Hochdurchsatz-Transkriptomanalyse zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Summary

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine komplette Pipeline zur Analyse von RNA-Sequenzierungs-Transkriptomdaten von Rohlesungen bis hin zur Funktionsanalyse, einschließlich Qualitätskontroll- und Vorverarbeitungsschritten bis hin zu fortschrittlichen statistischen Analyseansätzen.

Abstract

Krankheitserreger können eine Vielzahl von Infektionskrankheiten verursachen. Die biologischen Prozesse, die vom Wirt als Reaktion auf eine Infektion induziert werden, bestimmen die Schwere der Erkrankung. Um solche Prozesse zu untersuchen, können Forscher Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken (RNA-seq) verwenden, die die dynamischen Veränderungen des Wirtstranskriptoms in verschiedenen Stadien der Infektion, klinischen Ergebnissen oder Krankheitsschwere messen. Diese Untersuchung kann zu einem besseren Verständnis der Krankheiten sowie zur Aufdeckung potenzieller Wirkstoffziele und Behandlungen führen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine komplette Pipeline zur Analyse von RNA-Sequenzierungsdaten vom Rohlesen bis zur Funktionsanalyse. Die Pipeline ist in fünf Schritte unterteilt: (1) Qualitätskontrolle der Daten; (2) Kartierung und Annotation von Genen; (3) statistische Analyse zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene und koexprimierter Gene; (4) Bestimmung des molekularen Grades der Störung von Proben; und (5) Funktionalanalyse. Schritt 1 entfernt technische Artefakte, die sich auf die Qualität nachgelagerter Analysen auswirken können. In Schritt 2 werden Gene nach Standardbibliotheksprotokollen kartiert und annotiert. Die statistische Analyse in Schritt 3 identifiziert Gene, die in infizierten Proben im Vergleich zu nicht infizierten Proben differentiell exprimiert oder koexprimiert werden. Die Probenvariabilität und das Vorhandensein potenzieller biologischer Ausreißer werden mit dem Ansatz des molekularen Störungsgrades in Schritt 4 überprüft. Schließlich zeigt die Funktionelle Analyse in Schritt 5 die mit dem Krankheitsphänotyp assoziierten Signalwege auf. Die vorgestellte Pipeline zielt darauf ab, Forscher durch die RNA-seq-Datenanalyse aus Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien zu unterstützen und zukünftige In-vitro- oder In-vivo-Experimente voranzutreiben, die für das Verständnis des molekularen Mechanismus von Infektionen unerlässlich sind.

Introduction

Arboviren wie Dengue, Gelbfieber, Chikungunya und Zika wurden weithin mit mehreren endemischen Ausbrüchen in Verbindung gebracht und haben sich in den letzten Jahrzehnten als einer der Hauptpathogene für die Infektion des Menschen ^{herausgestellt1,2}. Personen, die mit dem Chikungunya-Virus (CHIKV) infiziert sind, haben oft Fieber, Kopfschmerzen, Hautausschlag, Polyarthralgie und ^{Arthritis3,4,5}. Viren können die Genexpression der Zelle untergraben und verschiedene Wirtssignalwege beeinflussen. Kürzlich verwendeten Blutt....

Protocol

Die in diesem Protokoll verwendeten Proben wurden von den Ethikkommissionen sowohl der Abteilung für Mikrobiologie des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität von São Paulo als auch der Bundesuniversität von Sergipe genehmigt (Protokolle: 54937216.5.0000.5467 bzw. 54835916.2.0000.5546).

1. Docker Desktop-Installation

HINWEIS: Die Schritte zum Vorbereiten der Docker-Umgebung unterscheiden sich zwischen den Betriebssystemen (Betriebssystemen). Daher müssen Mac-Benutzer die als 1.1 aufgeführten Schritte, Linux-Benutzer die als 1.2 aufgeführten Schritte und Windows-Benutzer die als....

Results

Die Rechenumgebung für Transkriptomanalysen wurde auf der Docker-Plattform erstellt und konfiguriert. Dieser Ansatz ermöglicht es Linux-Anfängern, Linux-Terminalsysteme ohne a priori Managementkenntnisse zu verwenden. Die Docker-Plattform verwendet die Ressourcen des Hostbetriebssystems, um einen Dienstcontainer zu erstellen, der die Tools bestimmter Benutzer enthält (Abbildung 1B). Ein Container basierend auf der Linux OS Ubuntu 20.04 Distribution wurde erstellt und vollständig für transkri.......

Discussion

Die Aufbereitung der Sequenzierbibliotheken ist ein entscheidender Schritt, um biologische Fragestellungen bestmöglich zu beantworten. Die Art der Transkripte, die für die Studie von Interesse sind, wird bestimmen, welche Art von Sequenzierungsbibliothek ausgewählt wird, und bioinformatische Analysen vorantreiben. Zum Beispiel ist es aus der Sequenzierung einer Pathogen- und Wirtsinteraktion je nach Art der Sequenzierung möglich, Sequenzen aus beiden oder nur aus den Wirtstranskripten zu identifizieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CEMiTool	Computational Systems Biology Laboratory	1.12.2	Vollautomatische Entdeckung und Analyse von Co-Expressions-Genmodulen mit einem benutzerfreundlichen HTML-Report mit hochwertigen Grafiken.
EdgeR	Bioconductor (Betreuer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])	3.30.3	Differentielle Expressionsanalyse von RNA-seq-Expressionsprofilen mit biologischer
Replikation EnhancedVolcano	Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])	1.6.0	Publikationsreife Vulkandiagramme mit verbesserter Einfärbung und Markierung
FastQC	Babraham Bioinformatics	0.11.9	Zielt darauf ab, eine einfache Möglichkeit zur Qualitätskontrolle von Rohsequenzdaten aus der Hochdurchsatz-Sequenzierung durchzuführen
FeatureCounts	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.0.0	Ordnen Sie zugeordnete Sequenzierungs-Reads bestimmten genomischen Merkmalen zu
MDP	Computational Systems Biology Laboratory	1.8.0	zuMolecular Degree of Perturbation berechnet die Punktzahl für Transkriptom-Datenproben auf der Grundlage ihrer Störung von Kontrollen
R	R Core Group	4.0.3	Programmiersprache und freie Softwareumgebung für statistisches Rechnen und Grafik
STAR	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.7.6a	Aligner, der speziell für viele der Herausforderungen beim RNA-seq-Datenmapping entwickelt wurde, indem eine Strategie zur Berücksichtigung von gespleißten Alignments verwendet wird
Bowtie2	Johns Hopkins University	2.4.2	Ultraschnelles und speichereffizientes Tool zum Ausrichten von Sequenzierungs-Reads auf lange Referenzsequenzen
Trimmomatic	THE USADEL LAB	0.39	Trimmen von Adaptersequenzen für Illumina-Paired-End- und Single-Ended-Daten
Docker herunterladen	Docker	20.10.2	Erstellen einer bioinformatischen Umgebung reproduzierbar und vorhersagbar (https://docs.docker.com/get-docker/)
WSL2-Kernel	Windows	NA	https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel
Abrufen von Docker Linux	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
Docker Linux Repository	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository
MDP Website	Computational Systems Biology Laboratory	NA	https://mdp.sysbio.tools
Enrichr Website	MaayanLab	NA	https://maayanlab.cloud/Enrichr/
webCEMiTool	Computational Systems Biology Laboratory	NA	https://cemitool.sysbio.tools/
gProfiler	Bioinformatik, Algorithmik und Data Mining Gruppe	NA	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
goseq	Bioconductor (Betreuer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])	NA	http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html
SRA NCBI Studie	NCBI	NA	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/