen bir malzemedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriyel selüloz başlangıç kültürünün oluşturulması ve sürdürülmesi
- Bir SCOBY şeklinde yaklaşık 50 g bakteriyel selülozun başlangıç kültürünü elde edin. Ticari olarak satın alınabilir (örneğin, Sağlık için Kültürler'den). SCOBY'yi kağıt havlu ile kaplanmış 1 L beherin içine yerleştirin.
- 700 mL deiyonize suyu kaynatın, SCOBY içerenden ayrı bir kapta aktarın ve 85 g sakkaroz ekleyin.
- Sakkaroz çözüldükten sonra, 2 torba siyah çay (4.87 g) ekleyin. Çayı 1 saat dikin, ardından bir karıştırma çubuğu kullanarak çay poşetlerini dikkatlice çıkarın.
- Çaya 200 mL damıtılmış beyaz sirke ekleyin. Karışımı 25 °C'ye kadar soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra, SCOBY içeren kabın içine 700 mL oda sıcaklığında çay ekleyin.
DİkKAT: Asidik çayın çok sıcakken eklenmesi SCOBY'deki organizmalara zarar verebilir. - Kabı bir kağıt havlu ile örtün ve elastik bir bantla sabitleyin ve kabı 25 ° C sıcaklıkta bir depolama alanına yerleştirin. Bu gemi genellikle stok kültürü veya otel olarak adlandırılır.
- SCOBY'yi sağlıklı tutmak için ayda yaklaşık 2 kez bakım yapılması gerekir.
- SCOBY paspaslarını tutmak için eldivenli eller kullanarak, sıvıyı otelden ayrı bir kabın içine boşaltın. Sıvı ile kapta, toplam 700 mL çözelti için yeterli asidik çay ekleyin.
- 65 g sakkaroziyi asitli çayla kapta çözün. Sakkarozun çözülmesini beklerken, SCOBY paspaslarını DI suyunda dikkatlice durulayın.
- Sakkaroz tamamen çözüldükten sonra, sıvı durulanmış SCOBY paspaslarını içeren behere eklenebilir. Kabı örtün ve kuluçka alanına geri verin.
2. Bakteriyel selüloz kürelerinin üretimi
NOT: Kaynar su ile çalışırken dikkatli olun. Cam eşyaların kaynar su sıcaklıklarına dayanabildiğinden, kusurlardan arındırılabildiğinden ve uygun boyutta olduğundan emin olun. BC kürelerinin üretimini açıklayan bir şema Şekil 1'de verilmiştir.
- Çaydanlık kullanarak 350 mL deiyonize su kaynatın. Sıcak suyu 500 mL'lik bir kabına aktarın. 42,5 g toz sukozunun bir karıştırma çubuğu kullanarak sıcak suya çözün.
- Sakkaroz tamamen çözüldüğünde, sakkaroz ve 1 saat su içeren şişeye dik 1 torba siyah çay (2,54 g). Bundan sonra, çay poşetini bir karıştırma çubuğu ile çıkarın, çay poşetini kırmamaya dikkat edin ve ardından çöpe atın.
- Kabın içine 100 mL damıtılmış beyaz sirke ekleyin ve ardından karışımı iyice karıştırın. Asidik çay karışımının 80 mL'lik kısmını 250 mL'lik şaşkın bir şişeye aktarın. Çay karışımının oda sıcaklığına, 20 - 25 °C'ye soğumasını bekleyin.
NOT: Bu noktada, karışım bir gecede veya bir sonraki adım için hazırlanana kadar soğumaya bırakılabilir. - Sıvı sıcaklığı oda sıcaklığına (20 - 25 °C) geldikten sonra, şaşkın şişeye 20 mL mikrobiyal başlangıç kültürü sıvısı ekleyin. Bu sıvı bir SCOBY otelinden temin edilebilir. Matarayı parafilm ile örtün.
- Şaşkın şişeyi yörüngesel bir sallama masasına yerleştirin ve hızı dakikada 125 dönüşe (rpm) ayarlayın. M.Ö. küreleri üretmek için karışımın 20 - 25 ° C sıcaklıkta bir odada veya inkübatörde 3 gün boyunca sallanmasına izin verin.
NOT: Matara içeriğinde düzensiz şekiller oluşursa veya selüloz kümeleri şişenin duvarlarına yapışırsa, daha fazla düzensiz BC kütlesinin oluşmasını önlemek için çıkarılmalıdır. İnce teller, halkalar, boru şeklindeki şekiller ve diğer açıkça küresel olmayan şekiller de dahil olmak üzere istenmeyen BC kütlelerini kaldırmak için cımbız kullanın. - Küreler oluştuktan sonra, şişeden hafifçe dökün ve bu makalede özetlenmiş olmayan bir şekilde analiz edin, atın veya kullanın.
3. Parçacıkları veya kirleticileri kapsüllemek için bakteriyel selüloz küreleri kullanma
- Yukarıdaki 2.1-2.5 adımlarını izleyin.
- 3 gün boyunca salladıktan sonra, şaşkın şişeye yaklaşık 0,01 g ince öğütülmüş partikül madde ekleyin. Uygun katı maddeler arasında biyoşark (260 ± 140 μm), maden atıkları (350 ± 140 μm) ve polistiren mikrobeadlar (3 μm) bulunur. Bu materyallerin verileri Temsili Sonuçlar bölümünde özetlenmiştir. Biyoşarç, maden atıkları ve mikrobeadların daha fazla açıklaması için lütfen ekli Malzeme Tablosuna bakın.
- Matarayı tekrar parafilm ile örtün ve 3 gün daha aynı hız ve ortam sıcaklığını (20 - 25 ° C) kullanarak yörüngesel bir çalkalayıcıya geri yerleştirin. Analiz, bertaraf veya diğer kullanımlar için BC kapsüllenmiş parçacıkları çıkarın.
Şekil 1. Bakteriyel selüloz küre imalatı ve katı parçacıkların kapsüllenmesi. Adım 1, bakteri stok kültürünü siyah çay, şeker ve sirke ortamı ile şaşkın bir şişede birleştirmeyi içerir. Stok kültüründeki diskler BC paspaslarını temsil eder. Daha sonra, şaşkın şişe 3 gün boyunca yörüngesel bir sallama masasına yerleştirilir. Orta adım, M.Ö. küreleri oluştuktan sonra şişeye katıların eklendiğini gösterir. Şişe 3 gün daha çalkalanır. Son adımda, BC kürelerinin boyutu artmaya devam etti ve katı parçacıkları kapsülledi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BC küreleri kültürün ilk 48 h'si boyunca en hızlı büyüme hızına sahiptir (Şekil 2). Şekil 2 ayrıca kürelerin maksimum ortalama boyuta ulaşma ve daha sonra sabit kalma eğilimini de göstermektedir. Bu deneyde küreler ortalama 7,5 ± 0,2 mm çapa ulaştı. BC küreleri 10 günlük büyüme süresi içinde hiçbir zaman tamamen bozulmasa da, sekizinci gün boyunca kürenin ana gövdesinden uzanan tendriller oluşturmaya başladı. Bu şekil 2E, en belirgin şekilde sol üstteki büyük kürede görülebilir.
Bu makalede özetlenen kapsülleme yönteminin uygulanması, çapı 3 ila 12 mm arasında değişen ortalama 57 ± 4 bakteriyel selüloz küresi ile sonuçlanır (Şekil 3). M.Ö. kürelerine katı madde eklenmesinin küre büyüklüğü veya frekansı üzerinde tutarlı bir etkisi olmadığı Şekil 3'te de görülebilir. Yörüngesel sarsıntı hızı, ortam sıcaklığı ve düzensiz parçacıkların oluşumu, küresel parçacıkların şeklini, boyutunu ve sıklığını etkileyen ana faktörler gibi görünmektedir. Şekil 4, bir oda sıcaklığının ne kadar yüksek olduğunu ve düzensiz kütlelerin yanlış çıkarılmasının M.Ö.'nün sağlam bir küreden (Şekil 4B) yıldız parçacıklarına (Şekil 4A) veya telli kümelere (Şekil 4C) ne kadar değiştirebileceğini göstermektedir.
BC kürelerindeki kapsüllenmiş katıların fraksiyonunu belirlemek için, dört farklı BC örneğinde termal gravimetrik analiz yapıldı. Test edilen dört örnek BC, biyoşarçlı BC, polistiren mikrobeadlı M.Ö. ve maden atıkları ile M.Ö. Şekil 5, azot gazında yüksek sıcaklığa maruz kaldığında numunelerin nasıl davrandığını göstermektedir. M.Ö. kürelerini maden atıklarıyla temsil eden kesik çizgiden, bu numunenin %18,7'sinin ağırlık olarak maden atığı olduğu görülebilir ve bu da başarılı kapsüllenmeyi ortaya çıkarır. Noktalı çizgi, bu örneğin % 14,5'inin biyoşark içerdiğini gösteriyor. Bu yüzdeler, eklenen katı maddelerle numunelerin kütle yüzdesinden düz BC kütle yüzdesi çıkarılarak hesaplanmıştır. BC ve polistiren benzer sıcaklıklarda ayrıştığı için, polimerin ayrışmasını selülozdan ayırmak için türev kütle eğrileri dekonvolut edildi (Şekil 6). Bu analiz, bu numunedeki kütle kaybının % 13'ünün polistirenin termal bozulmasına karşılık geldiğini göstermektedir. Düzgün polistirenin termal bozulması yaklaşık% 10027kütle kaybına yol açtığından, numunenin kütlesinin% 13'ünün tamamının kapsüllenmiş polistiren boncuklara karşılık geldiği tahmin edilmektedir. Şekil 7, mavi polistiren mikrobead çözeltisinin mavi MÖ ile sonuçlendiğini göstermektedir (Şekil 7D). Bu kurutulmuş BC kütleleri TGA için kullanılan örneklerdir.
Şekil 2. Bakteriyel selüloz büyümesi. (A) Zamanla bakteriyel selüloz kapsüllerinin çapı; bakteriyel selüloz kapsüllerinin fotoğrafları (B) 1 gün, (C) 3 gün, (D), 7 gün ve (E) 10 gün. Bakteriyel selüloz 20 - 25 °C'de 125 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde şaşkın bir Erlenmeyer şişesinde yetiştirildi. Bakteriyel selüloz kürelerinin görüntüleri Gel Doc XR ile çekildi ve ImageJ kullanılarak boyut analizi yapıldı. A paneldeki veriler, standart sapmayı (n ≥ 8) gösteren hata çubuklarıyla ortalama olarak gösterilir. Ölçek çubukları 10 mm'yi temsil eder.
Şekil 3. Kapsüllerin 7 günde boyut dağılımı. (A) ek katı madde olmadan; (B) biyoşark; (C) plastik mikrobeadlar; ve(D)katı maden atıkları. Bakteriyel selüloz, 20 - 25 °C arasında değişen sıcaklıklarda, 145 rpm'de bir yörünge çalkalayıcı üzerinde şaşkın bir Errlenmeye şişesinde yetiştirildi. Büyüme ortamı %0.0101-0.0114 katkı maddesi içeriyordu. Bakteriyel selüloz kürelerinin görüntüleri Gel Doc XR ile çekildi ve ImageJ kullanılarak boyut analizi yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Yetersiz deneylerden elde edilen olası sonuçlar. (A) 30 °C ve 140 rpm'de oluşan bakteriyel selüloz yıldız parçacıkları; (B) BC küresel küre 20 - 25 °C ve 125 rpm'de oluşur; ve (C) BC globülleri 20 - 25 °C ve 140 rpm'de düzensiz şekiller oluştukça şişeden çıkarılmadığında oluşur. Siyah beyaz görüntüler Gel Doc XR ile, renkli fotoğraf ise Surface Pro ile çekildi. Tüm görüntüler ImageJ kullanılarak analiz edildi ve tüm ölçek çubukları 10 mm'yi temsil eder.
Şekil 5. Kapsüllenmiş katıların fraksiyonu. (A) Kapsüllerin termal gravimetrik izleri; (B) ilave katı madde olmadan; (C) biyoşark; (D) plastik mikrobeadlar; ve (E) maden atıkları. TGA'dan önce, fazla suyu çıkarmak için numuneler 3 gün boyunca bir kağıt havlu üzerinde kurutuldu. Azot gazında 4 °C/dk ila 800 °C ısıtma rampası ile termal gravimetrik analizler yapıldı. Bakteriyel selüloz kürelerinin görüntüleri Gel Doc XR ile çekildi. Kırmızı oklar kapsüllenmiş katı parçacıkları işaret eder. Ölçek çubukları 10 mm'yi temsil eder.
Şekil 6. (A ) MÖ diferansiyel TGA profillerinin polistiren mikrobeadlar ve (B) düz M.Ö. ile karşılaştırılmasıyla belirlenen kapsüllemenin kütle yüzdesi. Düz BC'nin diferansiyel TGA profili, BC'de polistiren boncuklarla neredeyse aynı büyüklüklerde görünen dört Gauss eğrisi ile donatılabilir. Bununla birlikte, polistirenin ayrışma sıcaklığı etrafında ortalanmış beşinci bir tepe (kırmızı ile gösterilir) ikincisinde de görülür. Bu zirve, polistiren boncuklarla ilişkili termal ayrışmaya atfedilmiştir. Altındaki alan, %13, polistiren ile ilişkili yüzde kütle kaybına karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. M.Ö. örnekleri kapalı bir petri kabında bir kağıt havlu üzerinde kurur. (A) ve (B) Düz bakteriyel selüloz; (C) M.Ö. biyoşarçlı; (D) Plastik mikrobeadlar ile M.Ö. ve (E) M.Ö. maden atıkları ile. Görüntü bir Surface Pro ile çekildi ve ImageJ kullanılarak analiz edildi. Ölçek çubuğu 1 cm'yi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, yürütülmesi kolay ve uygun maliyetli BC küre üretimi ve kapsülleme yöntemlerini özetlemektedir. Orijinal protokolde yapılan çeşitli ayarlamalar sayesinde yeterli bir süreç belirlenmiştir. Uygulanabilir kürelerin sağlanması için kritik adımlar atılmalıdır. BC oluşumunda yer alan tüm bileşenler kürelerin sağlığında ve dayanıklılığında önemli bir rol oynar. Sakkaroz organizmaları besler, çay azot sağlar ve sirke istenmeyen kirleticileri önlemek için pH'ı en uygun koşullara indirir28. Bu yöntemdeki bir diğer önemli değişken sıcaklıktır. Çay, mikrobiyal başlangıç kültürü eklemeden önce oda sıcaklığına (yaklaşık 25 °C) soğutulmalıdır. Organizmalar yüksek sıcaklıklara maruz kalırsa, BC küre büyümesi engellenebilir. Şişenin salladığı odanın sıcaklığı küre büyümesini de etkiler3,28,29. 30 °C'nin üzerindeki oda sıcaklıklarında titreme düzensiz BC şekillerinin oluşmasına neden olur (Şekil 4A). Kapsülleme işleminde, temel bir adım, katı parçacıklar eklemeden önce BC kürelerinin oluşmasına izin vermektir. Bunun nedeni, şişedeki yabancı nesnelerin varlığının M.Ö. büyümesini engellediği gözlemidir.
Farklı kültür koşulları, Hu ve Catchmark4tarafından da gösterildiği gibi BC küre üretiminin başarısını etkiler. M.Ö. en iyi yörüngesel bir sallama masasındaki şaşkın şişelerde oluşmuştur. Şaşkınlıkların varlığı, pürüzsüz duvarlı şişelere kıyasla küre gelişimini hızlandırdı6. Manyetik çubukla geleneksel karıştırma küre oluşumunu önledi. Ek olarak, farklı mikrobiyal başlangıç kültürü ve çay karışımı oranları küre neslini ve bolluğunu etkiledi. Başlangıçta, 140 mL çay ortamına 3 mL başlangıç kültürü (çözeltinin yüzde 2,10 kütlesi) eklendi. Denemelere devam ettikten sonra çay medyasının hacmi azalırken mikrobiyal başlangıç kültürü miktarı artırıldı. Kullanılan son miktarlar 20 mL mikrobiyal başlangıç kültürü (%20 kütle) ve 80 mL çay karışımıydı. Dönüş hızı için BC küre oluşumu 100 rpm'nin altındaki hızlarda çalkalandığında başarılı olmadı. 125, 140 ve 150 rpm hızları küre üretir, ancak daha önce bildirildiği gibi küre boyutu, sayısı ve şekli bakımından değişkenliğe sahiptir6,29.
M.Ö. oluşum süreci olarak, daha önce belirtildiği gibi tedirgin kültür statik kültüre tercih edilir2. Diğer çalışmalarda açıklanan yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu daha az karmaşıktır ve daha az malzeme gerektirir. Diğer literatürde, önce statik veya tedirgin bir ortamı fermente ederek ve daha sonra BC hücrelerini ana kültürde aşılama için hasat ederek BC stok kültürünün hazırlanmasından bahsedilmektedir 3,4,6,28,29,30. Bazı hücre toplama yöntemleri arasında kuvvetli sallama ve filtrasyon30, karıştırma sonra filtrasyon4ve santrifüjleme3,29bulunur. Bu üretim sürecine dahil edilen BC hücreleri her zaman mikrobiyal başlangıç kültürü kaplarında bulunur, bu nedenle hücre hasadı gerekli değildir. Ayrıca, BC küre oluşumunun başka bir yöntemini mevcut literatüre katkıda bulunarak, ticari M.Ö. kullanımı daha ulaşılabilirdir. Bu, BC'nin çevre dostu malzeme özellikleri nedeniyle faydalıdır29,31.
BC ilginç ve potansiyel olarak değerli bir biyomalzeme olmasına rağmen, önceki çalışmalar18,32gösterdiğinden yaygın kullanımı için hala zorluklar vardır. Bu yöntemde BC küre büyüklüğü ve şekli ile ilgili tutarsızlıklar vardır. Tübüler ve iplik benzeri yapılar bazen medyada oluşur2,18,32. M.Ö. ayrıca şişelerin duvarlarına yapışır, bazen sıvıda asılı kalan halkalar oluşturur ve daha fazla düzensizliğin oluşmasını önlemek için çıkarılmalıdır. Tekdüze küreler tutarlı bilimsel analize olanak sağlarken, bazı endüstriyel kullanımlar için gerekli olmayabilir. Bir diğer zorluk, minimum süre en az 2 gün olacak şekilde kültür zamanıdır. Bekleme süresinin üstesinden gelmek için, üreticiler kademeli partilerde küreler veya bc kürelerin istikrarlı bir şekilde tedariki için sürekli bir akış reaktörü üretebilir. Bu zorluklar göz önüne alındığında bile, BC küreleri bakteriyel selülozun sürdürülebilir üretimi ve BC matrisi içindeki çeşitli malzemeleri kapsülleme yeteneği için ilginç bir yöntem sunun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Adolfo Martinez, Catherine Mulholland, Tyler Somerville ve Laurel Bitterman tarafından montana tech araştırma yardımcı mentorluk programının devamıdır. Araştırma, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No. OIA-1757351 ve Muharebe Kabiliyetleri Geliştirme Komutanlığı Ordu Araştırma Laboratuvarı (Kooperatif Anlaşma Numarası W911NF-15-2-0020). Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya öneri yazarların görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı veya Ordu Araştırma Laboratuvarı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. Amy Kuenzi, Lee Richards, Katelyn Alley, Chris Gammons, Max Wohlgenant ve Kris Bosch'a da katkılarından dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL graduated cylinder | |||
| 1000 mL beaker | |||
| 25 mL graduated cylinder | |||
| 250 mL Erlenmeyer baffled flask | Chemglass | CLS-2040-02 | |
| 500 mL beaker | |||
| Balance | |||
| Biochar | Ponderosa pine heat treated under argon gas, heated at 15 °C per minute to 800 °C | ||
| Black tea | |||
| Deionized water | |||
| Distilled white vinegar | |||
| Elastic band | |||
| Microbial starter culture | Cultures for Health | ||
| Mine waste | Collected from Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Mine waste contains soil and metals originating from past copper mining. Mn, Si, Ca, Al, and Fe were the five most prevalent elements measured in the mine waste through x-ray diffraction. | ||
| Mortar and pestle | |||
| Orbital shaker | Used various brands | ||
| Paper towel | |||
| Polystyrene microbeads | Polybead | 17138 | 3 micron diameter |
| Stir rod | |||
| Sucrose | |||
| Tea kettle | |||
| TGA | TA Instruments | TA Q500 | 400 °C/min to 800 °C, 100 mL/min N2 |
| Thermometer | |||
| XRF Analyzer | ThermoFisher Scientific | 10131166 |
References
- Mohainin Mohammad, S., Abd Rahman, N., Sahaid Khalil, M., Rozaimah Sheikh Abdullah, S. An Overview of Biocellulose Production Using Acetobacter xylinum Culture. Advances in Biological Research. 8 (6), 307-313 (2014).
- Dufresne, A.
- Czaja, W., Romanovicz, D., Brown, R. M. Structural investigations of microbial cellulose produced in stationary and agitated culture. Cellulose. 11 (3-4), 403-411 (2004).
- Hu, Y., Catchmark, J. M. Formation and characterization of spherelike bacterial cellulose particles produced by acetobacter xylinum JCM 9730 strain. Biomacromolecules. 11 (7), 1727-1734 (2010).
- Goh, W. N., Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim, A. A., Bhat, R. Microstructure and physical properties of microbial cellulose produced during fermentation of black tea broth (kombucha). International Food Research Journal. 19 (1), 153-158 (2012).
- Toyosaki, H., Naritomi, T., Seto, A., Matsuoka, M., Tsuchida, T., Yoshinaga, F. Screening of Bacterial Cellulose-producing Acetobacter Strains Suitable for Agitated Culture. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 59 (8), 1498-1502 (1995).
- Shi, Z., Zhang, Y., Phillips, G. O., Yang, G.
- Holland, M. C., Eggensperger, C. G., Giagnorio, M., Schiffman, J. D., Tiraferri, A., Zodrow, K. R. Facile Postprocessing Alters the Permeability and Selectivity of Microbial Cellulose Ultrafiltration Membranes. Environmental Science and Technology. 54 (20), 13249-13256 (2020).
- Le Hoang, S., Vu, C. M., Pham, L. T., Choi, H. J. Preparation and physical characteristics of epoxy resin/ bacterial cellulose biocomposites. Polymer Bulletin. 75 (6), 2607-2625 (2018).
- Vu, C. M., Nguyen, D. D., Sinh, L. H., Pham, T. D., Pham, L. T., Choi, H. J. Environmentally benign green composites based on epoxy resin/bacterial cellulose reinforced glass fiber: Fabrication and mechanical characteristics. Polymer Testing. 61, 150-161 (2017).
- Pavaloiu, R. D., Stoica, A., Stroescu, M., Dobre, T. Controlled release of amoxicillin from bacterial cellulose membranes. Central European Journal of Chemistry. 12 (9), 962-967 (2014).
- Trovatti, E., et al. Biocellulose membranes as supports for dermal release of lidocaine. Biomacromolecules. 12 (11), 4162-4168 (2011).
- Trovatti, E., et al. Bacterial cellulose membranes applied in topical and transdermal delivery of lidocaine hydrochloride and ibuprofen: In vitro diffusion studies. International Journal of Pharmaceutics. 435 (1), 83-87 (2012).
- Shaviv, A., Mikkelsen, R. L. Controlled-release fertilizers to increase efficiency of nutrient use and minimize environmental degradation - A review. Fertilizer Research. 35 (1-2), 1-12 (1993).
- Eggensperger, C. G., et al.
- Schröpfer, S. B., et al. Biodegradation evaluation of bacterial cellulose, vegetable cellulose and poly (3-hydroxybutyrate) in soil. Polimeros. 25 (2), 154-160 (2015).
- Orts, W. J., Glenn, G. M. Reducing soil erosion losses with small applications of biopolymers. ACS Symposium Series. 723, 235-247 (1999).
- Mohite, B. V., Patil, S. V. A novel biomaterial: Bacterial cellulose and its new era applications. Biotechnology and Applied Biochemistry. 61 (2), 101-110 (2014).
- Mikkelsen, R. L. Using hydrophilic polymers to control nutrient release. Fertilizer Research. 38 (1), 53-59 (1994).
- Du, C. W., Zhou, J. M., Shaviv, A. Release characteristics of nutrients from polymer-coated compound controlled release fertilizers. Journal of Polymers and the Environment. 14 (3), 223-230 (2006).
- Serafica, G., Mormino, R., Bungay, H. Inclusion of solid particles in bacterial cellulose. Applied Microbiology and Biotechnology. 58 (6), 756-760 (2002).
- Tomaszewska, M., Jarosiewicz, A. Use of polysulfone in controlled-release NPK fertilizer formulations. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (16), 4634-4639 (2002).
- González, M. E., et al. Evaluation of biodegradable polymers as encapsulating agents for the development of a urea controlled-release fertilizer using biochar as support material. Science of the Total Environment. 505, 446-453 (2015).
- Shavit, U., Shaviv, A., Shalit, G., Zaslavsky, D. Release characteristics of a new controlled release fertilizer. Journal of Controlled Release. 43 (2-3), 131-138 (1997).
- Kolakovic, R., Laaksonen, T., Peltonen, L., Laukkanen, A., Hirvonen, J. Spray-dried nanofibrillar cellulose microparticles for sustained drug release. International Journal of Pharmaceutics. 430 (1-2), 47-55 (2012).
- Zaharia, A., et al. Bacterial cellulose-poly(acrylic acid-: Co-N, N ′-methylene-bis-acrylamide) interpenetrated networks for the controlled release of fertilizers. RSC Advances. 8 (32), 17635-17644 (2018).
- Peterson, J. D., Vyazovkin, S., Wight, C. A. Kinetics of the thermal and thermo-oxidative degradation of polystyrene, polyethylene and poly(propylene). Macromolecular Chemistry and Physics. 202 (6), 775-784 (2001).
- Goh, W. N., Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim, A. A., Bhat, R. Fermentation of black tea broth (kombucha): I. effects of sucrose concentration and fermentation time on the yield of microbial cellulose. International Food Research Journal. 19 (1), 109-117 (2012).
- Zhu, H., Jia, S., Yang, H., Jia, Y., Yan, L., Li, J. Preparation and application of bacterial cellulose sphere: A novel biomaterial. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 25 (1), 2233-2236 (2011).
- Nguyen, V. T., Flanagan, B., Gidley, M. J., Dykes, G. A. Characterization of cellulose production by a Gluconacetobacter xylinus strain from Kombucha. Current Microbiology. 57 (5), 449-453 (2008).
- Costa, A. F. S., Almeida, F. C. G., Vinhas, G. M., Sarubbo, L. A. Production of bacterial cellulose by Gluconacetobacter hansenii using corn steep liquor as nutrient sources. Frontiers in Microbiology. 8, 1-12 (2017).
- Watanabe, K., Tabuchi, M., Morinaga, Y., Yoshinaga, F. Structural features and properties of bacterial cellulose produced in agitated culture. Cellulose. 5 (3), 187-200 (1998).
