Erzeugung und Kultur von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen

Lauren A. Shechtman; Christina M. Piarowski; Jennifer K. Scott; Erin J. Golden; Dany Gaillard; Linda A. Barlow

doi:10.3791/62300

Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Erzeugung und Kultur von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen

4.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/62300

⸱

5. April 2021

Lauren A. Shechtman^*¹ , Christina M. Piarowski^*¹ , Jennifer K. Scott¹ , Erin J. Golden¹ , Dany Gaillard¹ , Linda A. Barlow¹

¹Department of Cell and Developmental Biology and the Rocky Mountain Taste and Smell Center, University of Colorado Anschutz Medical Campus

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Verarbeitung von lingualen Organoiden vor, die aus Geschmacksstammzellen gewonnen werden, die aus der hinteren Geschmackspapille erwachsener Mäuse isoliert wurden.

Zusammenfassung

Der Geschmackssinn wird durch Geschmacksknospen auf der Zunge vermittelt, die sich aus sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs) zusammensetzen. Dieser kontinuierliche Umsatz wird von lokalen Vorläuferzellen angetrieben und macht die Geschmacksfunktion anfällig für Störungen durch eine Vielzahl von medizinischen Behandlungen, was wiederum die Lebensqualität stark beeinträchtigt. Daher ist die Untersuchung dieses Prozesses im Kontext der medikamentösen Behandlung von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, ob und wie die Funktion des Geschmacksvorläufers und die TRC-Produktion beeinflusst werden. Angesichts der ethischen Bedenken und der begrenzten Verfügbarkeit von menschlichem Geschmacksgewebe werden häufig Mausmodelle verwendet, die ein ähnliches Geschmackssystem wie der Mensch haben. Im Vergleich zu In-vivo-Methoden, die zeitaufwendig, teuer und für Hochdurchsatzstudien nicht nutzbar sind, können murine linguale Organoide experimente mit vielen Replikaten und weniger Mäusen schnell durchführen. Hier wurden zuvor veröffentlichte Protokolle angepasst und eine standardisierte Methode zur Erzeugung von Geschmacksorganoiden aus Geschmacksvorläuferzellen vorgestellt, die aus der Circumvallat-Papille (CVP) erwachsener Mäuse isoliert wurden. Geschmacksvorläuferzellen im CVP exprimieren LGR5 und können mittels EGFP-Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) von Mäusen isoliert werden, die ein Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2-Allel} tragen. Sortierte Zellen werden auf ein Matrix-Gel-basiertes 3D-Kultursystem auf plattiert und 12 Tage lang kultiviert. Organoide dehnen sich für die ersten 6 Tage der Kulturperiode durch Proliferation aus und treten dann in eine Differenzierungsphase ein, in der sie alle drei Geschmackszelltypen zusammen mit Nicht-Geschmacksepithelzellen erzeugen. Organoide können bei der Reifung am Tag 12 oder jederzeit während des Wachstumsprozesses für die RNA-Expression und immunhistochemische Analyse entnommen werden. Die Standardisierung von Kulturmethoden zur Herstellung von lingualen Organoiden aus adulten Stammzellen wird die Reproduzierbarkeit verbessern und linguale Organoide als leistungsfähiges Arzneimittel-Screening-Werkzeug im Kampf gegen Patienten mit Geschmacksstörungen fördern.

Einleitung

Bei Nagetieren sind linguale Geschmacksknospen in fungiformen Papillen untergebracht, die anterior verteilt sind, bilaterale Blattpapillen nach dem Hinterteil sowie eine einzelne zirkumvallate Papille (CVP) an der posterodorsalen Mittellinie der Zunge¹. Jede Geschmacksknospen besteht aus 50-100 kurzlebigen, sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs), zu denen gliaartige Unterstützungszellen vom Typ I, Zellen vom Typ II, die süße, bittere und Umami erkennen, und Typ III-Zellen, die saure²,³^,⁴erkennen , umfassen. Im CVP der Maus produzieren....