Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Lichen Zhang; Rong Huang; Liaoxun Lu; Rui Fu; Guo Guo; Yanrong Gu; Zhuangzhuang Liu; Le He; Marie Malissen; Yinming Liang

doi:10.3791/62328

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Methodenartikel

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

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DOI:

10.3791/62328

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13. November 2021

Lichen Zhang¹ , Rong Huang¹ , Liaoxun Lu¹ , Rui Fu¹ , Guo Guo¹ , Yanrong Gu¹ , Zhuangzhuang Liu¹ , Le He¹ , Marie Malissen² , Yinming Liang¹

¹The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, ²Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reporter und Zellsortierung, um Knock-in-Experimente in Makrophagen- und T-Zelllinien zu vereinfachen. Für diese vereinfachten Knock-in-Experimente werden zwei Plasmide verwendet, nämlich ein CRISPR/Cas9- und DsRed2-exprimierendes Plasmid und ein homologes Rekombinationsspenderplasmid, das EBFP2 exprimiert, das dauerhaft am Rosa26-Locus in Immunzellen integriert ist.

Zusammenfassung

Funktionelle Genomik-Studien des Immunsystems erfordern genetische Manipulationen, die sowohl die Deletion von Zielgenen als auch die Zugabe von Elementen zu interessierenden Proteinen beinhalten. Die Identifizierung von Genfunktionen in Zelllinienmodellen ist wichtig für die Genentdeckung und Erforschung zellintrinsischer Mechanismen. Genetische Manipulationen von Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagenzelllinien mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Knock-in sind jedoch aufgrund der geringen Transfektionseffizienz dieser Zellen, insbesondere in einem Ruhezustand, schwierig. Um Gene in Immunzellen zu modifizieren, werden typischerweise Arzneimittelresistenzselektion und virale Vektoren verwendet, um Zellen anzureichern, die das CRIPSR / Cas9-System exprimieren, was unweigerlich zu unerwünschten Eingriffen der Zellen führt. In einer früheren Studie haben wir duale fluoreszierende Reporter entwickelt, die mit CRISPR/Cas9 gekoppelt sind und nach der Elektroporation vorübergehend exprimiert wurden. Diese technische Lösung führt zu einer schnellen Genselöschung in Immunzellen; Das Einklopfen von Genen in Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagen ohne den Einsatz von Arzneimittelresistenzselektion oder viralen Vektoren ist jedoch noch schwieriger. In diesem Artikel zeigen wir, dass durch die Verwendung von Zellsortierung zur Unterstützung der Selektion von Zellen, die transient CRISPR/Cas9-Konstrukte exprimieren, die auf den Rosa26-Locus in Kombination mit einem Spenderplasmid abzielen, ein Gen-Knock-in sowohl in T-Zellen als auch in Makrophagen ohne Arzneimittelresistenzanreicherung erreicht werden kann. Als Beispiel zeigen wir, wie man menschliches ACE2, einen Rezeptor von SARS-Cov-2, der für die aktuelle Covid-19-Pandemie verantwortlich ist, in RAW264.7-Makrophagen durch Knock-in-Experimente exprimiert. Solche Gen-Knock-in-Zellen können häufig für mechanistische Studien verwendet werden.

Einleitung

Immunzellen sind entscheidend für die Abwehr von Krankheitserregern. Sowohl angeborene als auch adaptive Immunität sind für die Clearance von Infektiva und die Aufrechterhaltung der Gewebeöostase erforderlich¹^,². Zelllinienmodelle sind wesentliche Werkzeuge, um die molekularen Grundlagen des Immunsystems von Säugetieren zu verstehen. Sie werden in funktionellen In-vitro-Assays verwendet, z. B. bei der Modellierung der Aktivierung menschlicher T-Zellen und bei der Bestimmung der Funktion genetischer Faktoren bei der Aktivierung oder Dämpfung von Immunantworten³^,