Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה קלה וזולה ליצירת תאית חיידקית (BC) כדורים. ביו-חומר זה יכול לתפקד כאמצעי אנקפסולציה לחומרים מוצקים, כולל ביו-פחם, כדורי פולימר ופסולת מכרות.
Abstract
כדורי תאית בקטריאלית (BC) נחקרו יותר ויותר מאז הפופולריזציה של BC כחומר חדשני. פרוטוקול זה מציג שיטה סבירה ופשוטה לייצור כדור BC. בנוסף לייצור תחומים אלה, זוהתה גם שיטת אנקפסולציה לחלקיקים מוצקים. כדי לייצר כדורי BC, מים, תה שחור, סוכר, חומץ, ותרבות חיידקים משולבים בקבוק מבולבל ואת התוכן נסערים. לאחר קביעת תנאי התרבות המתאימים להיווצרות כדור BC, יכולתם לתמצת חלקיקים מוצקים נבדקה באמצעות ביו-פחם, חרוזי פולימר ופסולת מכרה. תחומים התאפיינו באמצעות תוכנת ImageJ וניתוח כבידתי תרמי (TGA). התוצאות מצביעות על כך שניתן לבצע כדורים בקוטר 7.5 מ"מ ב-7 ימים. הוספת חלקיקים שונים מגדילה את טווח הגודל הממוצע של כמוסות BC. הספירות עטפו 10 - 20% מהמסה היבשה שלהן. שיטה זו מציגה ייצור כדור בעלות נמוכה ואנקפסולציה אפשרית עם חומרים הניתנים להשגה בקלות. תחומי BC עשויים לשמש בעתיד כסיוע להסרת מזהמים, ציפוי דשן בשחרור מבוקר או תיקון קרקע.
Introduction
תאית חיידקית (BC) כבר ציין לשימוש בתעשייה הפוטנציאלית שלה בשל כוח מכני שלה, טוהר גבוה גבישיות, יכולות החזקת מים, ומבנה סיביםמורכבים 1,2,3,4. מאפיינים אלה הופכים את BC לביו-חומרית חיובית עבור מגוון יישומים, כולל ביו-רפואי, עיבוד מזון ותיקון סביבתי משתמש ב- 1. היווצרות של סרט BC יכול להיעשות עם תרבויות אורגניזם יחיד אותרבויותמעורבות כמו אלה המשמשים kombucha 5 , משקה תה מותסס. מבשלת קומבוצ'ה מסתמכת על "תרבות סימביוטית של חיידקים ושמרים", הידוע בכינויו SCOBY. באמצעות תרבות סימביוטית זו של אורגניזמים, טכניקה דומה משמשת ליצירת ספירות BC. ביו-חומר זה עשוי להיות מועסק כדי לסייע בבידוד מזהמים סביבתיים ולעגן תיקונים חקלאיים כמו ביו-פחם כדי להשיג ייצור יבול יעיל יותר.
ספרות קודמת דנה כיצד המאפיינים של BC המיוצר בתנאים נסערים להשוות לפנה"ס המיוצר בתרבות נייחת. תרבות נייחת גורמת לסרט שנוצר בממשק האוויר הנוזלי, בעוד שתרבות מזועזעת גורמת לחלקיקי BC שונים, גדילים וספירות התלויים בתוך הנוזל6. מחקרים רבים התייחסו לטענה כי הייצור המסחרי של BC הוא ריאלי יותר בתנאים הדינמיים6,7, מתן רציונל ליישום השיטה של נייר זה. בנוסף, נערכו חקירות שונות על המבנה והמאפיינים של תחומי BC. Toyosaki et al.6 השווה צלושי ארלנמייר מבולבלים וחלקים בהפקתם הנסערת לפני הספירה. מחקר שנערך על ידי הו ו Catchmark4 קבע תנאים עבור ספירות BC ששימשו כהנחיות לתהליך הייצור הנוכחי של כדור BC, ותוצאותיהם מצביעות על כך שגודל הספירה אינו ממשיך לגדול לאחר 60 שעות. סקירה של ייצור BC על ידי מוחמד ואח'1 עולה כי טלטול תרבות BC מבטיח אפילו אספקת חמצן והפצה, אשר הכרחי לצמיחה מוצלחת BC. הולנד ואח '8 חקרו את הקריסטליות והמבנה הכימי של BC באמצעות עקיפת קרני רנטגן וספקטרוסקופיית אינפרא אדום של טרנספורמציה פורייה. ההנחה היא כי קפסולות BC יציגו מאפיינים דומים ומחקר עתידי יחקור תכונות מבניות. מחקרים חקרו גם את ההשפעות החיוביות של שימוש ב- BC כדי לייצר ביו-קומפוזיטים משופרים. באמצעות אפוקסי-שף כבסיס, החוקרים הראו כי התוספת של BC משפר מאפיינים חומריים כמו חיי עייפות, קשיחות שבר, מתיחה וכוח flexural9,10. כפי שמוצג על ידי מחקרים בעבר ובהווה, רבים מעוניינים במסחור השימוש ב- BC.
חוקרים רבים חקרו תאית חיידקית במערכות שחרור מבוקרות, והשיטה המתוארת כאן מייצרת כמוסות שניתן להשתמש בהן כמערכות שחרור מבוקרות. חלק גדול ממחקר זה מתמקד בשחרור מבוקר בתחום הביו-רפואי, כמו גם בכמה מחקרים בניהול דשן שחרור מבוקר (CRF). בהתבסס על ההצלחה של שחרור מבוקר של BC של אמוקסיצילין11, לידוקאין12, ואיבופרופן13, BC עשוי להפגין מאפייני משלוח דומים עם חומרים אחרים, כגון דשן כדורי. סקירה כללית של CRF של שביב ומיקלזן14 מכירה בכך ש-CRF's יעילים יותר, חוסכים בעבודה, ובדרך כלל גורמים פחות השפלה סביבתית מאשר יישום דשן קונבנציונלי. תאית חיידקית עשויה לעבוד כחומר אנקפסולטור חיובי עבור CRF של. דשנים עשויים להחליק מתוך קרום BC או פריקה כמו מתכלים BC15,16. קיבולת נפיחות מים גבוהה של BC יכול לשמש גם תיקון קרקע מועיל17,18,19 כי הן חומרים מזינים דשן ולחות עשוי לשחרר לתוך הקרקע באמצעות יישום של כדורי BC. עם תכונות אלה, CRF שנוצר על ידי אנקפסולציה כדור BC עשוי להיות יתרון על פני חומרי ציפוי דשן אחרים שיכולים להיות השפעות שליליות במהלך שלבי הייצור וההשלכה שלהם. התאמת BC לציפוי דשן עשויה לשפר עוד יותר את טכנולוגיות CRF. על ידי הורדת קצב שחרור דשן, לגידולים יהיה מספיק זמן כדי לכבוש את הדשן ולמנוע נגר עודף לתוך גופי מים, ובכך להפחית eutrophication ואזורים לא מתוחכמים. דשנים דומים לשחרור איטי הוכנו והוטחו באמצעות ציפוי פולימר20.
שלא כמו פרוטוקולים שתוארו במחקרים קודמים, זה מתמקד בייצור כדור אחיד ומלוכד ולא בתפוקה תאית גבוהה. יתר על כן, אנקפסולציה BC של מוצקים אחרים נחקרה עם סרטים תאית, אבל לא כדורים21. על ידי הרחבת המחקר על כדורי תאית חיידקית, ניתן לבצע צעדים נוספים כדי לייצר BC מסחרית, אשר מועיל בגלל תכונות בטוחות לסביבה של BC. שיטה זו של ייצור כדור BC מנצלת מרכיבים קולינריים זולים, זמינים. לאחר ההרכבה הראשונית, ספירות BC מתחילות להיווצר תוך יומיים ללא הפרעה. הפקת תחומי BC באמצעות אסטרטגיה זו דורשת מעט מקום ויש לה תוצר-על אכיל, תה מותסס 'kombucha'. טכניקות אנקפסולציה המוזכרות במחקרים אחרים כוללות ציפויים שנוצרו באמצעות טכניקת היפוך פאזה22,23, היווצרות מטריצה24, ייבוש ספריי25, ו אנקפסולציה ישירה במהלך סינתזה26. שיטת האנקפסולציה הישירה המתוארת בכתב יד זה שימושית למי שרוצה תהליך קל וזול העושה שימוש בחומרים זמינים.
באמצעות מחקר זה נוצר פרוטוקול מוצלח לייצור ואקפסולציה של כדור BC. כדורי BC יכולים לתמצת חלקיקים מוצקים של ביו-פחם, זנבות מוקשים ומיקרוביאדות פוליסטירן בתוך המבנים האישיים שלהם. למרות שעדיין לא נעשה שימוש נרחב בתעשייה, BC הוא חומר מעשי, בר קיימא, המתרחשים באופן טבעי שיכול לשמש עבור יישומים עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. יצירה ותחזוקה של תרבות המתנע תאית חיידקית
- להשיג תרבות המתנע של תאית חיידקית, כ 50 גרם, בצורה של SCOBY. ניתן לרכוש אותו באופן מסחרי (למשל, מתרבויות לבריאות). מניחים את SCOBY לתוך 1 L, מכוסה במגבת נייר.
- מרתיחים 700 מ"ל של מים שעברו דה-יון, מעבירים אותו לכלי נפרד מזה המכיל את ה-SCOBY ומוסיפים 85 גרם סוכרוז.
- לאחר שהסוכרוז נמס, מוסיפים 2 שקיות תה שחור (4.87 גרם). תלול את התה במשך 1 שעה, ולאחר מכן להסיר בזהירות את שקיות התה באמצעות מוט ערבוב.
- מוסיפים 200 מ"ל של חומץ לבן מזוקק לתה. תן את התערובת להתקרר ל 25 מעלות צלזיוס. לאחר הקירור, מוסיפים 700 מ"ל של תה טמפרטורת החדר לכומת המכילה את SCOBY.
התראה: הוספת תה חומצי בזמן שהוא חם מדי עלולה לפגוע באורגניזמים ב- SCOBY. - מכסים את הכף במגבת נייר ומאבטחים אותה ברצועה אלסטית, ומניחים את הכף באזור אחסון השומר על טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. כלי זה מכונה בדרך כלל תרבות מלאי או מלון.
- כדי לשמור על SCOBY בריא, תחזוקה נדרשת כ 2 פעמים בחודש.
- באמצעות ידיים כפפה כדי לעצור את מחצלות SCOBY, לנקז את הנוזל מהמלון לתוך קבוצה נפרדת. במיכל עם הנוזל, מוסיפים מספיק תה חומצי עבור סך של 700 מ"ל של פתרון.
- ממיסים 65 גרם סוכרוז במיכל עם התה החומצי. בזמן ההמתנה סוכרוז להתמוסס, בזהירות לשטוף את מחצלות SCOBY במים DI.
- לאחר שהסוכרוז מומס במלואו, ניתן להוסיף את הנוזל לכומתה המכילה את מחצלות SCOBY השטופות. מכסים את הכוויה ומחזירים אותה לאזור הדגירה.
2. ייצור כדורי תאית חיידקיים
הערה: נקוט זהירות בעת עבודה עם מים רותחים. ודא שכלי זכוכית יכולים לעמוד בטמפרטורות המים הרותחים, נקיים מפגמים, והוא בגודל המתאים. סכמטי המתאר את הייצור של כדורי BC ניתן באיור 1.
- מרתיחים 350 מ"ל של מים שעברו דה-יון באמצעות קומקום תה. מעבירים את המים החמים ל-500 מ"ל. ממיסים 42.5 גרם סוכרוז מגורען לתוך המים החמים באמצעות מוט ערבוב.
- כאשר סוכרוז מומס במלואו, תלול 1 שקית תה שחור (2.54 גרם) בבקבוק המכיל את סוכרוז ומים במשך 1 שעות. לאחר מכן, להסיר את שקית התה עם מוט ערבוב, מקפיד להימנע לשבור לפתוח את שקית התה, ולאחר מכן להיפטר ממנו לפח.
- מוסיפים 100 מ"ל של חומץ לבן מזוקק לכופת, ולאחר מכן מערבבים ביסודיות את התערובת. מעבירים 80 מ"ל של תערובת התה החומצי לבקבוק 250 מ"ל מבולבל. אפשר לתערובת התה להתקרר לטמפרטורת החדר, 20 - 25 מעלות צלזיוס.
הערה: בשלב זה, התערובת ניתן להשאיר להתקרר לילה או עד מוכן לשלב הבא. - לאחר הטמפרטורה הנוזלית היא בטמפרטורת החדר (20 - 25 מעלות צלזיוס), להוסיף 20 מ"ל של נוזל תרבות המתנע מיקרוביאלית לבקבוק מבולבל. ניתן להשיג נוזל זה ממלון SCOBY. מכסים את הבקבוק בפרפילם.
- מניחים את הבקבוק המבולבל על שולחן טלטול מסלולי ומגדירים את המהירות ל-125 סיבובים לדקה (סל"ד). אפשר לתערובת לרעוד במשך 3 ימים בחדר או באינקובטור עם טמפרטורה של 20 - 25 מעלות צלזיוס כדי לייצר כדורי BC.
הערה: אם צורות לא סדירות נוצרות בתכולת הבקבוק או אם גושים תאית נדבקים לקירות הבקבוק, יש להסיר אותן כדי למנוע היווצרות מסות BC לא סדירות נוספות. השתמש בפינצטה כדי להסיר מסות BC לא רצויות, כולל מחרוזות דקות, טבעות, צורות צינוריות וצורות אחרות שאינן כדוריות בעליל. - לאחר שהכדורים נוצרו, יוצקים אותם בעדינות מהבקבוק ומנתחים, נפטרים או משתמשים בהם באופן שאינו מתואר במאמר זה.
3. שימוש בכדורי תאית חיידקיים כדי לתמצת חלקיקים או מזהמים
- בצע את שלבים 2.1-2.5 לעיל.
- לאחר רועד במשך 3 ימים, להוסיף כ 0.01 גרם של חומר חלקיקי הקרקע דק לבקבוק מבולבל. מוצקים מתאימים כוללים ביו-פחם (260 ± 140 מיקרומטר), פסולת מכרה (350 ± 140 מיקרומטר) ומיקרוביאדות פוליסטירן (3 מיקרומטר). נתונים עבור חומרים אלה מפורטים במקטע תוצאות מייצגות. אנא עיינו בטבלת החומרים המצורפת לקבלת תיאורים נוספים של ביו-פחם, פסולת מכרות ומיקרוביאדות.
- מכסים את הבקבוק שוב עם parafilm ומניחים אותו בחזרה על שייקר מסלולית, באמצעות אותה מהירות וטמפרטורת הסביבה (20 - 25 מעלות צלזיוס) במשך 3 ימים נוספים. הסר את החלקיקים האנקפסולציה של BC לצורך ניתוח, סילוק או שימושים אחרים.
איור 1. ייצור כדור תאית חיידקית ואקפסולציה של חלקיקים מוצקים. שלב 1 כרוך בשילוב תרבות מלאי חיידקים עם תה שחור, סוכר, וחומץ מדיה בבקבוק מבולבל. הדיסקים בתרבות המניות מייצגים מחצלות BC. לאחר מכן, הבקבוק המבולבל ממוקם על שולחן לנער מסלולית במשך 3 ימים. השלב האמצעי מראה מוצקים המתווסף לבקבוק לאחר שנוצרים ספירות BC. הבקבוק מזועזע לעוד 3 ימים. בשלב האחרון, ספירות BC המשיכו לגדול בגודלן ותקפו את החלקיקים המוצקים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ל-BC ספירות יש את קצב הצמיחה המהיר ביותר ב-48 השעות הראשונות של התרבות (איור 2). איור 2 מראה גם כיצד הספירות נוטות להגיע לגודל ממוצע מרבי ולאחר מכן להישאר קבועות. בניסוי זה, הכדורים הגיעו לקוטר ממוצע של 7.5 ± 0.2 מ"מ. אף-על-פי שספירות ה-BC לעולם אינן מתדרדרות לחלוטין בתוך תקופת הצמיחה בת 10 הימים, הן אכן התחילו ליצור קנוקנות המשתרעות מן הגוף הראשי של הספירה סביב היום השמיני. ניתן לראות זאת באיור 2E, בעיקר על הכדור הגדול משמאל למעלה.
החלת שיטת האנקפסולציה המתוארת במאמר זה גורמת לממוצע של 57 ± 4 כדורי תאית חיידקיים בקוטר שבין 3 ל-12 מ"מ (איור 3). באיור 3 ניתן לראות גם כי לתוספת המוצקים לכדורי BC אין השפעה עקבית על גודל כדור או תדירותו. נראה כי מהירות הרעידות במסלול, טמפרטורת הסביבה והיווצרותם של חלקיקים לא סדירים הם הגורמים העיקריים המשפיעים על הצורה, הגודל והתדירות של חלקיקים כדוריים. איור 4 מראה כיצד טמפרטורת חדר גבוהה מדי והסרה לא נכונה של גושים לא סדירים יכולים לשנות את ה-BC מספירה שלמה (איור 4B) לחלקיקים כוכביים(איור 4A)או גושים חוטיים(איור 4C).
כדי לקבוע את השבר של מוצקים עטופים בעולמות BC, ניתוח כבידתי תרמי נעשה על ארבע דגימות שונות של לפני הספירה. ארבע הדגימות שנבדקו היו לפני הספירה, לפני הספירה עם ביו-פחם, BC עם מיקרוביאדות פוליסטירן, ו-BC עם פסולת מכרה. איור 5 מראה כיצד הדגימות הבודדות התנהגו כאשר נחשפו לטמפרטורה גבוהה בגז חנקן. ניתן לראות מהקו המקווקו המייצג ספירות לפני הספירה עם פסולת מכרה כי 18.7% מהמדגם היה פסולת שלי לפי משקל, חושף אנקפסולציה מוצלחת. הקו המקווקו מראה ש-14.5% מהדגימה הכילה ביו-פחם. אחוזים אלה חושבו על ידי חיסור אחוז המסה BC רגיל מאחוז המסה של דגימות עם מוצקים הוסיף. מכיוון ש-BC ופוליסטירן מתפרקים בטמפרטורות דומות, עקומות המסה הנגזרות התפרקו כדי להפריד את פירוק הפולימר מזה של תאית (איור 6). ניתוח זה מראה כי 13% של אובדן המוני במדגם זה תואם את השפלה תרמית של פוליסטירן. בגלל השפלה תרמית של פוליסטירן מסודר מוביל לאובדן המוני של כ 100%27, ההערכה היא כי כל 13% של המסה של המדגם מתאים חרוזי פוליסטירן אנקפסולציה. איור 7 מראה שתמיסת המיקרוביאד הפוליסטירן הכחולה הביאה ל-BC כחול (איור 7D). מסות BC מיובשות אלה הן הדגימות ששימשו עבור TGA.
איור 2. צמיחת תאית חיידקית. (א) קוטר של כמוסות תאית חיידקיות לאורך זמן; תצלומים של כמוסות תאית חיידקיות ב - (B) 1 יום, (C) 3 ימים, (D), 7 ימים, ו - (E) 10 ימים. תאית חיידקית גדלה ב 20 - 25 מעלות צלזיוס בבקבוק ארלנמייר מבולבל על שייקר מסלולית ב 125 סל"ד. תמונות של כדורי תאית חיידקיים צולמו עם ג'ל דוק XR וניתוח גודל בוצע באמצעות ImageJ. נתונים בחלונית A מיוצגים כמשמעותיים עם קווי שגיאה המצינים את סטיית התקן (n ≥ 8). סרגלי קנה מידה מייצגים 10 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. חלוקת גודל של כמוסות ב 7 ימים. עם (A) ללא מוצקים נוספים; (B) ביו-פחם; (C)מיקרוביאדות פלסטיק; ו-(ד)פסולת מכרה מוצקה. תאית חיידקית גדלה בטמפרטורות הנעות בין 20 ל -25 מעלות צלזיוס בבקבוק ארלנמייר מבולבל על שייקר מסלולי ב 145 סל"ד. מדיה צמיחה הכילה 0.0101-0.0114% תוספים. תמונות של כדורי תאית חיידקיים צולמו עם ג'ל דוק XR וניתוח גודל בוצע באמצעות ImageJ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. תוצאות אפשריות מניסויים תת-אופטימליים. (A)חלקיקי כוכבי תאית חיידקיים נוצרו ב 30 °C (70 °F) ו 140 סל"ד; (B)כדור כדורי לפנה"ס נוצר ב 20 - 25 °C (70 °F) ו 125 סל"ד; ו- (C) כדוריות לפנה"ס נוצרו ב 20 - 25 °C (70 °F) ו 140 סל"ד כאשר צורות לא סדירות אינם מוסרים מן הבקבוק כפי שהם יוצרים. תמונות בשחור לבן צולמו עם ג'ל דוק XR והתמונה הצבעונית צולמה עם Surface Pro. כל התמונות נותחו באמצעות ImageJ וכל סרגלי קנה המידה מייצגים 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. שבר של מוצקים עטופים. (A)עקבות כבידתיים תרמיים של כמוסות; עם (B) ללא מוצקים נוספים; (C) ביו-צ'אר; (D)חיידקים מפלסטיק; ו-(ה)פסולת שלי. לפני TGA, דגימות היו מיובשים על מגבת נייר במשך 3 ימים כדי להסיר מים עודפים. ניתוחים כבידתיים תרמיים בוצעו עם רמפת חימום של 4 מעלות צלזיוס / דקה עד 800 מעלות צלזיוס בגז חנקן. תמונות של כדורי תאית חיידקיים צולמו עם ג'ל דוק XR. החצים האדומים מצביעים על חלקיקים מוצקים עטופים. סרגלי קנה מידה מייצגים 10 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. אחוז המסה של אנקפסולציה כפי שנקבע על ידי השוואה של פרופילי TGA דיפרנציאליים של (A) לפני הספירה עם microbeads פוליסטירן ו -( B) פשוט לפני הספירה. פרופיל TGA הדיפרנציאלי של BC רגיל יכול להיות מצויד בארבע עקומות גאוסיות המופיעות בסדרי גודל כמעט זהים ב- BC עם חרוזי פוליסטירן. עם זאת, שיא חמישי (מוצג באדום) מרוכז סביב טמפרטורת הפירוק של פוליסטירן מופיע גם האחרון. שיא זה יוחס לפירוק תרמי המשויך לחרוזי הפוליסטירן. האזור שמתחתיו, 13%, מתאים לאובדן מסה באחוזים הקשורים לפוליסטירן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7. BC דגימות ייבוש על מגבת נייר בצלחת פטרי מכוסה. (A) ו - (B) תאית חיידקית רגילה; (C) לפנה"ס עם ביו-פחם; (D)לפני הספירה עם חיידקים מפלסטיק; ו-(E)לפני הספירה עם פסולת שלי. התמונה צולמה עם Surface Pro ונותחה באמצעות ImageJ. סרגל קנה המידה מייצג 1 ס"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטות ייצור ואקפסולציה של BC, קלות להתנהלות וחסכוניות. באמצעות התאמות שונות לפרוטוקול המקורי, זוהה תהליך מתאים. יש לנקוט בצעדים קריטיים כדי להבטיח תחומים בני קיימא. כל המרכיבים המעורבים בהיווצרות BC ממלאים תפקיד מפתח בבריאות ובעמידות של הספירות. סוכרוז מאכיל אורגניזמים, התה מספק חנקן, ואת חומץ מוריד את ה- pH לתנאים אופטימליים כדי למנוע מזהמים לא רצויים28. משתנה חשוב נוסף בשיטה זו הוא הטמפרטורה. יש לקרר את התה לטמפרטורת החדר (כ-25 מעלות צלזיוס) לפני הוספת תרבות המתנע המיקרוביאלית. אם האורגניזמים חשופים לטמפרטורות גבוהות, צמיחת כדור BC עשויה להיות מעוכבת. הטמפרטורה של החדר שבו הבקבוק רועד משפיעה גם על צמיחת כדור3,28,29. רעידות בטמפרטורות החדר מעל 30°C גורמות להיווצרות צורות BC לא סדירות (איור 4A). בתהליך אנקפסולציה, צעד מפתח הוא לאפשר כדורי BC להיווצר לפני הוספת חלקיקים מוצקים. זאת בשל התצפית כי נוכחותם של חפצים זרים בבקבוק עיכבה את צמיחת BC.
תנאי תרבות שונים משפיעים על ההצלחה של ייצור כדור BC, כפי שמוצג גם על ידי הו ו Catchmark4. BC נוצר בצורה הטובה ביותר בבקבוקים מבולבלים על שולחן לנער מסלולית. נוכחותם של מבלבלים האיצה את התפתחות הכדור בהשוואה לבקבוקים בעלי קירות חלקים6. ערבוב קונבנציונלי עם מוט מגנטי מנע היווצרות כדור. בנוסף, יחסים שונים של תרבות המתנע המיקרוביאלית ותערובת התה השפיעו על ייצור כדורים ושפע. בתחילה, 3 מ"ל של תרבות המתנע (2.10 אחוז המוני של פתרון) התווסף 140 מ"ל של מדיה תה. לאחר ניסויים מתמשכים, כמות תרבות המתנע המיקרוביאלית הוגדלה תוך הפחתת נפח מדיית התה. כמויות סופיות בשימוש היו 20 מ"ל של תרבות המתנע מיקרוביאלית (20 מסה %) ו 80 מ"ל של תערובת תה. עבור מהירות הסיבוב, היווצרות כדור BC לא הצליחה כאשר מזועזע במהירויות מתחת 100 סל"ד. מהירויות של 125, 140 ו- 150 סל"ד מייצרות כדורים אך יש שונות בגודל כדור, במספר ובצורה, כפי שדווח בעבר6,29.
כתהליך היווצרות BC, תרבות נסערת עדיפה על תרבות סטטית, כאמור2. בהשוואה לשיטות המוסברות במחקרים אחרים, זו פחות מסובכת ודורשת פחות חומרים. ספרות אחרת מזכירה הכנת תרבות מלאי של BC על ידי תחילה תסיסה מדיום סטטי או נסער ולאחר מכן קצירת תאי BC לחיסון בתרבות הראשית3,4,6,28,29,30. כמה שיטות קצירת תאים כוללות טלטול נמרץ ואזסינון 30, מיזוג ואזסינון 4, וצנטריפוגה3,29. תאי BC המשולבים בתהליך ייצור זה זמינים תמיד במיכלי תרבות המתנע המיקרוביאלי, ולכן אין צורך בקצירת תאים. יתר על כן, על ידי תרומה שיטה אחרת של היווצרות תחום BC לספרות הקיימת, השימוש המסחרי BC הוא בר השגה יותר. זה מועיל בגלל תכונות החומר הידידותיות לסביבה של BC29,31.
למרות BC הוא biomaterial מעניין ובעל ערך פוטנציאלי, ישנם עדיין אתגרים לשימוש הנרחב שלה כמו מחקרים קודמים מצביעים על18,32. בשיטה זו, קיימים חוסר עקביות עם גודל וצורה של כדור BC. מבנים צינוריים דמויי גדילים נוצרים לעיתים במדיה2,18,32. BC גם נדבק לקירות הבקבוקים, ויוצר טבעות שלעיתים מושעות בנוזל, ויש להסירן כדי למנוע היווצרות של אי סדרים נוספים. בעוד שתחומים אחידים מאפשרים ניתוח מדעי עקבי, ייתכן שהם לא יידרשו לשימושים תעשייתיים מסוימים. אתגר נוסף הוא זמן התרבות, כאשר משך הזמן המינימלי הוא לפחות יומיים. כדי להתגבר על תקופת ההמתנה, יצרנים יכולים לייצר כדורים בקבוצות מתנדנדות או כור זרימה מתמשך לאספקה קבועה של כדורי BC. אפילו בהתחשב באתגרים אלה, תחומי BC מציגים שיטה מעניינת לייצור בר קיימא של תאית חיידקית ואת היכולת לתמצת חומרים שונים בתוך מטריצת BC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו היא המשך של פרויקט תוכנית חונכות מחקר טק מונטנה על ידי אדולפו מרטינז, קתרין מולהולנד, טיילר סומרוויל, לורל ביטרמן. המחקר מומן על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט לא. OIA-1757351 ומעבדת המחקר של צבא הפיקוד לפיתוח יכולות לחימה (מספר הסכם שיתוף פעולה W911NF-15-2-0020). כל חוות דעת, ממצאים ומסקנות, או המלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את עמדות הקרן הלאומית למדע או מעבדת המחקר של הצבא. ברצוננו גם להודות לאיימי קונצי, לי ריצ'רדס, קייטלין אלי, כריס גמונס, מקס וולגנט וקריס בוש על תרומתם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL graduated cylinder | |||
| 1000 mL beaker | |||
| 25 mL graduated cylinder | |||
| 250 mL Erlenmeyer baffled flask | Chemglass | CLS-2040-02 | |
| 500 mL beaker | |||
| Balance | |||
| Biochar | Ponderosa pine heat treated under argon gas, heated at 15 °C per minute to 800 °C | ||
| Black tea | |||
| Deionized water | |||
| Distilled white vinegar | |||
| Elastic band | |||
| Microbial starter culture | Cultures for Health | ||
| Mine waste | Collected from Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Mine waste contains soil and metals originating from past copper mining. Mn, Si, Ca, Al, and Fe were the five most prevalent elements measured in the mine waste through x-ray diffraction. | ||
| Mortar and pestle | |||
| Orbital shaker | Used various brands | ||
| Paper towel | |||
| Polystyrene microbeads | Polybead | 17138 | 3 micron diameter |
| Stir rod | |||
| Sucrose | |||
| Tea kettle | |||
| TGA | TA Instruments | TA Q500 | 400 °C/min to 800 °C, 100 mL/min N2 |
| Thermometer | |||
| XRF Analyzer | ThermoFisher Scientific | 10131166 |
References
- Mohainin Mohammad, S., Abd Rahman, N., Sahaid Khalil, M., Rozaimah Sheikh Abdullah, S. An Overview of Biocellulose Production Using Acetobacter xylinum Culture. Advances in Biological Research. 8 (6), 307-313 (2014).
- Dufresne, A.
- Czaja, W., Romanovicz, D., Brown, R. M. Structural investigations of microbial cellulose produced in stationary and agitated culture. Cellulose. 11 (3-4), 403-411 (2004).
- Hu, Y., Catchmark, J. M. Formation and characterization of spherelike bacterial cellulose particles produced by acetobacter xylinum JCM 9730 strain. Biomacromolecules. 11 (7), 1727-1734 (2010).
- Goh, W. N., Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim, A. A., Bhat, R. Microstructure and physical properties of microbial cellulose produced during fermentation of black tea broth (kombucha). International Food Research Journal. 19 (1), 153-158 (2012).
- Toyosaki, H., Naritomi, T., Seto, A., Matsuoka, M., Tsuchida, T., Yoshinaga, F. Screening of Bacterial Cellulose-producing Acetobacter Strains Suitable for Agitated Culture. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 59 (8), 1498-1502 (1995).
- Shi, Z., Zhang, Y., Phillips, G. O., Yang, G.
- Holland, M. C., Eggensperger, C. G., Giagnorio, M., Schiffman, J. D., Tiraferri, A., Zodrow, K. R. Facile Postprocessing Alters the Permeability and Selectivity of Microbial Cellulose Ultrafiltration Membranes. Environmental Science and Technology. 54 (20), 13249-13256 (2020).
- Le Hoang, S., Vu, C. M., Pham, L. T., Choi, H. J. Preparation and physical characteristics of epoxy resin/ bacterial cellulose biocomposites. Polymer Bulletin. 75 (6), 2607-2625 (2018).
- Vu, C. M., Nguyen, D. D., Sinh, L. H., Pham, T. D., Pham, L. T., Choi, H. J. Environmentally benign green composites based on epoxy resin/bacterial cellulose reinforced glass fiber: Fabrication and mechanical characteristics. Polymer Testing. 61, 150-161 (2017).
- Pavaloiu, R. D., Stoica, A., Stroescu, M., Dobre, T. Controlled release of amoxicillin from bacterial cellulose membranes. Central European Journal of Chemistry. 12 (9), 962-967 (2014).
- Trovatti, E., et al. Biocellulose membranes as supports for dermal release of lidocaine. Biomacromolecules. 12 (11), 4162-4168 (2011).
- Trovatti, E., et al. Bacterial cellulose membranes applied in topical and transdermal delivery of lidocaine hydrochloride and ibuprofen: In vitro diffusion studies. International Journal of Pharmaceutics. 435 (1), 83-87 (2012).
- Shaviv, A., Mikkelsen, R. L. Controlled-release fertilizers to increase efficiency of nutrient use and minimize environmental degradation - A review. Fertilizer Research. 35 (1-2), 1-12 (1993).
- Eggensperger, C. G., et al.
- Schröpfer, S. B., et al. Biodegradation evaluation of bacterial cellulose, vegetable cellulose and poly (3-hydroxybutyrate) in soil. Polimeros. 25 (2), 154-160 (2015).
- Orts, W. J., Glenn, G. M. Reducing soil erosion losses with small applications of biopolymers. ACS Symposium Series. 723, 235-247 (1999).
- Mohite, B. V., Patil, S. V. A novel biomaterial: Bacterial cellulose and its new era applications. Biotechnology and Applied Biochemistry. 61 (2), 101-110 (2014).
- Mikkelsen, R. L. Using hydrophilic polymers to control nutrient release. Fertilizer Research. 38 (1), 53-59 (1994).
- Du, C. W., Zhou, J. M., Shaviv, A. Release characteristics of nutrients from polymer-coated compound controlled release fertilizers. Journal of Polymers and the Environment. 14 (3), 223-230 (2006).
- Serafica, G., Mormino, R., Bungay, H. Inclusion of solid particles in bacterial cellulose. Applied Microbiology and Biotechnology. 58 (6), 756-760 (2002).
- Tomaszewska, M., Jarosiewicz, A. Use of polysulfone in controlled-release NPK fertilizer formulations. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (16), 4634-4639 (2002).
- González, M. E., et al. Evaluation of biodegradable polymers as encapsulating agents for the development of a urea controlled-release fertilizer using biochar as support material. Science of the Total Environment. 505, 446-453 (2015).
- Shavit, U., Shaviv, A., Shalit, G., Zaslavsky, D. Release characteristics of a new controlled release fertilizer. Journal of Controlled Release. 43 (2-3), 131-138 (1997).
- Kolakovic, R., Laaksonen, T., Peltonen, L., Laukkanen, A., Hirvonen, J. Spray-dried nanofibrillar cellulose microparticles for sustained drug release. International Journal of Pharmaceutics. 430 (1-2), 47-55 (2012).
- Zaharia, A., et al. Bacterial cellulose-poly(acrylic acid-: Co-N, N ′-methylene-bis-acrylamide) interpenetrated networks for the controlled release of fertilizers. RSC Advances. 8 (32), 17635-17644 (2018).
- Peterson, J. D., Vyazovkin, S., Wight, C. A. Kinetics of the thermal and thermo-oxidative degradation of polystyrene, polyethylene and poly(propylene). Macromolecular Chemistry and Physics. 202 (6), 775-784 (2001).
- Goh, W. N., Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim, A. A., Bhat, R. Fermentation of black tea broth (kombucha): I. effects of sucrose concentration and fermentation time on the yield of microbial cellulose. International Food Research Journal. 19 (1), 109-117 (2012).
- Zhu, H., Jia, S., Yang, H., Jia, Y., Yan, L., Li, J. Preparation and application of bacterial cellulose sphere: A novel biomaterial. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 25 (1), 2233-2236 (2011).
- Nguyen, V. T., Flanagan, B., Gidley, M. J., Dykes, G. A. Characterization of cellulose production by a Gluconacetobacter xylinus strain from Kombucha. Current Microbiology. 57 (5), 449-453 (2008).
- Costa, A. F. S., Almeida, F. C. G., Vinhas, G. M., Sarubbo, L. A. Production of bacterial cellulose by Gluconacetobacter hansenii using corn steep liquor as nutrient sources. Frontiers in Microbiology. 8, 1-12 (2017).
- Watanabe, K., Tabuchi, M., Morinaga, Y., Yoshinaga, F. Structural features and properties of bacterial cellulose produced in agitated culture. Cellulose. 5 (3), 187-200 (1998).
