Methodenartikel

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

DOI:

10.3791/62328

⸱

13. November 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reporter und Zellsortierung, um Knock-in-Experimente in Makrophagen- und T-Zelllinien zu vereinfachen. Für diese vereinfachten Knock-in-Experimente werden zwei Plasmide verwendet, nämlich ein CRISPR/Cas9- und DsRed2-exprimierendes Plasmid und ein homologes Rekombinationsspenderplasmid, das EBFP2 exprimiert, das dauerhaft am Rosa26-Locus in Immunzellen integriert ist.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funktionelle Genomik-Studien des Immunsystems erfordern genetische Manipulationen, die sowohl die Deletion von Zielgenen als auch die Zugabe von Elementen zu interessierenden Proteinen beinhalten. Die Identifizierung von Genfunktionen in Zelllinienmodellen ist wichtig für die Genentdeckung und Erforschung zellintrinsischer Mechanismen. Genetische Manipulationen von Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagenzelllinien mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Knock-in sind jedoch aufgrund der geringen Transfektionseffizienz dieser Zellen, insbesondere in einem Ruhezustand, schwierig. Um Gene in Immunzellen zu modifizieren, werden typischerweise Arzneimittelresistenzselektion und virale Vektoren verwendet, um Zellen anzureichern, die das CRIPSR / Cas9-System exprimieren, was unweigerlich zu unerwünschten Eingriffen der Zellen führt. In einer früheren Studie haben wir duale fluoreszierende Reporter entwickelt, die mit CRISPR/Cas9 gekoppelt sind und nach der Elektroporation vorübergehend exprimiert wurden. Diese technische Lösung führt zu einer schnellen Genselöschung in Immunzellen; Das Einklopfen von Genen in Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagen ohne den Einsatz von Arzneimittelresistenzselektion oder viralen Vektoren ist jedoch noch schwieriger. In diesem Artikel zeigen wir, dass durch die Verwendung von Zellsortierung zur Unterstützung der Selektion von Zellen, die transient CRISPR/Cas9-Konstrukte exprimieren, die auf den Rosa26-Locus in Kombination mit einem Spenderplasmid abzielen, ein Gen-Knock-in sowohl in T-Zellen als auch in Makrophagen ohne Arzneimittelresistenzanreicherung erreicht werden kann. Als Beispiel zeigen wir, wie man menschliches ACE2, einen Rezeptor von SARS-Cov-2, der für die aktuelle Covid-19-Pandemie verantwortlich ist, in RAW264.7-Makrophagen durch Knock-in-Experimente exprimiert. Solche Gen-Knock-in-Zellen können häufig für mechanistische Studien verwendet werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunzellen sind entscheidend für die Abwehr von Krankheitserregern. Sowohl angeborene als auch adaptive Immunität sind für die Clearance von Infektiva und die Aufrechterhaltung der Gewebeöostase erforderlich1,2. Zelllinienmodelle sind wesentliche Werkzeuge, um die molekularen Grundlagen des Immunsystems von Säugetieren zu verstehen. Sie werden in funktionellen In-vitro-Assays verwendet, z. B. bei der Modellierung der Aktivierung menschlicher T-Zellen und bei der Bestimmung der Funktion genetischer Faktoren bei der Aktivierung oder Dämpfung von Immunantworten3,4. Es ist wichtig zu beachten, dass das Immunsystem von Säugetieren enorm heterogen ist und, ebenso wichtig, eine große Anzahl von Molekülen die Differenzierung, Migration und Funktion eines bestimmten Zelltyps5,6steuert.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Genome Editing Tools ermöglichen die genetische Manipulation bestimmter Zelltypen, was die funktionelle Annotation von Genen auf präzise Weise erleichtert7,8. Mehrere veröffentlichte Protokolle haben die Abgabe von CRISPR/Cas9 in Form von Cas9-Guide-RNA-Komplexen beschrieben, die als Ribonukleoproteine (RNPs) in HEK293-Zellen, Jurkat-Zelllinien, primären T-Zellen9,10, Makrophagen11,12,13, Stammzellen14und anderen15,16bekannt sind . In diesen Protokollen wird das Gen-Tagging normalerweise durch Verschmelzen eines fluoreszierenden Tags mit endogenen Proteinenerreicht 17,18. Es wurden jedoch nur wenige Versuche unternommen, duale fluoreszierende Reporter zu verwenden, die mit der Einzelzellsortierung kompatibel sind, um Knock-in-Experimente19,20, insbesondere in Immunzellen , zu erleichtern.

Eingehende mechanistische Analysen, die darauf abzielen, die Funktionen eines neuartigen genetischen Faktors in Immunzellen zu verstehen, erfordern in der Regel eine zelltypspezifische Deletion eines Gens, genetische Rettungsexperimente und idealerweise die Identifizierung seiner Interaktoren. Obwohl Methoden zur Optimierung der genetischen Deletion von Genen in Immunzellen veröffentlicht wurden9,15,21, wurden weit weniger Methoden zur Einführung von Knock-in-Allelen mit vielseitigen Funktionen zum Verständnis der Immunantwort berichtet. Daher wollen wir in diesem Protokoll ein effizientes und hochreproduzierbares Protokoll beschreiben, um ein Protein von Interesse (POI) am Safe-Harbor-Locus Rosa26 sowohl in menschlichen als auch in murinen Immunzelllinien zu exprimieren. Wir haben ein zweifarbiges Reportersystem entwickelt, um Zellen anzureichern, die mit Plasmiden transfiziert sind, die CRISPR/Cas9 (DsRed2) exprimieren, und eine rekombinante DNA-Vorlage (EBFP2), die durch Zellsortierung isoliert werden kann. Nach diesem Protokoll erhielten wir mehrere Knock-in-Linien der menschlichen T-Zelllinie Jurkat und des murinen Makrophagen RAW264.7 für funktionelle Analysen von schlecht untersuchten Proteinen.

Als Beispiel zeigen wir in diesem Protokoll, wie man Knock-in RAW264.7 Makrophagen erhält, die stabil menschliches ACE2 (ein Rezeptor von SARS-Cov-2)22exprimieren. Da angeborene Immunzellen an der Pathogenese von Covid-1923beteiligt sind,24 und humanes ACE2 als hauptrezeptor gilt, der für den viralen Eintritt in Zellen vor der Replikation benötigt wird, können Makrophagen mit Knock-in von humanem ACE2 als nützliches Werkzeug für mechanistische Studien der viralen Vermehrung in Makrophagen dienen. Parallel dazu präsentieren wir auch ein Beispiel für das Einschalten eines Gens am menschlichen ROSA26-Locus, um das RASGRP1-Protein zu exprimiert, das an seinem Aminoterminus mit einem Affinitäts-Twin-Strep-Tag (OST) verschmolzen wurde. T-Zellen sind wichtige Zielzellen in Immuntherapien, und eine zunehmende Anzahl von Studien hat sich auf die Manipulation ihrer Reaktionsfähigkeit auf Krebs konzentriert25,26. Da Rasgrp1 als schlüsselhaftes Signalmolekül nach dem T-Zell-Rezeptor bekannt ist und seine Interaktoren nicht gut aufgeklärt sind27, bietet das OST-RASGRP1-Knock-in-Modell die Grundlage für die Identifizierung von Interaktoren, die die Reaktion von T-Zellen auf Tumore und Infektionen regulieren. Zusammengenommen können diese Werkzeuge für Covid-19-Studien und die Entdeckung neuartiger Moleküle verwendet werden, die mit Rasgrp1 interagieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Design und Plasmidkonstruktion von sgRNAs für Rosa26 Locus

  1. Designleitfaden-RNAs rund um die gewünschte Einfügestelle
    1. Stellen Sie sicher, dass sich die Einfügestelle für Rosa26-Knock-in-Experimente der Maus Rosa26 (im Folgenden als mRosa26bezeichnet) im ersten Intron von mRosa26befindet. Diese Seite wurde in früheren Studien verwendet28,29. Stellen Sie bei Knock-in-Experimenten in menschlichen Zellen sicher, dass sich die Insertionsstelle im menschlichen ROSA26-Locus (im Folgenden hROSA26genannt) befindet, der als menschlicher Homolog von mRosa2630identifiziert wurde.
    2. Verwenden Sie die genomischen Sequenzen von Maus- und menschlichen Spezies, die aus der Mausgenominformatik (http://www.informatics.jax.org/) bzw. dem Ensembl-Genombrowser (http://www.ensembl.org/index.html) gewonnen wurden. Kopieren Sie 50 Basenpaare (bp) der genomischen Sequenz des mRosa26- oder hROSA26-Locus auf jeder Seite, die die gewünschte Insertionsstelle flankiert.
    3. Design Guide RNAs mit dem Online-Webtool CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Fügen Sie die 100 bp Der Eingabesequenz aus 1.1.2 ein. Wählen Sie zwei Leit-RNAs mit einem hohen Spezifitätswert, einem hohen Effizienzwert und einer niedrigen Off-Target-Aktivität aus. Wählen Sie außerdem RNA-Guides mit höheren Doench-Werten und vermeiden Sie diejenigen, die als "ineffizient" gekennzeichnet sind32.
      HINWEIS: Alternative CRISPR-Design-Tools sind ebenfalls wertvoll und öffentlich verfügbar, zum Beispiel das Benchling CRISPR-Design-Tool (https://benchling.com/crispr). Um die Häufigkeit von CRISPR/Cas9-vermittelten Knock-in-mutierten Zellen zu erhöhen, wählen Sie nach Möglichkeit zwei Führungs-RNAs in der Nähe der gewünschten Einfügestelleaus 33.
    4. Verwenden Sie für den mRosa26-Locus zwei benachbarte Führungs-RNAs, die als mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') und mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') bezeichnet werden(Abbildung 1A). Verwenden Sie für den hROSA26-Locus zwei benachbarte Führungs-RNAs, nämlich hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') und hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Genom-Editing-Aktivitäten von mR26-sg1 und mR26-sg2 sowie die von hR26-sg1 und hR26-sg2 wurden in RAW264.7-Zellen bzw. Jurkat-Zellen ausgewertet (siehe Ergänzungsdatei, Abbildung S1).
  2. Klonen von CRISPR-Expressionsvektoren, die sgRNA enthalten, die auf den Rosa26 Locus abzielen
    1. Synthetisieren Sie Vorwärts- und Rückwärtsoligos für eine Leit-RNA (siehe Ergänzungsdatei).
      HINWEIS: Es ist vorzuziehen, am Anfang der Führungssequenz ein "G"-Nukleotid hinzuzufügen, das bei der vom U6-Promotor gesteuerten Expression hilft. Um beispielsweise das oben genannte mR26-sg1 zu klonen, ist das vordere Oligo CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT und das umgekehrte Oligo ist AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Das zusätzliche G im vorderen Oligo und sein Komplement im umgekehrten Oligo sind fett gedruckt.
    2. Klonen Sie synthetische Oligos, die den Leit-RNAs entsprechen, in den All-in-One-CRISPR-Expressionsvektor pX458-DsRed2, der in unserer vorherigen Arbeit21 (Abbildung 1C) unter Verwendung des von Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/) entwickelten allgemeinen Protokolls für das gRNA-Klonen generiert wurde; Überspringen Sie jedoch den Gelreinigungsschritt und reinigen Sie den verdauten Vektor mit einem PCR-Reinigungskit (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: In früheren Protokollen wurde eine Gelreinigung des BbsI-verdauten Vektors durchgeführt; Dieser Schritt ist jedoch zeitaufwändig. Im vorliegenden Protokoll wird das verdaute Produkt mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt und direkt für die nachgeschaltete Ligationsreaktion verwendet, die in der Regel positive Kolonien mit vergleichbarer Effizienz erzeugt.
    3. 10 μL des Ligationsprodukts (Schritt 1.2.2) werden gemäß den Anweisungen des Herstellers in 50 μLescherichia coli DH5α kompetente Zellen umgewandelt. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Kolonien aus einer LB-Agarplatte mit Ampicillin (100 μg / ml) und impfen Sie jede in 3 ml LB-Medium mit Ampicillin, um sie über Nacht zu kultivieren.
    4. Verwenden Sie 1 ml der Bakterienkultur über Nacht für die Sanger-Sequenzierung und halten Sie den Rest bei 4 °C, bis das Konstrukt als korrekt bestätigt ist: pDsR-mR26-sg1 und pDsR-mR26-sg2 für mRosa26 Locus Knock-in und pDsR-hR26-sg1 und pDsR-hR26-sg2 für den hROSA26-Locus.
    5. Eine hohe Konzentration an Plasmid-DNA (ca. 2 μg/μL) wird mit einem Maxiprep-Kit zur Reinigung von Transfektionsplasmid (siehe Materialtabelle) vorbereitet.

2. Design und Konstruktion von Targeting-Vektoren als homologe Rekombinationsvorlagen

  1. Entwerfen einer homologiegesteuerten Reparaturvorlage
    1. Entwerfen Sie einen Targeting-Vektor, um den POI konstitutiv zu exprimieren, indem Sie eine Expressionskassette verwenden, die aus einer früheren Studie29optimiert wurde und einen CAG-Hybridpromotor, eine AscI-Restriktionsstelle, die das Klonen der cDNA des POI ermöglicht, einen IRES-EBFP2-Reporter und ein Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal (bGH-polyA) enthält (Abbildung 1B und Ergänzende Datei).
    2. Entwerfen Sie Homologiearme (HAs), die die Homologie mit den genomischen Sequenzen des mRosa26- oder hROSA26-Locus teilen. Fügen Sie ~1 kb der 5' HA ein, die der vorgelagerten genomischen Sequenz von der gewünschten Einfügestelle links von der Expressionskassette entsprechen. In ähnlicher Weise schließen Sie ~ 1 kb des 3' HA ein, das der nachgeschalteten genomischen Sequenz von der Einfügestelle rechts neben der Expressionskassette entspricht.
      HINWEIS: Die Expressionskassette wird so nah wie möglich an den CRISPR/Cas9-Spaltstellen34eingelegt. Um ein erneutes Schneiden des Zielallels durch CRISPR/Cas9 zu vermeiden, integrieren Sie Nukleotidänderungen in die Protospacer-Adjacent Motif (PAM)-Sequenz (5'-NGG-3') im Zielvektor34,35.
    3. Um eine Linearisierung des Zielvektors zu ermöglichen, fügen Sie eine eindeutige EcoRI-Site direkt vor der 5'-HA und eine eindeutige BamHI-Site direkt hinter der 3'-HA ein.
    4. Lassen Sie einen kommerziellen Anbieter die Targeting-Vektoren synthetisieren und sie als pKR26-iBFP bzw. pKhR26-iBFP für mRosa26 bzw. hROSA26 Knock-in bezeichnen.
  2. Erstellen eines Zielvektors als homologiegesteuerte Reparaturvorlage
    1. Um den POI zu exprimieren, erhalten Sie die cDNA-Sequenz (kodierende Sequenz) aus dem Ensembl-Genombrowser und wählen Sie das Transkript mit der längsten Proteinsequenz aus. Zum Beispiel ist die cDNA des menschlichen ACE2-Gens ACE2-202 ENST00000427411.2 und die cDNA des menschlichen RASGRP1-Gens ist RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Synthetisieren Sie die cDNA des POI mit Hilfe eines kommerziellen Anbieters. Es ist auch möglich, die cDNA über PCR-Amplifikation zu klonen (hier nicht beschrieben). Platzieren Sie die Sequenz GGCGCGCCACC (5' - 3'), die eine AscI-Restriktionsstelle (kursiv und fett) und eine Kozak-Konsensübersetzungsinitiierungs-Initiationsseite (unterstrichen) enthält, unmittelbar vor dem ATG-Initiationskodon der cDNA und einer weiteren AscI-Restriktionsstelle (5'- GGCGCGCC -3') nach dem Stop-Codon der cDNA.
    3. Verdauen Sie die synthetisierte Sequenz mit AscI und reinigen Sie sie mit einem PCR-Reinigungskit, das für die Reinigung von DNA-Fragmenten nach Restaumentaufschluss gemäß den Anweisungen des Herstellers entwickelt wurde (siehe Materialtabelle).
    4. Ligaieren Sie den gereinigten cDNA-Einsatz in den AscI-linearisierten Backbone-Vektor pKR26-iBFP oder pKhR26-iBFP mit T4-DNA-Ligase gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    5. Überprüfen Sie den endgültigen Zielvektor pKR26-POI-iBFP oder pKhR26-POI-iBFP durch Sequenzierung. Verwenden Sie maxiprep, um die verifizierten Konstrukte gemäß dem Protokoll des Herstellers zu reinigen.
    6. Verdauen Sie den Zielvektor entweder mit EcoRI oder BamHI und reinigen Sie das Aufschlussprodukt mit einem PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lagern Sie den linearisierten Zielvektor (~0,8 μg/μL) bei -20 °C bis zur Elektroporation.

3. Elektroporation von Makrophagen und T-Zelllinien

  1. Zellkulturen für die Elektroporation vorbereiten
    1. Bereiten Sie das Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) als vollständiges Wachstumsmedium für Jurkat T-Zellen vor. Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% FBS für die Kultivierung von RAW264.7-Makrophagen vor. Ergänzen Sie alle vollständigen Wachstumsmedien mit 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin (Pen / Streptokokken), mit Ausnahme von Medien, die für die Inkubation nach der Transfektion vor der Zellsortierung verwendet werden.
    2. Führen Sie subkulturierte RAW264.7- und Jurkat T-Zellen gemäß den Anweisungen des Lieferanten durch (siehe Materialtabelle). Wenn Sie RAW264,7-Zellen subkulturieren, verwenden Sie Trypsin-EDTA-Lösung (0,25%), um Zellen zu lösen. Verwenden Sie FBS ergänzt mit 10% (v/v) DMSO als Kryokonservierungsmedium für RAW264.7- und Jurkat-Zellen.
    3. Sammeln Sie Zellen bei 250 × g für 5 min für RAW264.7 Makrophagen und 90 × g für 8 min für Jurkat T-Zellen. Dann mit 5-10 ml 1× DPBS (ohne Ca2+ oder Mg2+ Ionen) waschen. Entfernen Sie die DPBS.
    4. Das Zellpellet wird mit 2 ml 1× DPBS wieder resuspendiert. Verwenden Sie 10 μL Zellen und mischen Sie mit einem gleichen Volumen von 0,2% Trypanblau, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit zu schätzen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellkultur am Tag der Transfektion >90% Lebensfähigkeit aufweist.
    5. Führen Sie für ein einzelnes Knock-in-Experiment eine Elektroporation mit 10 μL Nukleofektionsspitzen mit fünf Wiederholungen durch. Berechnen Sie das benötigte Volumen für 2,0 × 106 Zellen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Waschen Sie das Zellpellet erneut mit 1× DPBS wie in Schritt 3.1.3 beschrieben.
      HINWEIS: Bei Verwendung von 10 μL Nukleofektionsspitzen werden 4,0 ×10 5 Zellen pro Elektroporation benötigt. Bereiten Sie dementsprechend mindestens 2,0 × 106 Zellen für ein Knock-in-Experiment vor.
    6. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 0,5 ml vollständigem Wachstumsmedium (vorbereitet in Schritt 3.1.1) pro Vertiefung ohne Pen/Strep vor und wärmen Sie sie in einem 37 °C-Inkubator vor.
  2. Elektroporation von CRISPR/Cas9-Komponenten und des Zielvektors
    1. Schalten Sie das Elektroporationssystem ein. Verwenden Sie Elektroporationsparameter, die in einer früheren Studie21optimiert wurden: 1.400 V/20 ms/2 Impulse für RAW264.7-Makrophagen und 1350 V/20 ms/2-Impulse für Jurkat-T-Zellen.
    2. Unter Berücksichtigung des Probenverlusts durch Pipettieren ist eine 55 μL Elektroporationsmischung in einem sterilen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 2,5 μg jedes CRISPR/Cas9-Vektors, 2,4 μg des linearisierten Zielvektors und dem Resuspensionspuffer R.
      HINWEIS: Um Zeit zu sparen, kann das Elektroporationsgemisch während der Zentrifugation hergestellt werden (Schritt 3.1.5).
    3. 2.0 × 106 Zellen (hergestellt in Schritt 3.1.5) in der 55 μL Elektroporationsmischung aus Schritt 3.2.2 wiedergeben.
    4. Das Zell-Elektroporations-Gemisch aus Schritt 3.2.3 mit einer 10 μL-Nukleofektionsspitze mit einer Pipette absaugen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie während des Pipettierens das Einbringen von Luftblasen, die zu einem Elektroporationsfehler führen können.
    5. Die Probe wird in ein Röhrchen gegeben, das mit 3 ml Buffer E aus dem Elektroporationskit gefüllt ist.
    6. Wenden Sie die Elektroporationsparameter für die beiden Zelltypen wie in Schritt 3.2.1 beschrieben an.
    7. Die Probe wird in eine Vertiefung der 24-Well-Platte mit vorgewarmtem Medium aus Schritt 3.1.6 überführen.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4-3.2.7 für die anderen vier Wiederholungen sowie für die Steuerelemente nur für den Zielvektor und den CRISPR-Ausdrucksvektor.
      HINWEIS: Ändern Sie die Nukleofektionsspitze und den Röhrchen, wenn Sie zu einem anderen Zelltyp / Plasmid-DNA wechseln.
    9. Die transfizierten Zellen werden 48-72 h lang kultiviert, um die Rückgewinnung nach Elektroporation und Expression von CRISPR/Cas9-Komponenten vor der Durchflusszytometrie-Analyse oder fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) zu ermöglichen. Untersuchen Sie die Expression von DsRed2 mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem roten Kanal bei 24 h nach der Transfektion ausgestattet ist.
      HINWEIS: Ein Vorteil der Überwachung von DsRed2-Fluoreszenzzellen besteht darin, dass die Effizienz der Elektroporation abschätzen und die Eignung für eine weitere Zellsortierung vorhergesagt werden kann.

4. Zellsortierung zur Isolierung mutmaßlicher Knock-in-Zellen

  1. Vor der FACS-Sortierung die transfizierten Zellen einmal mit vollständigem Wachstumsmedium waschen. Pelletzellen durch Zentrifugation wie in Schritt 3.1.3 beschrieben und das Pellet in 500 μL frischem Medium resuspendieren.
  2. Stellen Sie den Zellsortierer (in einer Biosicherheitswerkbank) mit einer 85-μm-Düse und einer niedrigen Durchflussrate ein. Wählen Sie den "Einzelzellen"-Modus für die Sortierung und testen Sie die Effizienz und Präzision der Einzelzellsortierung, indem Sie 20-30 Zellen auf die Abdeckung der 96-Well-Mikroplatte sortieren. Ein Tröpfchen, das in der Mitte jeder Vertiefung lokalisiert ist, zeigt die richtige Einrichtung des Instruments an.
  3. Die Zellsuspension aus Schritt 4.1 wird in sterile FACS-Röhrchen übergehen und SYTOX Red Dead Cell Stain zu einer Endkonzentration von 1 nM hinzugefügt.
  4. Analysieren Sie Proben auf dem Zellsortierer. SYTOX Red und EBFP2 werden von einem 405-nm-Laser angeregt und von den V450/BV421- bzw. APC-Kanälen detektiert. DsRed2 wird von einem 488-nm-Laser angeregt und vom PE-Kanal detektiert. Verwenden Sie nicht transfizierte Zellen und EBFP2- und DsRed2-Single-Positive-Zellen als Kontrollen für die spektrale Kompensation.
  5. Sortieren Sie 10 einzelne Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikroplatte, die 150 μL pro Vertiefung des vorgewärmten vollständigen Wachstumsmediums enthält. Verwenden Sie runde Bodenmikroplatten für die Kultivierung von Suspensionszelllinien wie Jurkat T-Zellen und flachen Bodenmikroplatten für adhärente RAW264.7-Makrophagen.
    HINWEIS: Die Sortierung von 10 Zellen pro Vertiefung ist eine optimierte Strategie zur Verbesserung des Zellüberlebens und zur Minimierung der Anzahl der 96-Well-Mikroplatten, die ausgesät werden müssen, und der Anzahl der Proben, die durch Durchflusszytometrie und Genotypisierung gescreent werden müssen. Wenn nur eine Zelle pro Vertiefung sortiert wird, ist die Aussaat von mehr Mikroplatten erforderlich, um die Chance zu erhöhen, korrekt bearbeitete Zellen zu erhalten.

5. Screening und Validierung positiver Knock-in-Zellen

  1. Screening auf Kandidaten-Knock-in-Zellen mittels Durchflusszytometrie
    1. Inkubieren Sie die Zellen ab Schritt 4.5 für 10-15 Tage und fügen Sie alle 3 Tage vollständiges Wachstumsmedium hinzu, um die durch Verdampfung verlorene Flüssigkeit zu ersetzen. Übertragen Sie bei Jurkat-T-Zellen Zellen, die in der runden unteren 96-Well-Platte gezüchtet wurden, auf eine flache Bodenplatte, um die Zellproliferation zu optimieren.
    2. Übertragen Sie die expandierten sortierten Zellen zur weiteren Expansion auf 48-Well-Platten.
    3. Wenn sich Zellen in der Nähe des Zusammenflusses befinden, verwenden Sie die Hälfte der Kultur, um die EBFP2-Expression durch Durchflusszytometrie zu untersuchen (Abbildung 3). Normalerweise entspricht die Hälfte der Kultur in einer 48-Well-Platte nach konfluentem Wachstum 0,5-1,0 × 105 Zellen, was für die Analyse einer Probe durch Durchflusszytometrie ausreichend ist.
    4. Die verbleibenden Zellen werden zur weiteren Proliferation auf 24-Well-Platten übertragen.
    5. Halten Sie die Kandidatenzellpopulationen mit einem hohen Anteil an EBFP2-positiven Zellen für weitere Genotypisierungsexperimente.
      HINWEIS: Da 10 Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Mikroplatte sortiert sind, ist es möglich, dass die Knock-in-Zellen mit Zellen wachsen, die das Knock-in-Gen nicht exprimieren. Daher ist es normal, eine zusätzliche Zellsortierung durchzuführen, um die EBFP2-positiven Zellen von den negativen Zellen zu trennen.
  2. Screening auf Kandidaten-Knock-in-Zellen mittels PCR und Sequenzierung
    1. Sammeln Sie 2 × 105 Kandidatenzellen. Extrahieren Sie die genomische DNA mit einem DNA-Prep-Kit (siehe Materialtabelle).
    2. Um zu überprüfen, ob eine präzise homologiegerichtete Reparatur (HDR) am mRosa26-Locus und nicht an zufälligen Stellen im Genom der Kandidaten-Knock-in-Zellen stattgefunden hat, führen Sie eine PCR mit Primern durch, die sich über jede Seite der HAs erstrecken (Abbildung 4). Wählen Sie einen Primer, der sich im genomischen Bereich außerhalb des Targeting-Vektors befindet (externes Oligo) und einen anderen Primer innerhalb des Targeting-Vektors (internes Oligo).
      HINWEIS: Ein ähnliches Design wird verwendet, um HDR am hROSA26-Locus zu überprüfen. PCR-Primer können auch einfach für die Erkennung des Einfügens der POI-Sequenz entwickelt werden. Zusätzlich können die Wildtyp- und Knock-in-Allel-Genotypen gleichzeitig mittels Drei-Primer-PCR detektiert werden (siehe Ergänzungsdatei, Abbildung S2).
    3. Klonen Sie die positiven PCR-Produkte mit einem Schnellklonierungskit (siehe Materialtabelle). Wandeln Sie das Reaktionsgemisch in DH5α-kompetente Zellen um.
    4. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 8-10 einzelne Bakterienkolonien pro Transformation aus und sequenzieren Sie die PCR-Produkte aus Schritt 5.2.3 durch Sanger-Sequenzierung.
  3. Validierung positiver Knock-in-Zellen durch Immunoblot-Analyse und Affinitätsreinigung
    HINWEIS: Kandidatenzellen werden einer Immunoblot-Analyse zur Validierung der Insertion des POI oder der Affinitätsreinigung (AP) für Studien der Protein-Protein-Interaktion unterzogen.
    1. Führen Sie eine Immunoblot-Analyse gemäß den Anweisungen des Antikörperherstellers durch. Informationen zur Verwendung von primären Antikörpern und sekundären Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle.
    2. Die Lysate der Knock-in-Zellen, die den OST-markierten POI exprimieren, werden mit Strep-Tactin Sepharose-Perlen gemäß den Anweisungen des Herstellers an AP unterstellt(siehe Materialtabelle ).
    3. Erkennen Sie Chemilumineszenz mit einem Imager.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nach dem oben beschriebenen Protokoll zur Durchführung von Knock-in-Experimenten am mRosa26-Locus mit murinen RAW264.7-Makrophagen haben wir einen Zielvektor entwickelt, um menschliches ACE2, einen Rezeptor für das SARS-Cov-2-Virus, zu exprimiert (Abbildung 2A). Mit einem ähnlichen Design erzeugten wir menschliche Jurkat-T-Zellen mit Knock-In des OST-markierten RASGRP1-Fusionsproteins (Abbildung 2C). Nach der Transfektion von drei Plasmiden, von denen z...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In unseren Experimenten haben wir gezeigt, wie man Knock-in-Editing in Immunzellen vom Konstruktdesign bis zum Knock-in-Zellscreening und Validierung am Beispiel menschlicher Jurkat-T-Zellen und muriner RAW264.7-Makrophagen durchführt. Sowohl T-Zell- als auch Makrophagen-Zelllinien sind resistent gegen Transfektion36,37; Das Problem der geringen Effizienz der CRISPR/Cas9-Abgabe kann jedoch mit Hilfe von fluoreszierenden Reportern in Verbindung mit der Zellsortier...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken der Durchflusszytometrie-Kerneinrichtung der Xinxiang Medical University. Die Entwicklung einer solchen Technologie wurde durch NSFC-Zuschüsse 81601360 an LZ, 81471595 und 32070898 an YL unterstützt. Die Arbeit wird auch von der Stiftung des Henan Educational Committee Nr. 21IRTSTHN030 unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Amersham Imager 600Ge HealthcareBildgebung von Chemilumineszenz
Ampicillin, NatriumsalzMP Biomedicals194526
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-linked AntikörperCell Signaling Technology7074bei 1/5000 Verdünnung
Anti-RasGRP1-Antikörper, Klon 10.1MerckMABS1461.0 μ g/mL der Arbeitskonzentration
AscINew England BioLabsR0558S
β-Aktin (D6A8) Kaninchen mAbZellsignaltechnologie8457bei 1/1000 Verdünnung
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini Automatisierter ZellzählerNexcelom Bioscience
E.coli DH5α Kompetente ZellenTakara9057
DMSO (Dimethylsulfoxid)MP Biomedicals196055
DNeasy Blut & Tissue KitsQiagen69506Zellkultur-Reagenz
DPBS (10X), kein Kalzium, kein MagnesiumThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem GlukosegehaltHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ FusionBD Biosciencesausgestattet mit Biosicherheitswerkbank
FACS Canto DurchflusszytometerBD Biosciences
Falcon 5 ml Polystyrol Reagenzglas mit rundem BodenBD Biosciences352003
Fötales Rinderserum (FBS)ThermoFisher Scientific10099141
FlowJo Version 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP  Kaninchen mAbCell Signaling Technology5174bei 1/1000 Verdünnung
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper, HRPThermoFisher Scientific31430bei 1/5000 Verdünnung
Immobilon ECL Ultra Western HRP SubstratMilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF MembranMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
KanamycinsulfatMP Biomedicals194531
LB Agar PulverThermoFisher Scientific22700041
Mehrkanalpipette (30-300 μ L)Eppendorf, oder ähnlich
Neon-TransfektionssystemThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfektionssystem, 10 μ L KitThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Konische sterile ZentrifugenröhrchenThermoFisher Scientific339651
OneTaq® Heißstart Quick-Load® 2X MasterMix New England BioLabs(M0489)für Vorlage mit hohem GC%
PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter, 10 bis 180 kDaThermoFisher Scientific26616
Pipettenspitze 0,1-20 Mikro; lEppendorf, o.ä0030 075.005
Pipettenspitze 2-200µ lEppendorf, o.ä0030 075.021
Pipettenspitze 50-1000µ lEppendorf, oder ähnlich0030 075.064
Plasmid Maxi KitQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104Aufreinigung von Plasmid aus Restriktionsaufschluss
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Rekombinanter Anti-ACE2-Antikörper [EPR4435(2)]Abcamab108252bei 1/1000 Verdünnung
RPMI 1640 MediumHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin SepharosekügelchenIBA Lifesciences2-1201-010
Penicillin-StreptomycinThermoFisher Scientific15140122
SYTOX&Handel; Rote Totzellenfärbung, für 633 oder 635 nm AnregungThermoFisher ScientificS34859
T4 DNA-LigaseNew England BioLabsM0202S
T4 PolynukleotidkinaseNew England BioLabsM0201S
Trypanblau-Lösung, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 %), mitPhenolrot ThermoFisher Scientific25200056
ZOE Fluorescent Cell ImagerBio-Rad
1,5 mL Mikroröhrchen, PCR-cleanEppendorf oder ähnlich0030 125.215
24 Well Clear TC-behandelte Multi-Well-PlattenCorning3524
96 Well Clear Flat Bottom Polystyrol TC-behandeltCorning3599
96-Well-Mikrotiterplatte mit klarem und rundem Boden TC-behandeltCorning3799
. .

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538(2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99(2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168(2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69(2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327(2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539(2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207(2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4(2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102(2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196(2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

CRISPR Cas9 Knock InMakrophagen ZelllinienRosa26 LocusElektroporationsprotokollfluoreszierende Reporterhomologe RekombinationDurchflusszytometrie

Verwandte Artikel