Hier stellen wir ein Protokoll für die Genbearbeitung in primären menschlichen T-Zellen vor, das die CRISPR Cas-Technologie verwendet, um CAR-T-Zellen zu modifizieren.
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Methodenartikel
Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Adoptive Zelltherapien mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR-T-Zellen) haben eine bemerkenswerte klinische Wirksamkeit bei Patienten mit hämatologischen Malignomen gezeigt und werden derzeit auf verschiedene solide Tumoren untersucht. CAR-T-Zellen werden erzeugt, indem T-Zellen aus dem Blut eines Patienten entfernt und so hergestellt werden, dass sie einen synthetischen Immunrezeptor exprimieren, der die T-Zellen umleitet, um Zieltumorzellen zu erkennen und zu eliminieren. Die Geneditierung von CAR-T-Zellen hat das Potenzial, die Sicherheit aktueller CAR-T-Zelltherapien zu verbessern und die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen weiter zu erhöhen. Hier beschreiben wir Methoden zur Aktivierung, Expansion und Charakterisierung von humanen CRISPR-engineered CD19 gerichteten CAR-T-Zellen. Dies umfasst die Transduktion des car-lentiviralen Vektors und die Verwendung von Single-Guide-RNA (sgRNA) und Cas9-Endonuklease, um Gene von Interesse in T-Zellen anzusprechen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können universell auf andere CAR-Konstrukte und Zielgene angewendet werden, die über die für diese Studie verwendeten hinausgehen. Darüber hinaus werden in diesem Protokoll Strategien für das gRNA-Design, die Lead-gRNA-Selektion und die Target-Gen-Knockout-Validierung diskutiert, um reproduzierbar ein hocheffizientes Multiplex-CRISPR-Cas9-Engineering von humanen T-Zellen in klinischer Qualität zu erreichen.
Einleitung
Die chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zelltherapie hat das Gebiet der adoptiven Zelltherapien und der Krebsimmuntherapie revolutioniert. CAR-T-Zellen sind technisch hergestellte T-Zellen, die einen synthetischen Immunrezeptor exprimieren, der ein antigenspezifisches einkettiges Antikörperfragment mit Signaldomänen aus der TCRzeta-Kette und kostimulatorischen Domänenkombiniert,die für die T-Zellaktivierung und Co-Stimulation notwendig und ausreichend sind1,2,3,4 . Die Herstellung von CAR-T-Zellen beginnt mit der Extraktion der patienteneigenen ....
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Protokoll
Menschliche T-Zellen wurden über den Human Immunology Core der University of Pennsylvania beschafft, der nach den Prinzipien der Guten Laborpraxis mit etablierten Standardbetriebsverfahren und / oder Protokollen für den Probeneingang, die Verarbeitung, das Einfrieren und die Analyse gemäß den Ethikrichtlinien von MIATA und der University of Pennsylvania arbeitet.
1. Lentivirale Vektorproduktion
HINWEIS: Die viralen Produkte wurden durch Trennung von Verpackungskonstrukten (Rev, Gag/Pol/RRE, VSVg und Transferplasmid) in vier separate Plasmide replikationsdefekt gemacht, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Rekombinati....
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Ergebnisse
Wir beschreiben hier ein Protokoll zur gentechnischen Herstellung von T-Zellen, mit dem sowohl autologe als auch allogene CAR-T-Zellen sowie TCR-umgeleitete T-Zellen erzeugt werden können.
Abbildung 1 enthält eine detaillierte Beschreibung der Phasen, die an der Herstellung von CRISPR-bearbeiteten T-Zellen beteiligt sind. Der Prozess beginnt mit dem Design von sgRNA für das interessierende Gen. Sobald die sgRNA entworfen und synthetisiert ist, werden sie verwendet.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir Ansätze zur Genbearbeitung von CAR-T-Zellen mit crispR Cas9-Technologie und zur Herstellung von Produkten, um die Funktion und Wirksamkeit weiter zu testen. Das obige Protokoll wurde für die Durchführung von CRIPSR-Gen-Editing in primären menschlichen T-Zellen in Kombination mit engineering T-Zellen mit chimären Antigenrezeptoren optimiert. Dieses Protokoll ermöglicht eine hohe Knockout-Effizienz bei minimaler Variabilität von Spender zu Spender. Die Modifikation mit CRISPR kann sowohl die Wirksamkei.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Angaben.
Danksagungen
Wir erkennen den Human Immunology Core für die Bereitstellung normaler Spender-T-Zellen und den Flow Cytometry Core an der University of Pennsylvania an.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4D-Nukleofaktor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN Ultrazentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 Anti-Human CD3 Antikörper | Biolegend | 317322 | Klon OKT3 |
| BV711 Anti-Human-PD1 | Biolegend | Klon EH12.2H7 | |
| Cas9-Elektroporationsverstärker | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T-Zell-Isolationskit | StemCell-Technologien | 15062 | |
| CD8+ T-Zell-Isolationskit | StemCell-Technologien | 15063 | |
| Corning 0,45 Mikron Vakuumfilter/Flasche | Corning | 430768 | |
| Corning T150 Zellkulturflasche | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blut- und Gewebekit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax Ergänzung | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T Zellen | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel und PCR-Aufreinigung | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primärzelle 4D-Nukleofaktor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamin | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE-Expression Plasmid | im Haus | ||
| Kaninchen Anti-Maus FMC63 scFv Monoklonaler Antikörper, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultrazentrifugenröhrchen | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral Packaging Mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
Referenzen
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
